本發(fā)明屬于菊花栽培技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用RNAi載體調(diào)節(jié)菊花開(kāi)花時(shí)間的方法。

背景技術(shù)：

菊花是一種比較常見(jiàn)的觀賞花卉，具有花色多樣、花型各異以及花期長(zhǎng)等特點(diǎn)，是花卉產(chǎn)業(yè)中極具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的花卉品種。栽培過(guò)程中，由于各地大型節(jié)假日活動(dòng)的繁盛、菊花節(jié)的開(kāi)展，為適應(yīng)不同地域、不同時(shí)間段花展布置的需要，亟需培育一些能夠在節(jié)假日期間開(kāi)花的中花品種、晚花品種等早花系菊花。因此，對(duì)于菊花花期進(jìn)行調(diào)控具有十分重要的應(yīng)用意義。

植物從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化過(guò)程稱為“成花轉(zhuǎn)變”，這個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵是成花誘導(dǎo)。植物成花誘導(dǎo)過(guò)程由自身遺傳物質(zhì)和外界環(huán)境因素兩方面決定。外界環(huán)境的調(diào)控途徑有很多，傳統(tǒng)菊花花期調(diào)控技術(shù)中主要是利用菊花花芽分化對(duì)光照時(shí)間和強(qiáng)度的要求，通過(guò)遮光或補(bǔ)光處理，人為制造短日照環(huán)境，促使菊花提前開(kāi)花；此外，人們也會(huì)根據(jù)栽培經(jīng)驗(yàn)計(jì)算好播種、扦插、修剪、打頂?shù)臅r(shí)間，利用摘心、修剪、摘蕾、剝芽摘葉、環(huán)割等措施達(dá)到花期調(diào)控的目的。這兩種方法都需要經(jīng)驗(yàn)豐富的專業(yè)技術(shù)人才，過(guò)程繁瑣，而且每年都要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行處理，極大的損耗人力資源。

中國(guó)專利CN200810049322公開(kāi)了一種調(diào)控菊花花期的方法，該方法用5-氮雜胞嘧啶核苷處理菊花組織培養(yǎng)的試管苗，然后移栽，使菊花提前開(kāi)花。但是這種處理方式仍然容易受具體生長(zhǎng)環(huán)境、栽培條件等方式制約，容易發(fā)生逆轉(zhuǎn)，存在效果不夠穩(wěn)定缺陷，加上這種處理方式并不能形成能夠穩(wěn)定遺傳的菊花品種，每年均需處理，因而生產(chǎn)中應(yīng)用較為有限。因此，培育新的能能夠提前開(kāi)花的菊花品系仍然是現(xiàn)有菊花培育中的重點(diǎn)工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種利用RNAi干涉技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)菊花開(kāi)放時(shí)間的方法，該方法通過(guò)構(gòu)建特定的RNAi載體，利用所構(gòu)建的特定RNAi載體來(lái)調(diào)節(jié)菊花組織體內(nèi)MET1基因表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)菊花的提前開(kāi)放。

本申請(qǐng)的技術(shù)方案詳述如下。

一種利用RNAi載體調(diào)節(jié)菊花開(kāi)花時(shí)間的方法，該方法包括如下步驟：

（1）根據(jù)菊花DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1基因的全長(zhǎng)cDNA序列中的保守序列，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，具體為：

參考《菊花與青蒿MET1基因克隆及菊花RNAi載體構(gòu)建》（施冬青，2014年河南大學(xué)碩士論文）中方法，利用3’和5’RACE技術(shù)獲得菊花甲基轉(zhuǎn)移酶MET1基因全長(zhǎng)cDNA序列，然后針對(duì)菊花MET1基因全長(zhǎng)cDNA序列中的保守片段序列構(gòu)建多個(gè)RNAi表達(dá)載體；

