本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的方法及其專用表達(dá)盒。

背景技術(shù)：

油料作物的種子中的三酰甘油與油體蛋白組成一個(gè)0.2-0.5μm的球體，這個(gè)球體被稱為油體。油體蛋白是小分子量(15-26kD)的堿性疏水蛋白，在種子中特異表達(dá)，為油體所特有，對(duì)維持油體的穩(wěn)定極為重要，占油體總重量的1-4％。

不同物種來(lái)源的油體蛋白的分子量不同，但都具有3個(gè)基本的結(jié)構(gòu)域，即：N端40-60個(gè)氨基酸組成的兩親性區(qū)域(兼具親水性和親脂性)，這一區(qū)域分布于油體表面朝向胞漿的一面；中間68-74個(gè)氨基酸的保守區(qū)域，為伸入油體內(nèi)部的反式平行β-折疊結(jié)構(gòu)，這一區(qū)域的氨基酸序列在不同來(lái)源的油體蛋白中高度保守；位于或靠近C端的33-40個(gè)氨基酸組成的α-螺旋結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域兼具親水和親脂性，其帶正電荷的基團(tuán)朝向油體表面的磷脂層，帶負(fù)電荷的部分位于油體表面朝向胞漿的一面。通過(guò)對(duì)不同植物油體蛋白氨基酸序列的研究發(fā)現(xiàn)，不同油體蛋白分子間除中部疏水區(qū)域高度保守外，N端和C端氨基酸序列差異很大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了表達(dá)盒Ⅰ。

本發(fā)明所提供的表達(dá)盒Ⅰ自上游至下游依次可包括如下元件：植物油體蛋白基因的啟動(dòng)子、融合基因Ⅰ和終止序列；

所述融合基因Ⅰ中可含有區(qū)段甲和區(qū)段乙；所述區(qū)段甲編碼植物油體蛋白；所述區(qū)段乙編碼目的物或目的物的前體；所述目的物可為蛋白質(zhì)或多肽。

所述融合基因Ⅰ中，5’末端為起始密碼子，3’末端為終止密碼子，中間為連續(xù)的編碼區(qū)。

所述目的物的前體在生物體中可自發(fā)形成目的物。

所述融合基因Ⅰ還可包括一個(gè)以上區(qū)段丙；所述區(qū)段丙編碼蛋白標(biāo)簽。

當(dāng)融合基因Ⅰ中包括2個(gè)以上區(qū)段丙時(shí)，每個(gè)區(qū)段丙可以編碼不同的蛋白標(biāo)簽。

所述融合基因Ⅰ還可包括區(qū)段?。凰鰠^(qū)段丁可為蛋白酶的酶切識(shí)別序列。

所述融合基因Ⅰ自上游至下游依次可包括如下區(qū)段：所述區(qū)段丙、所述區(qū)段甲、所述區(qū)段丁和所述區(qū)段乙。所述區(qū)段丙具體可編碼6×His標(biāo)簽。

所述融合基因Ⅰ自上游至下游依次可包括如下區(qū)段：第一個(gè)所述區(qū)段丙、所述區(qū)段甲、第二個(gè)所述區(qū)段丙和所述區(qū)段乙。第一個(gè)所述區(qū)段丙與第二個(gè)所述區(qū)段丙編碼不同的蛋白標(biāo)簽。第一個(gè)所述區(qū)段丙具體可編碼6×His標(biāo)簽。第二個(gè)所述區(qū)段丙具體可編碼8×His標(biāo)簽。

所述目的物可為鮭魚降鈣素。所述目的物的前體可為鮭魚降鈣素的前體。

所述區(qū)段乙可為如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；

b3)與b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且編碼所述鮭魚降鈣素的前體的DNA分子；

b4)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述鮭魚降鈣素的前體的DNA分子。

所述表達(dá)盒Ⅰ的核苷酸序列具體可如序列表中序列4所示。

含有上述任一所述表達(dá)盒Ⅰ的重組載體Ⅰ也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體Ⅰ可為重組質(zhì)粒丙。所述重組質(zhì)粒丙和所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301的唯一不同在于：將重組質(zhì)粒pBO-sCT2301中鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(序列表中序列4自5′末端起第1363至1461位所示)替換為編碼目的物或目的物的前體的基因。

