本發(fā)明屬于植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
：，是一種以高粱幼穗誘導(dǎo)愈傷組織為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法。
背景技術(shù)：
：：甜高粱是籽實(shí)高粱的一個變種，它的生長過程中需水量較低，僅為玉米的1/3，并且耐貧瘠耐鹽堿，且畝產(chǎn)可達(dá)3～5噸糧食，同時它的莖稈中的汁液含有豐富的糖類，是制造酒精的理想生物質(zhì)原料。因此甜高粱是一種優(yōu)秀的生物新能源作物，值得我們大力去發(fā)展。但是甜高粱產(chǎn)業(yè)的發(fā)展與突破關(guān)鍵在于新種質(zhì)的選育與栽培。過去的幾十年傳統(tǒng)常規(guī)育種在甜高粱品質(zhì)改良，產(chǎn)量提高等方面已經(jīng)做了重要的貢獻(xiàn)，但由于高粱的遠(yuǎn)源不親和性，只靠傳統(tǒng)的常規(guī)育種方法難以取得重大突破，需要與遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)結(jié)合。利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)進(jìn)行高粱品種的遺傳改良早已引起廣泛的關(guān)注與研究。一個高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系最主要的是賴于高效的再生體系，但是，離體組織培養(yǎng)進(jìn)行高粱再生是一個公認(rèn)的比較困難的過程(ZhuH,MuthukrishnanS,KrishnaveniS,JeoungJ,LiangG(1998)Biolistictransformationofsorghumusingaricechitinasegene.J.Genet.Breed.52,243-252)，特別是對甜高粱組織培養(yǎng)的研究更少。大量的關(guān)于高粱遺傳轉(zhuǎn)化的研究也已經(jīng)進(jìn)行。電擊法是第一個成功地將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)入高粱原生質(zhì)體的方法(OU-LeeTM,TurgeonR,WuR(1986)Expressionofaforeigngenelinkedtoeitheraplant-virusoraDrosophilapromoter,afterelectroporationofprotoplastsofrice,wheat,andsorghumProc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83,6815-6819)。接著新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和β-葡萄糖醛酸酶基因通過電擊法被轉(zhuǎn)入高粱基因組，但沒有獲得轉(zhuǎn)化單株(BatrrawM,HallT(1991)StabletransformationofSorghumbicolorprotoplastswithchimericneomycinphosphotransfereaseIIandβ-glucuronidasegenes.Theor.Appl.Genet.82,161-168.)。Casas在1993年首次用粒子轟擊法獲得高粱轉(zhuǎn)基因植株，他以高粱栽培品種p898012的幼胚盾片作為外植體，獲得轉(zhuǎn)化R和C1玉米花青素調(diào)控基因的轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化效率達(dá)0.33％(CasasA,KononowiczA,ZehrU,TomesD,AxtellJ,ButlerL,BressanR,HasegawaP(1993)Transgenicsorghumplantsviamicroprojectilebombardment.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90,11212-11216.)。雖然電擊法和粒子轟擊法是將外源基因直接轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞，然而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法仍然是最主要的植物轉(zhuǎn)化方法，主要是因?yàn)檩^高的轉(zhuǎn)化效率以及較低的拷貝數(shù)或者單拷貝。但是高粱對體外組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化有拮抗作用，最近在高粱遺傳轉(zhuǎn)化的研究 中一直傾向于對再生體系和效率(JeoungJS,KrishnaveniS,MuthukrishnanH,GLT(2002)Optimizationofsorghumtransformationparametersusinggenesforgreenfluorescentproteinandβ-glucuronidaseasvisualmarkers.Hereditas137,20-28.；GirijashankarV,SwathisreeV(2009)GenetictransformationofSorghumbicolor.Physiol.Mol.Biol.Plants15,287-302.；RaghuwanshiA,BirchRG(2010)Genetictransformationofsweetsorghum.PlantCellRep.29,997-1005.；LiuG,GodwinID(2012)Highlyefficientsorghumtransformation.PlantCellRep.31,999-1007.)以及轉(zhuǎn)化程序和方法的優(yōu)化上(JiQ,XuX,WangK(2013)Genetictransformationofmajorcerealcrops.Int.J.Dev.Biol.57,495-508.