所構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體，由于以菊花MET1基因中的保守序列（100-300bp）作為目的片段，因此當(dāng)菊花MET1基因與RNAi表達(dá)載體配對(duì)結(jié)合時(shí)，可使相應(yīng)配對(duì)部分的堿基形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成雙鏈siRNA，對(duì)目標(biāo)基因MET1的mRNA起降解作用，從而促使MET1基因的失活，使其無(wú)法正常表達(dá)；

所述保守片段序列包括3個(gè)部分：Chry1、Chry3、Chry4；

其中Chry1的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，即：

Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；

Chry3的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，即：

Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；

Chry4的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，即：

Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGAACCTGAAGAAGAAAGCACCCTTCCTGTTCAGGAACCTGAAAAACCTCATTCTGCATCAAAGGAAAAGAAATCTCGCATTTCAAAAACCGACATCAGTTGGGTTGG；

對(duì)上述特定保守區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，特異性引物序列設(shè)計(jì)如下：

PCR克隆擴(kuò)增保守序列Chry1時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

FADi1-XbalⅠ: GCTCTAGACCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA，

FADi1-XhoⅠ: CCGCTCGAGCCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA；

FADi1-HindⅢ: CCCAAGCTTCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA，

FADi1-KpnⅠ: GGGGTACCCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA；

PCR克隆擴(kuò)增保守序列Chry3時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

Chry3-Sense-LB-FADi-XbaI: GCTCTAGAAGGGGTAATGACGGCAG，

Chry3-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAGGCCATATCTGTTC；

Chry3-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGAGGGGTAATGACGGCA，

Chry3-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACCCCAGGCCATATCTGTTCG；

PCR克隆擴(kuò)增保守序列Chry4時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

Chry4-Sense-LB-FADi-XbaI:GCTCTAGACAGAAGACAATGAGCAG，

Chry4-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAACCCAACTGATGT；

Chry4-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGCAGAAGACAATGAGC，

Chry4-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACC CCAACCCAACTGATGTC；

所述多個(gè)RNAi表達(dá)載體具體有：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX-HX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX-HX和Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX-HX；

（2）將步驟（1）中所構(gòu)建RNAi表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體為：

利用凍融法，將步驟（1）中所構(gòu)建的多個(gè)RNAi表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，并篩選、保留轉(zhuǎn)化正確的菌株，并制備浸染液備用；

詳細(xì)步驟為：

將0.5~1μL的RNAi表達(dá)載體（大約0.5~1μg）加入到100 μL的GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)菌液中，冰浴30 min，再液氮中冷凍1.5 min，再立即置于37℃水浴中5 min；

加入1000 μL的YEB 液體培養(yǎng)基，148 rpm、28℃、避光培養(yǎng)3 h；

培養(yǎng)結(jié)束后，5000 rpm離心5 min，保留約200μL上清（其余棄掉），用移液槍將沉淀吹打混勻，涂布于加有Rif（利福平，50mg/L）和壯觀霉素（濃度為50 mg/L）的YEB固體平板上，倒置、避光、28℃，培養(yǎng)1~2天，將生成單菌落保存?zhèn)溆没蛑苯又苽浣居棉r(nóng)桿菌菌液；

制備浸染用農(nóng)桿菌菌液時(shí)，具體制備方法為：

將篩選獲得的農(nóng)桿菌菌株于YEB培養(yǎng)基（50 mg/L Rif+50 mg/L壯觀霉素）中，培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.5~0.7左右，然后5000rpm離心15 min，以收集菌體；將所收集農(nóng)桿菌菌體用含10%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)液重懸，然后再28℃、200 rpm 的條件下培養(yǎng)2~3 h，作為浸染液備用；

（3）制備菊花愈傷組織，并浸染，具體為：

制備菊花愈傷組織，利用步驟（2）中所制備浸染液對(duì)菊花愈傷組織進(jìn)行浸染，浸染后將愈傷組織用無(wú)菌水短暫沖洗一次，放在無(wú)菌濾紙上自然晾干后再進(jìn)行繼續(xù)培育；浸染時(shí)，將菊花愈傷組織置于農(nóng)桿菌菌液中浸泡5~7 min，浸泡期間可不斷搖晃，以確保愈傷組織與菌液充分接觸；