所述重組載體Ⅰ可為重組質(zhì)粒丁。所述重組質(zhì)粒丁和重組質(zhì)粒pBO-G2301的唯一區(qū)別在于：將重組質(zhì)粒pBO-G2301的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ識(shí)別序列間的小片段替換為編碼目的物或目的物的前體的基因。

所述重組載體Ⅰ具體可為重組質(zhì)粒pBO-sCT2301。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301為將載體pCAMBIA2301的限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301表達(dá)序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)。

所述重組載體Ⅰ具體可為重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301和所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ的唯一不同在于：所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301中鮭魚降鈣素前體的編碼基因(即sCT基因)為序列表中序列4自5′末端起第1363至1461位所示，所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ中鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(即sCT-DZ基因)為序列表中序列7自5′末端起第22至120位所示。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ表達(dá)序列表中序列5所示的蛋白質(zhì)。

所述重組載體Ⅰ具體可為重組質(zhì)粒pBO-G2301。所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301和所述重組質(zhì)粒pBO-G2301的唯一不同在于：所述重組質(zhì)粒pBO-sCT2301的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ識(shí)別序列間的小片段為序列表中序列1自5′末端起第7至126位所示的DNA分子，所述重組質(zhì)粒pBO-G2301的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ識(shí)別序列間的小片段為序列表中序列8自5′末端起第7至1353位所示的DNA分子。所述重組質(zhì)粒pBO-G2301表達(dá)序列表中序列9所示的蛋白質(zhì)。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了表達(dá)盒Ⅱ。

本發(fā)明所提供的表達(dá)盒Ⅱ自上游至下游依次可包括如下元件：植物油體蛋白基因的啟動(dòng)子、融合基因Ⅱ和終止序列；

所述融合基因Ⅱ中可含有所述區(qū)段甲和區(qū)段戊；所述區(qū)段戊為供編碼目的物或目的物的前體的基因插入的插入位點(diǎn)；所述目的物為蛋白質(zhì)或多肽。所述目的物的前體在生物體中可自發(fā)形成目的物。

所述融合基因Ⅱ中，5’末端為起始密碼子，3’末端為終止密碼子，中間為連續(xù)的編碼區(qū)。

所述融合基因Ⅱ還可包括一個(gè)以上區(qū)段丙；所述區(qū)段丙編碼蛋白標(biāo)簽。

當(dāng)融合基因Ⅱ中包括2個(gè)以上區(qū)段丙時(shí)，每個(gè)區(qū)段丙可以編碼不同的蛋白標(biāo)簽。

所述融合基因Ⅱ還可包括區(qū)段??；所述區(qū)段丁可為蛋白酶的酶切識(shí)別序列。

所述融合基因Ⅱ自上游至下游依次可包括如下區(qū)段：所述區(qū)段丙、所述區(qū)段甲、所述區(qū)段丁和所述區(qū)段戊。所述區(qū)段丙具體可編碼6×His標(biāo)簽。

所述融合基因Ⅱ自上游至下游依次可包括如下區(qū)段：第一個(gè)所述區(qū)段丙、所述區(qū)段甲、第二個(gè)所述區(qū)段丙和所述區(qū)段戊。第一個(gè)所述區(qū)段丙與第二個(gè)所述區(qū)段丙編碼不同的蛋白標(biāo)簽。第一個(gè)所述區(qū)段丙具體可編碼6×His標(biāo)簽。第二個(gè)所述區(qū)段丙具體可編碼8×His標(biāo)簽。

所述目的物可為鮭魚降鈣素。所述目的物的前體可為鮭魚降鈣素的前體。

含有上述任一所述表達(dá)盒Ⅱ的重組載體Ⅱ也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

上述任一所述植物油體蛋白基因的啟動(dòng)子可為油菜油體蛋白(GenBank號(hào)為X94225.1)基因的啟動(dòng)子。所述油菜油體蛋白(GenBank號(hào)為X94225.1)基因的啟動(dòng)子的核苷酸序列具體可如序列表中序列4自5′末端起第1至875位所示。

上述任一所述“所述區(qū)段甲編碼植物油體蛋白”中的所述植物油體蛋白可為芝麻油體蛋白(GenBank號(hào)為AAB58402.1)。當(dāng)所述區(qū)段甲編碼芝麻油體蛋白(GenBank號(hào)為AAB58402.1)時(shí)，所述區(qū)段甲的核苷酸序列具體可如序列表中序列4自5′末端起第913至1341位所示。