；KumarT,HoweA,SatoS,DweikatI,ClementeT(2013)Sorghumtransformation:overviewandutility.PlantGenet.Genomics11,205-221.；HieiY,IshidaY,KomariT(2014)Progressofcerealtransformationtechnologymediatedby.Front.PlantSci.5,628-638.)。2000年，Zhao等首次用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了高粱轉(zhuǎn)基因植株；利用p898012及PH1391兩個基因型的幼胚作為外植體，BAR基因作為篩選標(biāo)記，通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分、共培養(yǎng)條件以及篩選培養(yǎng)基的繼代頻率等，使得轉(zhuǎn)化效率達(dá)到2.12％(ZhaoZY,CaiTS,TaglianiL,MillerM,WangN,PangH,RudertM,SherylSchroeder,HondredD,SeltzerJ,PierceD(2000)Agrobacterium-mediatedsorghumtransformation.PlantMol.Biol.44,789-798.)。隨后很多研究人員開始著手農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱轉(zhuǎn)化體系的研究工作(JeoungJS,KrishnaveniS,MuthukrishnanH,GLT(2002)Optimizationofsorghumtransformationparametersusinggenesforgreenfluorescentproteinandβ-glucuronidaseasvisualmarkers.Hereditas137,20-28.；CarvalhoCHS,ZehrUB,GunaratnaN,AndersonJ,KononowiczHH,HodgesTK,AxtellJD(2004)Agrobacterium-mediatedtransformationofsorghum:factorthataffecttransformationefficiency.Genet.Mol.Biol.27,259-269.；GaoZ,JayarajJ,MuthukrishnanS,ClaflinL,LiangGH(2005)EfficientgenetictransformationofSorghumusingavisualscreeningmarker.Genome48,321-333.GurelS,GurelE,KaurR,WongJ,MengL,TanHQ,LemauxPG(2009)Efficient,reproducibleAgrobacterium-mediatedtransformationofsorghumusingheattreatmentofimmatureembryos.PlantCellRep.28,429-444.WuE,LendertsB,GlassmanK,KaniewskaMB,ChristensenH,AsmusT,ZhenS,ChuU,ChoMJ,ZhaoZY(2013)OptimizedAgrobacterium-mediatedsorghumtransformationprotocolandmoleculardataoftransgenicsorghumplants.InVitroCell.Dev.Biol.:Plant50,9-18.)，轉(zhuǎn)化效率也在不斷提高，但高粱遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)相較于玉米、水稻等作物還不是很成熟，存在轉(zhuǎn)化效率低，基因型依賴嚴(yán)重等問題；特別是對甜高粱遺傳轉(zhuǎn)化的研究，只有Raghuwanshi等用基因槍法轉(zhuǎn)化甜高粱品種Ramada 獲得成功，但轉(zhuǎn)化效率只有0.09％(RaghuwanshiandBirch2010)。因此本研究的目的是建立一個高效的適宜甜高粱和籽實(shí)高粱的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為高粱基因組學(xué)研究以及新品種培育等打下基礎(chǔ)，將優(yōu)良的農(nóng)藝學(xué)性狀通過生物技術(shù)手段引入高粱是非常重要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：因此本發(fā)明的目的是建立一個適應(yīng)性廣，對多數(shù)基因型效率高的甜高粱和籽實(shí)高粱(特別是甜高粱品種)再生體系；同時在這個基礎(chǔ)上建立一個效率較高的甜高粱和籽實(shí)高粱遺傳轉(zhuǎn)化體系。本發(fā)明提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的以甜高粱和籽實(shí)高粱幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織作為外植體的遺傳轉(zhuǎn)化方法，用于高粱新基因功能的研究以及新品種的培育。一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甜高粱和籽實(shí)高粱的遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括如下順序步驟：1)選取幼穗，旗葉期長約1.5～5cm幼穗；2)將幼穗置于誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基CIM：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L，高壓滅菌前pH6.0；3)將幼穗誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)?