具體培育過(guò)程為：

消毒后外植體先接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織，將所形成的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2~3周后用于農(nóng)桿菌浸染；

農(nóng)桿菌浸染后愈傷組織再接種于分化培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2~3 d左右；

然后將愈傷組織置于含有cef（頭孢霉素，100 mg/L）的無(wú)菌水中浸洗3~5 min，無(wú)菌水沖洗干凈后，將愈傷組織鋪于無(wú)菌濾紙上，自然風(fēng)干，轉(zhuǎn)接于延遲培養(yǎng)基中延遲培養(yǎng)2~4 d；

將延遲培養(yǎng)后愈傷組織再轉(zhuǎn)接到選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)1~2個(gè)月；

最后將選擇培養(yǎng)基中愈傷組織置于生根培養(yǎng)基中促進(jìn)生根；

菊花組培期間溫度條件為：20~25℃；

所述分化培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA；

所述延遲培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+200 mg/L cef；

所述選擇培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+100 mg/L cef +8 mg/L Kan；

所述生根培養(yǎng)基為：MS+10 mg/L Kan；

菊花愈傷組織的制備方法，具體可參考如下步驟：

取菊花幼嫩的莖段作為外植體，對(duì)外植體進(jìn)行消毒后接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)形成愈傷組織，將所形成的愈傷組織在分化培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2~3周后用于農(nóng)桿菌浸染；

對(duì)外植體進(jìn)行消毒時(shí)，具體方式例如為：先用自來(lái)水沖洗外植體10 min，然后在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇浸泡5~8 s，再在0.1%的氯化汞中浸泡5 min，期間可不斷搖晃，以確保消毒徹底，最后再用無(wú)菌蒸餾水清洗外植體3~5次；

將外植體置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，可將外植體切割為0.5~0.8 mm長(zhǎng)的莖段進(jìn)行接種，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+2.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2，4-D ，pH= 5.8，培養(yǎng)條件為：外植體接種后先暗培養(yǎng)一周，再每天光照16 h/黑暗8 h進(jìn)行培養(yǎng)；

所述菊花，具體例如可采用“紫精靈”品種的幼嫩的莖段（具體例如未5cm長(zhǎng)度左右側(cè)枝莖段），

（4）轉(zhuǎn)基因植株篩選、鑒定，具體為：

對(duì)步驟（3）中生根后菊花幼苗進(jìn)行鑒定，確保為正確的轉(zhuǎn)基因植株后，移栽到大田，正常管理；

以河南地區(qū)為例，4月中旬左右將根系發(fā)達(dá)健壯的轉(zhuǎn)基因菊花幼苗煉苗后，5月初移栽到大田，生長(zhǎng)過(guò)程中及時(shí)摘除腋芽，9月下旬左右摘除側(cè)蕾，僅留主蕾開(kāi)花。

本發(fā)明的主要技術(shù)原理是：通過(guò)干涉維持CpG位點(diǎn)DNA甲基化酶的基因（MET1）從而使DNA甲基化水平降低，進(jìn)而改變菊花表觀遺傳信息，促進(jìn)菊花花期提前開(kāi)放。本發(fā)明的主要技術(shù)操作思路為：首先通過(guò)3’和5’RACE技術(shù)得到菊花DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因（MET1）全長(zhǎng)的cDNA序列，然后構(gòu)建可以沉默MET1基因的特定RNAi表達(dá)載體，再然后通過(guò)將預(yù)培養(yǎng)的菊花愈傷組織浸泡在含有特定RNAi表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液中，使RNAi表達(dá)載體通過(guò)植物傷口進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因向植物組織細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，最后經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)，再生出轉(zhuǎn)基因植株，常規(guī)煉苗后即可移栽至田間，正常管理，從而獲得菊花開(kāi)放時(shí)間有所調(diào)整的新品種菊花。