上述任一所述終止序列可為Nos polyA終止子。所述Nos polyA終止子的核苷酸序列具體可如序列表中序列4自5′末端起第1474至1721位所示。

上述任一所述蛋白酶可為滿足如下條件的蛋白酶：所述蛋白酶對(duì)于所述融合基因Ⅰ或融合基因Ⅱ的表達(dá)產(chǎn)物的酶切位置為特定氨基酸殘基與其前一位氨基酸殘基之間；所述特定氨基酸殘基為目的物的第一個(gè)氨基酸殘基。

上述任一所述蛋白酶具體可為腸激酶。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了一種制備目的物或目的物的前體的方法。

本發(fā)明所提供的制備目的物的方法依次包括如下步驟：

(1)將上述任一所述重組載體Ⅰ導(dǎo)入受體植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；

(2)取轉(zhuǎn)基因植物的種子，提取油體；

(3)利用所述蛋白標(biāo)簽從所述油體中純化所述融合蛋白；

(4)取步驟(3)得到的融合蛋白，用蛋白酶進(jìn)行酶切；

(5)從步驟(4)的酶切產(chǎn)物中分離目的物；

(6)醋酸化；

(7)脫鹽；

所述目的物為蛋白質(zhì)或多肽。。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了表達(dá)目的物的方法。

本發(fā)明所提供的表達(dá)目的物的方法，具體可為方法一，依次可包括如下步驟：

(1)在上述任一所述重組載體Ⅱ中的所述區(qū)段戊插入目的基因，得到含有目的基因的重組載體；所述目的基因?yàn)榫幋a所述目的物或所述目的物的前體的基因；所述目的物為蛋白質(zhì)或多肽；

(2)將含有目的基因的重組載體導(dǎo)入受體植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；

(3)通過(guò)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物得到所述目的物。

上述步驟(1)中，“在上述任一所述重組載體Ⅱ中的所述區(qū)段戊插入目的基因”是在不影響基因的編碼框的前提下進(jìn)行的。

本發(fā)明所提供的表達(dá)目的物的方法，具體可為方法二，依次可包括如下步驟：

(1)將上述任一所述重組載體Ⅰ導(dǎo)入受體植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；

(2)通過(guò)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物得到目的物；所述目的物為蛋白質(zhì)或多肽。

上述方法中，所述受體植物具體可為油菜品種中雙4號(hào)。

上述方法中，所述目的物存在或主要存在于轉(zhuǎn)基因植物的種子中。

上述方法中，所述目的物的前體在生物體中可自發(fā)形成目的物。

上述方法中，所述“培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因植物得到目的物”還依次可包括如下步驟：

(4)取轉(zhuǎn)基因植物的種子，提取油體；

(5)利用所述蛋白標(biāo)簽從所述油體中純化所述融合蛋白；

(6)取步驟(5)得到的融合蛋白，用蛋白酶進(jìn)行酶切；

(7)從步驟(6)的酶切產(chǎn)物中分離目的物；

(8)醋酸化；

(9)脫鹽。

所述“提取油體”的步驟可為：先粉碎轉(zhuǎn)基因植物的種子，然后用提取緩沖液提?。凰鎏崛【彌_液為含2.0-3.0mM EDTA和400-600mM NaCl的pH7.5-8.5、15-25mM Tris-HCl緩沖液。所述粉碎的程度可為200目。所述提取緩沖液具體可為含2.5mM EDTA和500mM NaCl的pH8.0、20mM Tris-HCl緩沖液。

上述方法中，所述蛋白標(biāo)簽可為6×His標(biāo)簽。

所述“利用所述蛋白標(biāo)簽從所述油體中純化所述融合蛋白”可采用鎳離子螯合磁珠進(jìn)行純化，具體步驟如下：

(1)取離心管，加入步驟(2)提取的油體和Buffer A，充分混勻，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體丁，下層為溶液丁；

(2)取一新的離心管，加入油體丁和Buffer A，充分混勻；然后加入鎳離子螯合磁珠，充分懸浮后置于旋轉(zhuǎn)混合儀上溫育60min；最后通過(guò)磁性分離，將所述鎳離子螯合磁珠轉(zhuǎn)移到新的離心管中；