，所述農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)基為IM：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+MES600mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS200μmol/L，pH5.2；4)外植體置于共培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)基COM：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.43g/L+MES600mg/L+半胱氨酸0.3g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+瓊脂8g/L+AS200μmol/L，高壓滅菌前pH5.6；5)再轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行梯度篩選培養(yǎng)，所述篩選培養(yǎng)基為：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素200mg/L+草丁膦3～5mg/L+瓊脂8g/L，高壓滅菌前pH6.0，其中草丁膦的濃度為3和5mg/L梯度篩選；6)將存活的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至出苗，所述分化培養(yǎng)基為：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素100mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂8g/L，高壓滅菌前pH6.0；7)將苗移入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)出根，所述生根培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+羧芐青霉素50～80mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂5g/L，高壓滅菌前pH6.0；8)轉(zhuǎn)移至土壤中(營養(yǎng)土：蛭石＝2:1)中培養(yǎng)1～2周后移栽至溫室花盆或大田。所述幼穗長度為2～5cm(此時植株外部形態(tài)，旗葉5～10cm，旗下一葉20cm左右)，切成3段左右。所述步驟3)導(dǎo)入為將愈傷浸泡于含有攜帶外源基因的植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌EHA105菌液中10分鐘。所述共培養(yǎng)為在20～22℃下暗培養(yǎng)3～5天。所述篩選培養(yǎng)的方法為先在無篩選壓的篩選培養(yǎng)基上避光恢復(fù)培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)入篩選劑濃度為3mg/L的篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行兩周低壓篩選，再轉(zhuǎn)入篩選劑濃度為5mg/L的篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行兩周篩選。所述分化培養(yǎng)基中的培養(yǎng)條件為：在周期為16小時光照與8小時黑暗循環(huán)于22～25℃條件下培養(yǎng)，每兩周繼代培養(yǎng)一次。所述步驟7)移入之前，高粱植株苗為3～4cm高，所述步驟8)轉(zhuǎn)移之前，高粱植株壯根數(shù)3～5根，根長3cm。所述外源基因?yàn)镚US和GFP。所述甜高粱品種Keller，籽實(shí)高粱品種為JR105。本發(fā)明通過對誘導(dǎo)愈傷階段培養(yǎng)基成分、分化階段植物激素配比、不同基因型等因素對高粱組織培養(yǎng)的影響的研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加2,4-D2.0mg/L和CuSO4·5H2O0.25mg/L對于幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)具有重要的作用，可以大幅度提高誘愈率；高粱再生培養(yǎng)基中最好的激素組合為1.0mg/LIAA+1.0mg/L6-BA，Keller和Mn-3025的再生效率達(dá)80％以上，說明這個激素組合在高粱離體再生方面非常適合；同時我們發(fā)現(xiàn)25個測試品種全部都能產(chǎn)生愈傷，并且有23個基因型再生出苗。其中以甜高粱品種Mn-3025和Keller以及籽實(shí)高粱品種871300和JR105愈傷誘導(dǎo)以及再生總體情況較好。本發(fā)明建立了適宜甜高粱和籽實(shí)高粱再生體系，以此再生體系為基礎(chǔ)，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱遺傳轉(zhuǎn)化體系，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功的將外源基因GUS和GFP轉(zhuǎn)化幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織，得到轉(zhuǎn)基因再生植株，經(jīng)檢測表明，外源基因在不同的基因型中得到了不同程度的表達(dá)，說明本發(fā)明的再生體系可用于遺傳轉(zhuǎn)化。Keller遺傳轉(zhuǎn)化效率在3～7％之間，Mn-3025的轉(zhuǎn)化效率在8～20％之間，JR105的轉(zhuǎn)化效率在7～16％之間。本發(fā)明利用高梁幼穗為外植體在適當(dāng)?shù)脑偕囵B(yǎng)基上，能得到較高的愈傷組織誘導(dǎo)率和 再生效率。但是，不同基因型來源的愈傷組織的胚性狀況及再生能力差別較大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明幼穗是建立高粱再生體系比較理想的一種外植體，可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化研究。