檢測(cè)表明，與非轉(zhuǎn)基因菊花相比，經(jīng)篩選獲得的轉(zhuǎn)基因菊花植株在不同條件下（組織培養(yǎng)、大田栽種），其MET1基因表達(dá)豐度和DNA甲基化水平都有明顯下降（轉(zhuǎn)基因植株的甲基轉(zhuǎn)移酶CmMET1基因的表達(dá)量為對(duì)照的53.25%，從而引起轉(zhuǎn)化植株的DNA甲基化水平比對(duì)照下降12%），已獲得的表觀遺傳修飾可以穩(wěn)定遺傳，因此可以通過(guò)扦插進(jìn)行大量繁殖。

總體而言，本申請(qǐng)所采用構(gòu)建菊花新品種的方法，對(duì)于菊花基因組沒(méi)有大的影響，不會(huì)改變菊花花型、花色等特性，但可較好調(diào)節(jié)菊花開(kāi)放時(shí)間，可使菊花提前6~8天開(kāi)花，表現(xiàn)出較好的應(yīng)用效果；同時(shí)由于這一表觀遺傳修飾可以穩(wěn)定遺傳，借助成熟的組培體系，可使提前開(kāi)花的菊花新品種穩(wěn)定、快速繁殖，從而節(jié)約大量的人力、物力成本。總之，本申請(qǐng)?jiān)诰栈ɑㄆ诘恼{(diào)控中表現(xiàn)出較好的、較為穩(wěn)定的調(diào)控效果，同時(shí)也為菊花新品種培育提供了較好的借鑒和參考，表現(xiàn)出較好的理論和應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為莖段愈傷組織誘導(dǎo)與再生體系的組織培養(yǎng)過(guò)程，其中A：初期培養(yǎng)，B：轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，C：分化初期——出芽，D：分化后期——成苗，E：生根培養(yǎng)，F(xiàn)： 移栽；

圖2為RNAi干涉后對(duì)菊花花期影響效果，其中CK：菊花“紫精靈”對(duì)照組，處理組1、2：轉(zhuǎn)基因植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，但需要說(shuō)明的是，下述實(shí)施例僅以較為常見(jiàn)的菊花品種“紫精靈”為例，進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，但不應(yīng)理解為本發(fā)明依賴于或僅可用于這一菊花品種，初步實(shí)驗(yàn)表明，本申請(qǐng)對(duì)于常規(guī)菊花栽培品種（如國(guó)慶紅、洹水金秋、南農(nóng)麗雅等品種）都具有類似的促進(jìn)提前開(kāi)放的技術(shù)效果。

實(shí)施例1

本發(fā)明的應(yīng)用依賴于特定RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建，相關(guān)載體構(gòu)建過(guò)程，具體操作可參見(jiàn)《菊花與青蒿MET1基因克隆及菊花RNAi載體構(gòu)建》（施冬青，2014年河南大學(xué)碩士論文）中方法及構(gòu)建過(guò)程。為保證文本結(jié)構(gòu)的完整性，在本實(shí)施例中，僅就相關(guān)相關(guān)過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下。

、獲得菊花DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1基因全長(zhǎng)cDNA序列

利用3’和5’RACE技術(shù)獲得菊花甲基轉(zhuǎn)移酶MET1基因全長(zhǎng)cDNA序列，然后以菊花MET1基因中的保守序列（100-300bp）作為目的片段，所述保守片段序列包括3個(gè)部分：Chry1、Chry3、Chry4；

其中Chry1的堿基序列如SEQ ID NO.1所示，即：

Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；

Chry3的堿基序列如SEQ ID NO.2所示，即：

Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；

Chry4的堿基序列如SEQ ID NO.3所示，即：

Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGAACCTGAAGAAGAAAGCACCCTTCCTGTTCAGGAACCTGAAAAACCTCATTCTGCATCAAAGGAAAAGAAATCTCGCATTTCAAAAACCGACATCAGTTGGGTTGG。