(3)完成步驟(2)后，取裝有所述鎳離子螯合磁珠的離心管，加入Buffer B，用移液器輕輕吹打數(shù)次，使所述鎳離子螯合磁珠重新懸浮，然后通過(guò)磁性分離，將所述鎳離子螯合磁珠轉(zhuǎn)移到新的離心管中；

(4)重復(fù)步驟(3)兩次；

(5)完成步驟(4)后，取裝有所述鎳離子螯合磁珠的離心管，加入Buffer C，用移液器輕輕吹打數(shù)次，使所述鎳離子螯合磁珠重新懸浮，然后通過(guò)磁性分離，收集上清液；

(6)將步驟(5)收集的上清液利用分子量為3kD的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液即為純化的融合蛋白。

所述鎳離子螯合磁珠的商品名稱為BeaverBeads^TM IDA-Nickel，具體可為蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為70501-5。

所述Buffer A可為含500mM NaCl和10mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

所述Buffer B可為含500mM NaCl和50mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

所述Buffer C可為含500mM NaCl和500mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

所述“用蛋白酶進(jìn)行酶切”步驟如下：向步驟(3)純化的融合蛋白，加入酶切buffer和腸激酶，得到酶切反應(yīng)體系(酶切反應(yīng)體系中，融合蛋白的濃度為1mg/mL，腸激酶的加入量為每100μg融合蛋白乙加入1U腸激酶)；然后21℃酶切16h，收集上清液。

所述“分離目的物”可采用陽(yáng)離子交換層析進(jìn)行分離。所述陽(yáng)離子交換層析柱為美國(guó)GE公司的SP-Sepharose fast flow(5×1mL)。具體步驟如下：

(1)將1體積份步驟(4)收集的上清液和3體積份pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液混合，得到混合液；然后將混合液用0.22μM的濾膜過(guò)濾，得到上樣液；

(2)取SP-Sepharose fast flow(5×1mL)，先用10個(gè)柱體積的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液預(yù)平衡；

(3)完成步驟(2)后，取步驟(1)得到的上樣液，進(jìn)行上樣；

(4)完成步驟(3)后，用10個(gè)柱體積的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液洗脫至紫外檢測(cè)基線平穩(wěn)(檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm)；

(5)完成步驟(4)后，用含400mM NaCl的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰約5-10mL的洗脫溶液。

所述醋酸化的步驟可為：調(diào)節(jié)步驟(5)分離的目的物的pH值至1.0-3.0，然后加入醋酸鈉處理40-80min。所述醋酸化的步驟具體可為：取步驟(5)分離的目的物，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，得到溶液1；取1體積份溶液1，加入3體積份濃度為333mM的醋酸鈉水溶液，得到溶液2；取所述溶液2，室溫放置60min。

所述脫鹽可為反相色譜脫鹽。所述脫鹽的具體步驟如下：

(1)取Amberchrom CG300md resin，用10個(gè)柱體積的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脫至電導(dǎo)率基線平穩(wěn)；

(2)完成步驟(1)后，用10個(gè)柱體積的濃度為250mM醋酸鈉水溶液洗脫至pH值基線平穩(wěn)；

(3)完成步驟(2)后，取步驟5得到的溶液3，進(jìn)行上樣；

(4)完成步驟(3)后，用10個(gè)柱體積的濃度為250mM醋酸鈉水溶液洗脫至pH值基線平穩(wěn)。

(5)完成步驟(4)后，用10個(gè)柱體積的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脫(流速為5mL/min)至電導(dǎo)率基線平穩(wěn)；

(6)完成步驟(5)后，用40％(v/v)乙醇水溶液洗脫(流速為2mL/min)，收集洗脫峰約5-10mL的洗脫溶液。

所述Amberchrom CG300md resin具體可為北京慧德易科技有限責(zé)任公司的產(chǎn)品。

上述方法中，所述蛋白酶對(duì)于所述融合基因Ⅰ或融合基因Ⅱ的表達(dá)產(chǎn)物的酶切位置為特定氨基酸殘基與其前一位氨基酸殘基之間；所述特定氨基酸殘基為目的物的第一個(gè)氨基酸殘基。所述蛋白酶具體可為腸激酶。