本發(fā)明通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，建立了一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)的適宜甜高粱和籽實(shí)高粱的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為今后高粱新基因的功能研究以及培育高粱新品種奠定了基礎(chǔ)。附圖說明：圖1不同種植環(huán)境對幼胚誘導(dǎo)愈傷效果的影響圖中不同處理為每年7月初在大田或溫室取3～5株植株的幼胚，混合后隨機(jī)選取30枚進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。小寫字母a、b和c表示在0.05水平上差異顯著。圖2不同生長調(diào)節(jié)劑及不同培養(yǎng)基添加劑對Keller幼穗誘導(dǎo)愈傷的影響A，表2中各組合誘導(dǎo)愈傷情況；a：組合1、6、7；b：組合2；c：組合3；d：組合4、5，標(biāo)尺＝1厘米。B，不同狀態(tài)愈傷組織的細(xì)胞狀態(tài)；a，c：圖A-a中箭頭所指胚性愈傷組織的細(xì)胞狀態(tài)，b，d：A-d中箭頭所指褐化，水漬化愈傷的細(xì)胞狀態(tài)；a，b是愈傷邊緣成熟細(xì)胞，c，d是愈傷組織內(nèi)部整體結(jié)構(gòu)，標(biāo)尺＝50微米。圖3不同生長調(diào)節(jié)劑及不同培養(yǎng)基添加劑誘導(dǎo)出愈傷后對再生情況的影響X軸數(shù)字1～7對應(yīng)于表1-2中7個組合。小寫字母a、b、c和d表示在0.05水平上差異顯著。圖4不同生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)愈傷后再生情況1～3：利用2,4-D作為生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的愈傷再生苗的情況；4～6：利用Dic作為生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)的愈傷再生苗的情況。標(biāo)尺＝1厘米。圖5不同生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)愈傷后再生苗單株高及株重差異每個處理取5株幼苗測量總重及株高，取其平均值，重復(fù)3次。小寫字母a、b和大寫字母A、B分別表示在0.05水平以及0.01水平上差異顯著性。圖6分化培養(yǎng)基中不同激素組合對三品種再生的影響同一品種內(nèi)不同處理進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)；小寫字母a、b和c表示在0.05水平上差異顯著。圖7分化培養(yǎng)基中不同PVP40濃度對Keller愈傷再生的影響A為再生培養(yǎng)皿底部圖，B為愈傷再生過程中褐化情況圖。a，未添加PVP40；b，添加1g/LPVP40；c，添加3g/LPVP40；d，添加5g/LPVP40；e，添加1g/LPVP40；f，添加10g/LPVP40。標(biāo)尺＝1厘米。圖8分化培養(yǎng)基中不同PVP40濃度對Keller愈傷再生效率的影響小寫字母a和b表示不同處理在0.05水平上差異顯著。圖9不同基因型愈傷在繼代培養(yǎng)基上不同的時間對再生效率的影響每個處理各選取同一時間誘導(dǎo)的愈傷組織10～15枚用于再生實(shí)驗(yàn)，計算再生效率；每個處理重復(fù)三次。大寫字母A、B和C表示在0.01水平上極顯著差異。圖10pCambia3300-GUS/GFP雙元載體T-DNA區(qū)結(jié)構(gòu)示意圖圖11農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱遺傳轉(zhuǎn)化程序圖12轉(zhuǎn)基因植株bar基因PCR檢測A，部分T0和T1代轉(zhuǎn)基因植株bar基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；T0：M，markerIV；CK-，未轉(zhuǎn)化植株；CK+，質(zhì)粒；1～12，部分T0代轉(zhuǎn)化單株。T1：M，marker100；CK-，未轉(zhuǎn)化植株；CK+，質(zhì)粒；1～12，部分T1代轉(zhuǎn)化單株。B，部分T0代轉(zhuǎn)基因植株bar基因RT-PCR分析；M，markerIV；CK-，未轉(zhuǎn)化植株；CK+，質(zhì)粒；1～8，部分T0代轉(zhuǎn)化單株cDNAPCR擴(kuò)增結(jié)果。bar(箭頭所示)：bar基因的擴(kuò)增；actin(箭頭所示)：actin基因擴(kuò)增。圖13部分T0代單株bar試紙條檢測，1：陰性對照；2～6：T0陽性植株；箭頭所示檢測線為bar蛋白表達(dá)檢測線。圖14轉(zhuǎn)基因陽性愈傷和植株的GUS染色及GFP綠色熒光觀察A：轉(zhuǎn)基因陽性愈傷、植株GUS染色情況；標(biāo)尺＝1毫米；B：轉(zhuǎn)基因陽性愈傷開始到出芽GFP表達(dá)情況。B-a箭頭所指為剛剛進(jìn)入篩選階段的陽性愈傷，B-b箭頭所指為篩選過程中陽性愈傷生長變大，B-c箭頭所指為馬上要分化出芽的陽性愈傷。標(biāo)尺＝100微米。圖15T0代陽性苗3mg/L草銨膦篩選及抗性苗葉片涂抹Basta實(shí)驗(yàn)a：陽性植株，植株綠色(綠色箭頭)；陰性苗，褐化枯死(紅色箭頭)。b：1：未轉(zhuǎn)化單株涂抹H2O；6-7：未轉(zhuǎn)化單株涂抹basta；2-5：轉(zhuǎn)化單株涂抹basta。標(biāo)尺＝1厘米。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下面所涉及的不同基因型的高粱均表明來源了，公眾可以從申請人的實(shí)驗(yàn)室免費(fèi)得到高粱品種和載體。