、PCR克隆保守序列

提取“紫精靈”DNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增時(shí)，特異性引物序列設(shè)計(jì)如下：

PCR克隆擴(kuò)增保守序列Chry1時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

FADi1-XbalⅠ: GCTCTAGACCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA，

FADi1-XhoⅠ: CCGCTCGAGCCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA；

FADi1-HindⅢ: CCCAAGCTTCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA，

FADi1-KpnⅠ: GGGGTACCCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA；

PCR克隆擴(kuò)增保守序列Chry3時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

Chry3-Sense-LB-FADi-XbaI: GCTCTAGAAGGGGTAATGACGGCAG，

Chry3-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAGGCCATATCTGTTC；

Chry3-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGAGGGGTAATGACGGCA，

Chry3-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACCCCAGGCCATATCTGTTCG；

PCR克隆擴(kuò)增保守序列Chry4時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

Chry4-Sense-LB-FADi-XbaI:GCTCTAGACAGAAGACAATGAGCAG，

Chry4-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAACCCAACTGATGT；

Chry4-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGCAGAAGACAATGAGC，

Chry4-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACC CCAACCCAACTGATGTC；

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳，并提取、回收，備用。

、與pMD18-T載體進(jìn)行連接

將步驟2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pMD18-T連接，以Chry4序列為例，具體過(guò)程為：

將正向Chry4序列（以Chry4-Sense-LB-FADi-XbaI、 Chry4-Sense-RB-FADi-HindIII引物序列克隆獲得）、反向Chry4序列（以Chry4-Antisense-LB-FADi-XhoI、Chry4-Antisense-RB-FADi-Kpn引物序列克隆獲得）分別與pMD18-T連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)于大連寶生物），挑取陽(yáng)性克隆菌株，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，最終獲得重組正確的質(zhì)粒pMD18-T- Chry4-HX和pMD18-T- Chry4-KX。

、雙酶切RNAi空載（Dhpart27RNAiFADP1P4）和T-KX質(zhì)粒，并連接

需要解釋的是，所述T-KX質(zhì)粒，即步驟3中所構(gòu)建的重組質(zhì)粒，如：pMD18-T- Chry4-KX。

將含有RNAi空載質(zhì)粒（Dhpart27RNAiFADP1P4）和含有質(zhì)粒T-KX的菌株（如步驟3中含有pMD18-T-Chry4-KX質(zhì)粒的菌株）預(yù)先活化，并提取質(zhì)粒備用（參考takara質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作）；

將所提取的RNAi空載質(zhì)粒（Dhpart27RNAiFADP1P4）和質(zhì)粒T-KX（如步驟3中的pMD18-T- Chry4-KX）分別采用XhoⅠ和KpnⅠ進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行回收、純化；

將酶切產(chǎn)物利用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，篩選，酶切驗(yàn)證，最終獲得：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX。

、雙酶切步驟4中所構(gòu)建重組質(zhì)粒及T-HX，并連接

所述T-HX質(zhì)粒，即步驟3中所構(gòu)建的重組質(zhì)粒，如：pMD18-T- Chry4-HX。

利用XbalⅠ和HindⅢ對(duì)步驟4中所構(gòu)建重組質(zhì)粒和步驟3中所構(gòu)建T-HX質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行回收、純化；

將酶切產(chǎn)物利用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，篩選，酶切驗(yàn)證，最終獲得RNAi表達(dá)載體：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX-HX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX-HX和Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX-HX。

實(shí)施例2

本實(shí)施例就轉(zhuǎn)化菊花用農(nóng)桿菌菌液（轉(zhuǎn)化液）的制備過(guò)程，簡(jiǎn)要介紹如下。

利用凍融法，將實(shí)施例1中所構(gòu)建的多個(gè)RNAi表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，并篩選、保留轉(zhuǎn)化正確的菌株，并制備浸染液備用；