上述方法中，所述目的物可為鮭魚降鈣素。

上述任一所述鮭魚降鈣素的前體可為氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白質(zhì)。

實(shí)驗(yàn)證明，將重組質(zhì)粒pBO-sCT2301或重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ導(dǎo)入油菜品種中雙4號(hào)，得到轉(zhuǎn)基因植物，然后培養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步得到鮭魚降鈣素；將重組質(zhì)粒pBO-G2301導(dǎo)入油菜品種中雙4號(hào)，得到轉(zhuǎn)基因植物，然后培養(yǎng)該轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)一步得到狂犬病病毒CVS株糖蛋白(GenBank號(hào)為KF660244.1)?？梢?jiàn)，利用本發(fā)明所提供的方法可以表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1步驟二中6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為實(shí)施例1步驟二中7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖3為實(shí)施例1步驟二中7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4為實(shí)施例1步驟二中7的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖5為實(shí)施例1步驟二8中(1)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖6為實(shí)施例1步驟二8中(2)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖7為實(shí)施例1中步驟三的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖8為實(shí)施例1中步驟四的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖9為實(shí)施例3步驟二中8的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖10為實(shí)施例3中步驟三的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

油菜品種中雙4號(hào)記載于如下文獻(xiàn)中：羅曉輝，葉明海.“中雙4號(hào)”育苗移栽高產(chǎn)栽培[J].上海農(nóng)業(yè)科技，1999年05期.在下文中，油菜品種中雙4號(hào)簡(jiǎn)稱中雙4號(hào)。

油菜品種青油14號(hào)記載于如下文獻(xiàn)中：蘇有志.甘藍(lán)型春油菜新品種—青油14號(hào)[J].中國(guó)農(nóng)技推廣，1997年03期.在下文中，油菜品種青油14號(hào)簡(jiǎn)稱青油14號(hào)。

豫芝4號(hào)記載于如下文獻(xiàn)中：曹玉平.豫芝4號(hào).農(nóng)業(yè)科技通訊，1991年11期.

芝麻油體蛋白的GenBank號(hào)為AAB58402.1。油菜油體蛋白的GenBank號(hào)為X94225.1?？袢〔《綜VS株糖蛋白的GenBank號(hào)為KF660244.1。

下述實(shí)施例中的光暗交替培養(yǎng)(即光照培養(yǎng)和暗培養(yǎng)交替)的條件為：25℃。光照培養(yǎng)時(shí)的光照強(qiáng)度為15000Lx。光暗交替培養(yǎng)的周期具體為：14h光照培養(yǎng)/10h黑暗培養(yǎng)。

MS₀培養(yǎng)基：將NH₄NO₃ 1650mg、KNO₃ 1900mg、KH₂PO₄ 170mg、MgSO₄·7H₂O 370mg、CaCl₂·2H₂O 440mg、FeSO₄·7H₂O 27.80mg、Na₂EDTA 37.30mg、MnSO₄·4H₂O 22.30mg、ZnSO₄·7H₂O 8.60mg、H₃BO₃ 6.20mg、KI 0.83mg、Na₂M_OO₄·2H₂O 0.25mg、CuSO₄·5H₂O 0.025mg、C_OCl₂·6H₂O 0.025mg、肌醇100.00mg、VB₁0.1mg、VB₆0.5mg、煙酸0.5mg、甘氨酸2.0mg和瓊脂7g溶于1L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至5.8。

載體pUC57為百奧邁科生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為BK0033。載體pEASY-T1為北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為CT101。載體pCAMBIA2301為華越洋生物(北京)科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為VECT0310。λDNA/EcoRI+HindⅢMarker為北京康潤(rùn)生物科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為M125-01。粉碎機(jī)為紹興市科宏儀器有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品型號(hào)為EW-100。鮭魚降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品為北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司合成。密鈣息為Novartis Pharma Stein AG公司的產(chǎn)品。

載體pTΩ4a：將載體pUC19的限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列10所示的DNA分子得到的重組質(zhì)粒。載體pUC19為TaKaRa公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為D3219。

實(shí)施例1、利用轉(zhuǎn)基因油菜油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鮭魚降鈣素