實(shí)施例1以甜高粱和籽實(shí)高粱幼穗組織為外植體的再生體系的建立1.1幼穗取樣標(biāo)準(zhǔn)確立利用幼胚作為外植體時的取樣標(biāo)準(zhǔn)一般是取授粉后9～12天的幼胚，取材前先取2～3個幼胚觀察大小，選取大小在1～2mm之間的幼胚。但幼穗被葉片包被，長度不易觀察，所以適合長度的幼穗所對應(yīng)的植株外部形態(tài)就顯得尤為重要。由表1結(jié)果顯示：當(dāng)旗葉露出長度小于10cm，且旗下一葉長度在8～25cm之間時，Keller和JR105的幼穗長度在1.5～5cm，大小合適；旗葉露出長度為5～15cm，旗下一葉長度為20～30cm時，Ji2731的幼穗長度為1.5～5cm，大小合適。結(jié)合三個品種的取樣標(biāo)準(zhǔn)我們發(fā)現(xiàn)在旗葉5～10cm，旗下一葉20cm左右時幾個品種所取幼穗大小均合適，因此，所有利用幼穗作為外植體的基因型取樣時均可參考此標(biāo)準(zhǔn)。表1不同基因型高粱幼穗取樣標(biāo)準(zhǔn)1.2幼穗材料選擇與準(zhǔn)備本發(fā)明取旗葉剛剛露出時約2～5cm的幼穗，用70％酒精進(jìn)行表面消毒30s～1min，25％的NaClO3(有效Cl-濃度8％)溶液滅菌20min，超凈臺中無菌水沖洗多次；用一只鑷子固定住幼穗莖稈基部，用3#刀柄(23#)刀片將莖稈從中間剖開，用鑷子將幼穗輕輕取出；在誘導(dǎo)培養(yǎng)基CIM上用刀切成大小幾小段[MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)]置于22～25℃暗培養(yǎng)3～4周，使之開始脫分化，形成愈傷組織；之后選擇生長迅速、質(zhì)地松脆、顏色鮮亮的愈傷組織繼代培養(yǎng)[誘導(dǎo)培養(yǎng)基+2,4-D1mg/L]，每兩周繼代一次。挑選生長狀態(tài)良好的愈傷組織接于分化培養(yǎng)基[MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)]上22～25℃光培養(yǎng)2～3周，當(dāng)苗高3～4cm時將再生出的苗移入生根培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基(大量+微量+有機(jī)物，其中大量元素減半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂5g/L，pH6.0(高壓滅菌前)]中，當(dāng)長出根時(壯根數(shù)3～5根，長約3cm)，洗去培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至土壤中(營養(yǎng)土：蛭石＝2:1)培養(yǎng)1～2周后移栽至溫室花盆或大田。1.3不同種植環(huán)境對幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的影響本研究以甜高粱品種Mn-3025為實(shí)驗(yàn)材料，統(tǒng)計了2013和2014兩年在溫室和大田種植條件下幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的情況。如圖1所示，在溫室種植條件下，2013年和2014年Mn-3025幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的效率都高達(dá)90％以上，而大田種植條件下，2013和2014年Mn-3025幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的效率分別為50％和40％。此結(jié)果與Zhao等的研究結(jié)果相矛盾，但符合Kosambo-Ayoo 等人的觀點(diǎn)，在人工控制的溫室環(huán)境中，水肥條件好，病蟲害脅迫少，供體材料生長狀況好，因此愈傷的誘導(dǎo)效率更高更穩(wěn)定。1.4不同生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)基添加物對幼穗誘導(dǎo)愈傷組織及愈傷組織再生能力的影響為提高愈傷組織誘導(dǎo)及分化出苗的效率，采用了多種組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。用2mg/L2,4-D可誘導(dǎo)90％以上幼穗產(chǎn)生愈傷組織(表2組合1，圖2A-a)，用Dic可誘導(dǎo)50％幼穗產(chǎn)生愈傷組織(表2組合4和5，圖2A-d)；培養(yǎng)基中不添加Cu2+離子時，所得愈傷組織有水漬化等現(xiàn)象(表2組合2，圖2A-b)，添加AgNO3則對愈傷組織誘導(dǎo)無明顯作用(表2組合6和7，圖2A-a)。因此本研究中誘導(dǎo)愈傷組織最佳組合是2mg/L2,4-D+1μMCu2+(表2組合1，圖2A-a)。不同狀態(tài)愈傷組織(圖2中A-a和A-d黑色箭頭所指)細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)如圖2B所示，其中B-a、c(A-a黑色箭頭所指)為胚性愈傷組織，細(xì)胞呈橢圓形，大而飽滿，細(xì)胞間排列緊密有序；其中B-b、d(A-d黑色箭頭所指)為水漬化或褐化愈傷組織，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間連接消失，與周圍細(xì)胞脫離。表2不同生長調(diào)節(jié)劑及培養(yǎng)基添加物對Keller幼穗誘導(dǎo)愈傷的影響將不同組合誘導(dǎo)的胚性愈傷移至分化培養(yǎng)基上，研究其再生效率間的差異，統(tǒng)計結(jié)果如圖3所示，可以看出用Dic作為生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)出的愈傷組織再生效率非常高，與2mg/L2,4-D(添加Cu2+)相比無顯著差異，甚至還略高于2mg/L2,4-D(添加Cu2+)；而添加AgNO3誘導(dǎo)的愈傷組織再生效率反而顯著低于不添加AgNO3時的情況。同時發(fā)現(xiàn)用Dic誘導(dǎo)的愈傷組織產(chǎn)生的再生苗要比用2,4-D(添加Cu2+)誘導(dǎo)的愈傷組織產(chǎn)生的再生苗生長情況好(圖4)。