詳細(xì)步驟為：

將0.5~1μL的RNAi表達(dá)載體（大約0.5~1μg）加入到100 μL的GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)菌液中，冰浴30 min，再液氮中冷凍1.5 min，再立即置于37℃水浴中5 min；

加入1000 μL的YEB 液體培養(yǎng)基，148 rpm、28℃、避光培養(yǎng)3 h；

培養(yǎng)結(jié)束后，5000 rpm離心5 min，保留約200μL上清（其余棄掉），用移液槍將沉淀吹打混勻，涂布于加有Rif（50 mg/L）和壯觀霉素（50 mg/L）的YEB固體平板上，倒置、避光、28℃培養(yǎng)1~2天，隨機(jī)挑取12個(gè)單菌落，培養(yǎng)24 h后，以目的序列的特異性引物為引物，進(jìn)行菌液PCR篩選，選取陽(yáng)性克隆保存?zhèn)溆没蛑苯又苽浣居棉r(nóng)桿菌菌液。

制備浸染用農(nóng)桿菌菌液時(shí)，具體制備方法為：

將篩選獲得的農(nóng)桿菌菌株于YEB培養(yǎng)基（50 mg/L Rif+50 mg/L壯觀霉素）中，培養(yǎng)至OD₆₀₀=0.5~0.6左右，然后5000rpm離心15 min，以收集菌體；

將所收集農(nóng)桿菌菌體用含10%蔗糖的1/2MS培養(yǎng)液重懸，然后再28℃、200 rpm 的條件下培養(yǎng)2~3 h，作為浸染液備用。

實(shí)施例3

本實(shí)施例就菊花的具體轉(zhuǎn)化、篩選過(guò)程，簡(jiǎn)要介紹如下。

、制備菊花愈傷組織

本實(shí)施例以菊花“紫精靈”品種為例，制備了愈傷組織，外植體來(lái)源為：

取菊花幼嫩的莖段（為確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，發(fā)明人以組培苗為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，具體為：將組培幼苗移栽到實(shí)驗(yàn)田后生長(zhǎng)3個(gè)月，摘除頂端優(yōu)勢(shì)，使側(cè)枝生長(zhǎng)，一個(gè)月左右后生長(zhǎng)至5 cm長(zhǎng)度左右的側(cè)枝莖作為外植體）用自來(lái)水沖洗10 min；然后在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇浸泡6s，取出在0.1%的氯化汞中浸泡5 min，期間不斷搖晃；最后用無(wú)菌蒸餾水清洗莖段5次；然后接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

為確定愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的最佳配方，發(fā)明人對(duì)愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化組合實(shí)驗(yàn)，簡(jiǎn)要介紹如下。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基在MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（pH=5.8）上，添加不同濃度的6-BA和2，4-D后，調(diào)節(jié)pH=5.8，然后121℃高壓滅菌20 min進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每瓶接種7根莖段（0.5~0.8 mm左右），每種培養(yǎng)基5瓶重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3次。培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)溫度為20℃~25℃，先暗培養(yǎng)一周，再每天光照16 h、黑暗8 h進(jìn)行誘導(dǎo)直至切口處長(zhǎng)出翠綠色的愈傷組織（大約需要20~30 d左右）。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，6-BA和2，4-D分別設(shè)置3個(gè)濃度梯度，其中6-BA的濃度1.0 mg/L、2.0 mg/L、3.0 mg/L，2，4-D的濃度為0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L，共9種培養(yǎng)基配方。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表1所示。

表1， 不同培養(yǎng)基對(duì)“紫精靈”莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響：

注：字母a-g，不同字母表示在0.05水平具有顯著差異，同列內(nèi)的相同字母則表示在該水平上的差異不顯著。

以誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)率=長(zhǎng)出愈傷的莖段數(shù)/接種的熾情莖段數(shù)×100%）和愈傷生長(zhǎng)狀態(tài)為判定標(biāo)準(zhǔn)，可以看出，最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為MS+2.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2，4-D，此時(shí)誘導(dǎo)率為76.7%。