一、重組質(zhì)粒pBO-sCT2301的構(gòu)建

1、人工合成序列表中序列1所示的雙鏈DNA分子。序列表中序列1中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的識(shí)別序列，第7至21位為腸激酶的識(shí)別序列，第22至120位為鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(以下簡(jiǎn)稱sCT基因)，第121至126位為兩個(gè)終止密碼子，第127至132位為限制性內(nèi)切酶XhoⅠ的識(shí)別序列。

2、將步驟1合成的雙鏈DNA分子連接至載體pUC57，得到重組質(zhì)粒psCT。

3、提取豫芝4號(hào)開(kāi)花后5周的種子的總RNA，然后該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到芝麻的cDNA。以芝麻的cDNA為模板，采用引物Olem5：

5′-CTGCAGATGCATCATCACCATCATCATGCGGACGAACC-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列)和引物Olem3：5′-ATGGGATCCCGGTCTTATTACATCTTGGCTTC-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)條件為：94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

經(jīng)測(cè)序，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中的序列2所示。序列表中序列2中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列，第7至9位為起始密碼子ATG(編碼甲硫氨酸)，第10至27位為編碼6×His標(biāo)簽的核苷酸序列，第28至456位為編碼芝麻油體蛋白自N末端起第2至144位的核苷酸序列，第457至462位為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別序列。

4、將步驟3獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接至載體pEASY-T1，得到重組質(zhì)粒甲。

5、用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI雙酶切重組質(zhì)粒甲，回收465bp的DNA片段甲。

6、用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI雙酶切載體pTΩ4a，回收約2.7kb的載體骨架甲。

7、將DNA片段甲和載體骨架甲進(jìn)行連接，得到中間載體甲。

8、用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒psCT，回收132bp的DNA片段乙。

9、用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切中間載體甲，回收約3.0kb的載體骨架乙。

10、將DNA片段乙和載體骨架乙進(jìn)行連接，得到中間載體乙。

11、以油菜品種青油14的基因組DNA為模板，采用引物NP5：

5′-ATTCAAGCTTGTCGGATCATGACGTTTCCAG-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶HindⅢ的識(shí)別序列)和引物NP3：5′-GCTTCTGCAGAATTGAGAGAGATCGAAGAG-3′(下劃線為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)條件為：94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

經(jīng)測(cè)序，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中的序列3所示。序列表中的序列3中，自5′末端起第5至10位為限制性內(nèi)切酶HindⅢ的識(shí)別序列，第11至885位為油菜油體蛋白的啟動(dòng)子的核苷酸序列，第896至901位為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列。

12、用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和PstI雙酶切步驟11獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收905bp的DNA片段丙。

13、用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和PstI雙酶切中間載體乙，回收約3.1kb的載體骨架丙。

14、將DNA片段丙和載體骨架丙進(jìn)行連接，得到中間載體丙。

15、用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI雙酶切中間載體丙，回收約2.0kb的DNA片段丁。

16、用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI雙酶切載體pCAMBIA2301，回收約11.6kb的載體骨架丁。

17、將DNA片段丁和載體骨架丁進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pBO-sCT2301。

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pBO-sCT2301進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將載體pCAMBIA2301的限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRI識(shí)別序列間的小片段替換為序列表中序列4所示的DNA分子。重組質(zhì)粒pBO-sCT2301表達(dá)序列表中序列5所示的融合蛋白甲。

序列表中序列4中，自5′末端起第1至875位為油菜油體蛋白的啟動(dòng)子的核苷酸序列，第886至891位為限制性內(nèi)切酶PstI的識(shí)別序列，第892至894位為起始密碼子ATG(編碼甲硫氨酸)，第895至912位為編碼6×His標(biāo)簽的核苷酸序列，第913至1341位為編碼芝麻油體蛋白自N末端起第2至144位的核苷酸序列，第1342至1347位為限制性內(nèi)切酶BamHI的識(shí)別序列，第1348至1362位為腸激酶的識(shí)別序列，第1363至1461位為鮭魚降鈣素的前體的編碼基因，第1462至1467位為兩個(gè)終止密碼子，第1468至1473位為限制性內(nèi)切酶XhoⅠ的識(shí)別序列，第1474至1721位為Nos polyA終止子的核苷酸序列。

序列表中序列5中，自N末端起第1位為甲硫氨酸(起始氨基酸)，第2至7位為6×His標(biāo)簽，第8至150位為芝麻油體蛋白自N末端起第2至144位，第153至157位為腸激酶的識(shí)別位點(diǎn)，第158至190位為鮭魚降鈣素的前體。