通過測量其單株重和單株高發(fā)現(xiàn)利用Dic作為生長調(diào)節(jié)劑的再生苗單株重極顯著高于利用2,4-D (添加Cu2+)的情況，單株高也顯著高于2,4-D(添加Cu2+)的情況(圖5)。因此，本研究中誘導(dǎo)愈傷組織最佳組合是2mg/L2,4-D+1μMCu2+；Dic雖不利于愈傷組織誘導(dǎo)，但其誘導(dǎo)的愈傷組織再生壯苗情況遠(yuǎn)優(yōu)于2,4-D，考慮愈傷組織誘導(dǎo)階段可將2,4-D和Dic結(jié)合使用；AgNO3雖未抑制愈傷組織誘導(dǎo)，但抑制愈傷組織再生出苗，所以誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不添加AgNO3。1.5不同激素組合對愈傷再生效率的影響在不同的激素處理?xiàng)l件下，對不同高粱品種愈傷組織再分化出苗效率進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如圖6所示，JR105：組合1和4要顯著高于組合2和3；Ji2731：組合1、2及4間差異不顯著，但均顯著高于組合3；Keller：組合1顯著高于組合2、3及4。綜合以上結(jié)果：分化培養(yǎng)基添加1mg/LIAA和1mg/L6-BA更適合測試基因型Keller、JR105及Ji2731分化出苗，其中Keller和JR105分化出苗效率達(dá)80％。1.6PVP40對愈傷組織再生效率的影響本研究通過在分化培養(yǎng)基中添加0、1、3、5、8及10g/L不同濃度的PVP40，研究其對愈傷組織再生效率的影響。結(jié)果如下：分化培養(yǎng)基中添加PVP40并不能降低愈傷組織在分化過程中的褐化情況，相反，與未添加PVP40的培養(yǎng)基比較，添加了PVP40的培養(yǎng)基在一定程度上反而加劇了愈傷組織的褐化，并且隨著添加PVP40濃度的升高褐化情況加重(圖7)。通過對愈傷組織再生效率的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),相比較未添加PVP40時，添加較低濃度的PVP40(1g/L)再生效率反而顯著提高，隨著濃度的增加，愈傷的再生率開始降低(圖8)。綜上，再生過程中PVP40可能并不能抑制愈傷褐化，但低濃度PVP40的添加可促進(jìn)愈傷的再生。至于PVP40影響再生的機(jī)理還不清楚，需要我們更深入的研究。1.7繼代次數(shù)對Keller和JR105愈傷組織再生效率的影響我們對Keller和JR105兩個基因型愈傷組織繼代次數(shù)對再生效率的影響進(jìn)行了研究，試驗(yàn)設(shè)置每兩周繼代一次，分別繼代2次、6次和10次。發(fā)現(xiàn)這兩個品種的愈傷組織繼代2次的時候再生效率最高，JR105達(dá)90％以上，Keller也在85％以上；但愈傷組織繼代6次后，在0.01水平上，JR105的再生效率極顯著下降，僅為12％，Keller的再生效率下降不顯著，達(dá)80％；當(dāng)愈傷組織繼代10次后，JR105再生效率幾乎為0，Keller的再生效率仍有70％左右(如圖9)。因此Keller愈傷組織可通過多次繼代來保存，為高粱遺傳轉(zhuǎn)化提供充足的外植體，在一定程度上克服了高粱遺傳轉(zhuǎn)化受季節(jié)因素的影響。每個處理各選取同一時間誘導(dǎo)的愈傷組織10～15枚用于再生實(shí)驗(yàn)，計算再生效率；每個處理重復(fù)三次。大寫字母A、B和C表示在0.01水平上極顯著差異。1.8不同基因型高粱再生效率分析為驗(yàn)證優(yōu)化的再生體系的可行性，同時為提供遺傳轉(zhuǎn)化候選基因型，我們進(jìn)行了高粱不同基因型的再生實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)選擇20個甜高粱品種和5個籽實(shí)高粱品種為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)果如表1-3所示，25個品種均能產(chǎn)生愈傷組織；除E-Tian和2011這兩個品種，有23個品種可再生出苗；甜高粱品種Mn-3025和Keller，籽實(shí)高粱品種871300和JR105誘導(dǎo)愈傷組織和再分化效率均達(dá)到80％以上(表3)。結(jié)論：本發(fā)明通過對不同生長調(diào)節(jié)劑及不同培養(yǎng)基添加劑、分化階段植物激素配比、和不同基因型等因素對高粱組織培養(yǎng)的影響比較發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)愈傷組織最佳的組合是2mg/L的2,4-D加1μM的Cu2+；如果利用Dic代替2,4-D作為生長調(diào)節(jié)劑，在誘導(dǎo)愈傷方面Dic的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及2,4-D，但是其誘導(dǎo)的愈傷的再生效率卻好于2,4-D；在產(chǎn)生壯苗方面，用Dic誘導(dǎo)的愈傷出苗后平均單株重以及單株高都要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于用2,4-D誘導(dǎo)的愈傷，原因可能是愈傷中高濃度的2,4-D可能會影響甚至抑制細(xì)胞的再分化。在愈傷再生過程中我們發(fā)現(xiàn)1mg/L6-BA+1mg/LIAA的激素組合對誘導(dǎo)愈傷再生出苗效果最好，25個測試品種中只有兩個沒有再生出苗，并且有13個品種再生效率在80％以上，說明這個激素組合在高粱離體再生方面非常適合。隨機(jī)選擇了20個甜高粱品種和5個籽實(shí)高粱品種對優(yōu)化了的再生體系進(jìn)行了驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)25個測試品種全部都能產(chǎn)生愈傷，并且有23個基因型再生出苗。其中以甜高粱品種Mn-3025和Keller以及籽實(shí)高粱品種871300和JR105愈傷誘導(dǎo)以及再生總體情況較好。