進(jìn)一步分析可以看出，當(dāng)6-BA 濃度不超過(guò) 2.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率隨6-BA 的濃度增加而上升，愈傷組織的質(zhì)地松軟濕潤(rùn)；但 2，4-D 濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致合作組織質(zhì)地硬化、偏干，生長(zhǎng)緩慢。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察發(fā)現(xiàn)，在MS+2.0 mg/L 6-BA+ 1.5 mg/L 2，4-D 的培養(yǎng)基上，愈傷誘導(dǎo)率雖然可以達(dá)到77.3%，但在轉(zhuǎn)接培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織容易褐化，不利于后期實(shí)驗(yàn)，因而并不適合作為最佳培養(yǎng)基。

、將步驟1中培育的愈傷組織進(jìn)行預(yù)分化培養(yǎng)

將步驟1中最佳愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合上誘導(dǎo)的愈傷組織進(jìn)行預(yù)分化培養(yǎng)，為確定最佳的分化培養(yǎng)基組合，發(fā)明人同樣進(jìn)行了分化培養(yǎng)基的優(yōu)化組合，簡(jiǎn)要介紹如下。

分化培養(yǎng)基在MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂粉的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，添加不同濃度的6-BA和NAA，然后調(diào)節(jié)pH=5.8，121℃高壓滅菌20 min后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，6-BA設(shè)置3個(gè)梯度，分別0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L；NAA設(shè)置5個(gè)梯度，分別為0.1 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，選取嫩綠、松軟、濕潤(rùn)、生長(zhǎng)快的菊花愈傷組織接種于愈傷分化培養(yǎng)基，每瓶接種7塊愈傷，每種培養(yǎng)基5瓶重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3次。培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)溫度為20℃~25℃。培養(yǎng)過(guò)程中，25天一個(gè)周期連續(xù)轉(zhuǎn)接2~3次后，愈傷組織即開(kāi)始出現(xiàn)芽點(diǎn)，而對(duì)不同組合的培養(yǎng)基上出現(xiàn)芽點(diǎn)的時(shí)間在統(tǒng)計(jì)上沒(méi)有明顯差異，因而在轉(zhuǎn)接2次后，統(tǒng)計(jì)愈傷的分化率。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表2所示。

表2，不同培養(yǎng)基對(duì)“紫精靈”莖段愈傷組織分化的影響：

注：字母a-g，不同字母表示在0.05水平具有顯著差異，同列內(nèi)的相同字母則表示在該水平上的差異不顯著。

對(duì)上表分析可以看出，細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值偏大，有利于芽的形成。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L 6-BA ，NAA濃度為0.4~1.0 mg/L 時(shí)，愈傷組織的分化率明顯高于其他培養(yǎng)基配方，且彼此之間差異也小，分化率范圍為68.3~75.3。

以分化率（分化率=分化的愈傷數(shù)/接種的總愈傷數(shù)×100%）和分化苗生長(zhǎng)狀態(tài)為判定標(biāo)準(zhǔn)，最終確定最佳的愈傷分化培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6 mg/L NAA（PH5.8），此時(shí)分化率為75.3%。

、將預(yù)分化后愈傷組織進(jìn)行浸染，延遲培養(yǎng)和選擇培養(yǎng)

利用實(shí)施例2中所制備浸染液，對(duì)步驟2中預(yù)分化后愈傷組織進(jìn)行浸染，浸染時(shí)，將菊花組織置于農(nóng)桿菌菌液中浸泡5~7 min，浸泡期間可不斷搖晃，以確保愈傷組織與菌液充分接觸；

浸染后將愈傷組織用無(wú)菌水短暫沖洗一次，放在無(wú)菌濾紙上自然晾干后再接種于步驟2的最佳分化培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)3d（20℃~25℃），然后轉(zhuǎn)接于延遲培養(yǎng)基進(jìn)行培育3d；再轉(zhuǎn)接于選擇培養(yǎng)基中培育2~3個(gè)月后形成轉(zhuǎn)基因幼苗，最后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中生根；生根后菊花幼苗經(jīng)煉苗后移栽至田間，正常管理即可；