本發(fā)明建立了以甜高粱和籽實(shí)高粱幼穗愈傷組織為外植體的再生體系：其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)；繼代培養(yǎng)基為：誘導(dǎo)培養(yǎng)基+2,4-D1mg/L；分化培養(yǎng)基為：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)；生根培養(yǎng)基為：MS培養(yǎng)基(大量+微量+有機(jī)物，其中大量元素減半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+瓊脂5g/L，pH6.0(高壓滅菌前)。表3不同基因型高粱誘導(dǎo)愈傷及出苗情況統(tǒng)計注：a：褐化致死實(shí)施例2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的適宜甜高粱和籽實(shí)高粱的遺傳轉(zhuǎn)化方法2.1農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用培養(yǎng)基：農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)基IM：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+水解酪 蛋白500mg/L+MES600mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS200μmol/L，pH5.2。共培養(yǎng)基培養(yǎng)基COM：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+MES600mg/L+半胱氨酸0.3g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+2,4-D2mg/L+PVP405g/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+瓊脂8g/L+AS200μmol/L，pH5.6(高壓滅菌前)；篩選培養(yǎng)基SM：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺1g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP5g/L+抗壞血酸10mg/L+2,4-D2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素200mg/L+草丁膦3～5mg/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)其中，草丁膦的濃度為3和5mg/L梯度篩選；分化培養(yǎng)基RM：MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(大量元素+微量元素+有機(jī)物)4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天門冬酰胺0.15g/L+CuSO4·5H2O0.25mg/L+MES500mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+6-BA1mg/L+IAA1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧芐青霉素100mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂8g/LpH6.0(高壓滅菌前)；生根培養(yǎng)基RT：MS培養(yǎng)基(大量+微量+有機(jī)物，其中大量元素減半)+水解酪蛋白250mg/L+MES250mg/L+IBA1.5mg/L+PVP1g/L+抗壞血酸10mg/L+蔗糖15g/L+羧芐青霉素50～80mg/L+草丁膦3mg/L+瓊脂5g/L，pH6.0(高壓滅菌前)。2.2轉(zhuǎn)化方法：將含p3300質(zhì)粒(攜帶有GUS/GFP基因的雙元植物表達(dá)載體，見圖10；申請人的實(shí)驗(yàn)室保存，可以免費(fèi)對外發(fā)放)的農(nóng)桿菌在YEB固體培養(yǎng)基(含50mg/L利福平rif+50mg/L卡那霉素Kan)上劃線，28℃下暗培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落；挑取單菌落接種于5mLYEB液體培養(yǎng)基(含50mg/Lrif+50mg/LKan)中振蕩培養(yǎng)(28℃、200rpm)過夜；將培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到10mL新鮮YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)(28℃、200rpm)約4～6h；4℃、4000rpm離心6min收集菌體，并用IM培養(yǎng)基將菌體懸浮，用于甜高梁幼穗愈傷組織的農(nóng)桿菌侵染。選取長勢良好的胚性愈傷組織在上述農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡10min；棄菌液，用無菌濾紙吸去幼穗愈傷組織塊表面多余菌液，接種于共培養(yǎng)基上20～22℃暗培養(yǎng)3～5d；將幼穗愈傷組織塊轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(篩選壓為0的SM培養(yǎng)基)上避光恢復(fù)1周后轉(zhuǎn)移至SM培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)。先在低濃度草丁膦(3mg/L)的篩選培養(yǎng)基SM1篩選兩周，然后將幼穗愈傷組織塊轉(zhuǎn)入含有濃度為5mg/L草丁膦膦的篩選培養(yǎng)基SM2上篩選兩周。將存活的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)接于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)(22～25℃、16h光照/8h黑暗)，每隔2周繼代培養(yǎng)一次，直至有不 定芽出現(xiàn)；待不定芽成苗，苗長3～4cm時，將其轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根；如有不定根出現(xiàn)，待長出3～5根壯根且根長3cm左右時，轉(zhuǎn)移到蛭石培養(yǎng)基上過渡培養(yǎng)1～2周，移栽溫室或大田(圖11)。2.3轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測為驗(yàn)證bar基因是否已轉(zhuǎn)入高粱基因組中，對T0和T1代轉(zhuǎn)化單株基因組用特異性引物barF(5’-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3’)和barR(5’-GCTGCCAGAAACCCACGTCAT-3’)擴(kuò)增bar基因，目的片段大小為433bp，同時對部分T0代單株進(jìn)行RT-PCR檢測分析。如圖12A所示T0：1～3、4～6、7～9及10～12分別來自于4塊抗性愈傷分化的所出苗，我們可以看出這4塊愈傷組織均有陽性苗產(chǎn)生，但同一愈傷組織產(chǎn)生的苗并不都是陽性植株。主要原因可能是愈傷組織中抗性細(xì)胞對周圍細(xì)胞產(chǎn)生了保護(hù)作用，未被篩選劑殺死而分化出苗；圖12B所示bar基因在T0代單株中已開始轉(zhuǎn)錄；綜上所述，bar基因初步檢測已經(jīng)整合到高粱基因組，還需要其它實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。2.4T0代轉(zhuǎn)基因植株蛋白水平的檢測利用bar檢測試紙條對轉(zhuǎn)基因單株bar蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測，如圖13所示，箭頭所指檢測線為bar蛋白表達(dá)檢測線；bar蛋白若有表達(dá)，則有條帶出現(xiàn)，bar蛋白若未表達(dá)則無條帶出現(xiàn)；由此圖可以清晰的觀察到與1號陰性對照相比，2～6號陽性單株均有bar蛋白表達(dá)。2.5不同基因型轉(zhuǎn)化效率統(tǒng)計通過對T0代轉(zhuǎn)化單株基因組進(jìn)行bar基因PCR檢測(重復(fù)3次)及bar蛋白試紙條檢測，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果如表4所示，籽實(shí)高粱品種JR105利用愈傷組織作為外植體，轉(zhuǎn)化效率在10％左右，最高達(dá)到16％；甜高粱品種Keller利用愈傷組織作為外植體，轉(zhuǎn)化效率在3％～7％之間；甜高粱品種Mn-3025利用幼胚作為外植體，轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定在10％左右，最高達(dá)到20％，而籽實(shí)高粱品種871300轉(zhuǎn)化效率較低(低于1％)。表4不同高粱品種轉(zhuǎn)化效率統(tǒng)計注：上述質(zhì)粒都為公開質(zhì)粒，本申請人的實(shí)驗(yàn)室均有保藏，可以對外公開發(fā)放。2.6T0代轉(zhuǎn)基因植株自交后代分離比通過對bar基因進(jìn)行PCR檢測以及bar試紙條檢測，我們統(tǒng)計了11個T0代單株自交后代的分離比。如表5所示，有部分T0代單株自交后代陽性株與陰性株的比值小于3:1(1個拷貝)，不符合孟德爾遺傳定律，說明這些T0代陽性株可能存在嵌合體的問題。為驗(yàn)證是否有嵌合體的原因我們選擇了5個T0代轉(zhuǎn)化單株進(jìn)行不同葉片的PCR檢測，由表6可以看出T0代d、f、i單株不是所有葉片都呈PCR檢測陽性，所以這3個單株應(yīng)該存在嵌合體問題；雖然KC所有葉片PCR檢測陽性，但其T1代分離比為2:3，小于孟德爾遺傳定律3:1分離比，由于未進(jìn)行細(xì)胞水平檢測，不能肯定它不存在嵌合體的問題；Kp24所有葉片PCR檢測陽性，其自交后代分離比符合孟德爾遺傳定律3:1分離比例，所以Kp24轉(zhuǎn)化bar基因的拷貝數(shù)應(yīng)是1。表5T0代自交后代分離比的統(tǒng)計注：a：不符合孟德爾遺傳定律；b：T0代為純合體。表65株T0代單株不同葉片PCR檢測結(jié)果注：+，葉片PCR檢測陽性；-，葉片PCR檢測陰性。2.7T0代GUS染色及GFP綠色熒光檢測對T0代陽性愈傷和單株進(jìn)行GUS染色，結(jié)果如圖14A所示，A-a陽性愈傷組織染成藍(lán)色；A-b,c陽性植株根部和葉鞘染成藍(lán)色。對T0代陽性愈傷組織GFP綠色熒光表達(dá)情況進(jìn)行觀察如圖14B所示，B-a為愈傷組織轉(zhuǎn)化GFP基因后剛剛進(jìn)入篩選階段綠色熒光表達(dá)情況，此時綠色熒光點(diǎn)比較小，如箭頭所示；B-b為經(jīng)篩選后陽性愈傷組織生長變大，如箭頭所示；B-c為愈傷組織剛開始分化出芽時GFP基因表達(dá)情況觀察，箭頭所示為芽點(diǎn)位置。由此可以看出GUS基因和GFP基因都已經(jīng)轉(zhuǎn)入高粱基因組中，并開始表達(dá)。2.8T0代單株抗除草劑檢測T0代單株生根階段用3mg/L草銨膦進(jìn)行篩選，如圖15a所示，陽性植株經(jīng)篩選后仍能生根，植株綠色(綠色箭頭)；陰性苗經(jīng)篩選后褐化枯死(紅色箭頭)。T0代單株抗除草劑涂抹實(shí)驗(yàn)：用100mg/LBasta涂抹4～5葉期抗性苗從上往下數(shù)第二片葉中部約1cm長；7天后觀察葉片受損情況，如圖15b所示，未轉(zhuǎn)化單株6、7經(jīng)basta涂抹后7天葉片已經(jīng)全部褐化枯死，而2～5轉(zhuǎn)化陽性株葉片經(jīng)basta涂抹7天后，表現(xiàn)出不同的抗性，其中如3、4號所示葉片僅有所發(fā)黃，特別是4號抗性較好，5號葉片邊緣稍有損傷，2號損傷情況最嚴(yán)重，但也遠(yuǎn)好于6、7號對照組。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3