煉苗之前，菊花組培過(guò)程中溫度為20~25℃；

所述選擇培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+100mg/L cef +8 mg/L Kan；

所述延遲培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+200mg/L cef；

所述生根培養(yǎng)基為：MS+10 mg/L Kan。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，在河南大學(xué)的實(shí)驗(yàn)田內(nèi)（河南省開(kāi)封市），2016年4月中旬進(jìn)行常規(guī)練苗，5月4日轉(zhuǎn)移至穴盤，遮光，待長(zhǎng)出新根后上盆（6月8日），移栽到大田。轉(zhuǎn)基因苗與非轉(zhuǎn)基因苗各20盆，生長(zhǎng)過(guò)程中及時(shí)摘除腋芽，9月下旬左右摘除側(cè)蕾，僅留主蕾開(kāi)花。9月 7 日選取生長(zhǎng)健碩、一致且無(wú)病蟲(chóng)害的頂端葉片，自來(lái)水沖洗干凈錫箔紙包裹經(jīng)液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?，取材時(shí)間為上午10:00左右。

記錄試驗(yàn)過(guò)程中的現(xiàn)蕾日期（現(xiàn)蕾日期以出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的花苞為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）、開(kāi)花日期（開(kāi)花日期以花瓣全部展開(kāi)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）、現(xiàn)蕾時(shí)間（現(xiàn)蕾時(shí)間以現(xiàn)蕾日期-移栽日期為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）、開(kāi)花時(shí)間（開(kāi)花時(shí)間以開(kāi)花日期-移栽日期為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)）。

組培過(guò)程中部分結(jié)果如圖1所示，開(kāi)花情況如圖2所示。

其中移栽日期為6月8日最終統(tǒng)計(jì)結(jié)果如下表所示：

注：數(shù)據(jù)后的 * 表示 0.05 水平上的差異顯著性。

由上表可知：菊花品種“紫精靈”對(duì)照組與處理組花蕾出現(xiàn)時(shí)間和初花時(shí)間分為 109 d 和 135 d、99 d 和 127 d，花蕾出現(xiàn)時(shí)間和初花時(shí)間與對(duì)照相比都顯著降低，分別提前 10d 和 8 d、12 d 和 9 d，花蕾發(fā)育時(shí)間處理組與對(duì)照間沒(méi)有差異。菊花DNA甲基化水平降低可以使花期提前。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南大學(xué)

<120> 一種利用RNAi載體調(diào)節(jié)菊花開(kāi)花時(shí)間的方法

<130> none

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 273

<212> DNA

<213> Dendranthema morifolium

<400> 1

ccatgtcagg tattaattcc aacctttaca gcttttcaac ttattaaaat catatgaaat 60

ataaagacat gcagcacaac attaatgttc cttttacaac ataggatgag acattcttaa 120

cattttaaat atttatacag ggattttctg gtatgaatag gttcaataca agcacatgga 180

gcaaggttca gtgtgaaatg atattggcgc ttttgtcttt tgctgagtac ttccgtccca 240

agtatttctt gctagaaaat gtgaggaact ttg 273

<210> 2

<211> 184

<212> DNA

<213> Dendranthema morifolium

<400> 2

aggggtaatg acggcagatg atggaagtgg attctgttta gatgatgaac ctggtagtgc 60

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ggaatggatg attgaatttg gatcatcaat ggttttcatt tcaattcgaa cagatatggc 180

ctgg 184

<210> 3

<211> 136

<212> DNA

<213> Dendranthema morifolium

<400> 3

cagaagacaa tgagcaggaa gattgtgaag aacctgaaga agaaagcacc cttcctgttc 60

aggaacctga aaaacctcat tctgcatcaa aggaaaagaa atctcgcatt tcaaaaaccg 120

acatcagttg ggttgg 136