二、油菜遺傳轉(zhuǎn)化

1、農(nóng)桿菌侵染液的制備

(1)采用電擊法將重組質(zhì)粒pBO-sCT2301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，命名為L(zhǎng)BA4404/pBO-sCT2301。

(2)將LBA4404/pBO-sCT2301的單克隆接種至5mL含100mg/L卡那霉素(Kanamycin，Kan)和50mg/L利福平(Rifampicin，Rif)的YEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到培養(yǎng)菌液1。

(3)將1mL培養(yǎng)菌液1接種至50mL含100mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD_600nm值為0.3～0.4，得到培養(yǎng)菌液2。

(4)取步驟(3)得到的培養(yǎng)菌液2，4℃、5000rpm離心5min，收集菌體1。

(5)取步驟(4)收集的菌體1，用含1.0mg/L 6-BA的MS₀培養(yǎng)基重懸，然后4℃、5000rpm離心5min，收集菌體2。

(6)取步驟(5)收集的菌體2，用含100mg/L乙酰丁香酮(Acetosyringone，As)的MS₀培養(yǎng)基重懸，得到農(nóng)桿菌侵染液。以含100mg/L As的MS₀培養(yǎng)基為參照，調(diào)整農(nóng)桿菌侵染液的OD_600nm值至0.15～0.25。

2、中雙4號(hào)的子葉的獲得

取中雙4號(hào)的種子，先用75％(v/v)的乙醇水溶液浸泡2min，然后用次氯酸鈉水溶液(由1體積份次氯酸鈉溶液(有效氯≥10.0)和4體積份水混合而成)浸泡10min，最后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，瀝干后接種于MS₀培養(yǎng)基上，光暗交替培養(yǎng)5d，得到中雙4號(hào)的材料。

取中雙4號(hào)的材料，剪取子葉(盡量靠近生長(zhǎng)點(diǎn))，得到中雙4號(hào)的子葉。

3、侵染

取步驟2獲得的中雙4號(hào)的子葉，置于離心管，然后加入農(nóng)桿菌侵染液(OD_600nm值為0.2)浸泡10min。

4、共培養(yǎng)

完成步驟3后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)共培養(yǎng)4d。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：含1.25mg/L NAA、5.0mg/L 6-BA和5.0mg/L AgNO₃的MS₀培養(yǎng)基。

共培養(yǎng)條件：25℃，暗培養(yǎng)。

5、選擇培養(yǎng)

完成步驟4后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)，光暗交替培養(yǎng)4d。

選擇培養(yǎng)基：含1.0mg/L NAA、3.0mg/L 6-BA和100mg/L頭孢噻吩(cefalotin，Cf)的MS₀培養(yǎng)基。

6、分化培養(yǎng)

完成步驟5后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)，光暗交替培養(yǎng)4周，得到長(zhǎng)約1cm的分化芽(見(jiàn)圖1)。

分化培養(yǎng)基：含0.2mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA、40mg/L Kan、100mg/L Cf的MS₀培養(yǎng)基。

7、生根培養(yǎng)

完成步驟6后，將所述分化芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，光暗交替培養(yǎng)2周，獲得擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜(見(jiàn)圖2和圖3)，然后將擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜移栽至營(yíng)養(yǎng)土正常培養(yǎng)(見(jiàn)圖4)。

生根培養(yǎng)基：含100mg/L Kan和100mg/L Cf的MS₀培養(yǎng)基。

隨機(jī)選擇6株擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜，依次命名為Siv1、Siv3、Siv4、Siv7、Siv11和Siv12。

8、分子檢測(cè)

(1)PCR檢測(cè)

分別提取步驟7獲得的6株擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜葉片的基因組DNA并作為模板，以CT5：

5'-GCCGGTCTCATTCTTACC-3'和CT3：5'-CTCAGCCTCGAGTTACTATCC-3'為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用等體積超純水代替擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的葉片的基因組DNA，作為陰性對(duì)照。用等體積重組質(zhì)粒pBO-sCT2301的DNA代替擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的葉片的基因組DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保持。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5(泳道1為λDNA/EcoRI+HindⅢMarker，泳道2為Siv1，泳道3為Siv3，泳道4為Siv4，泳道5為Siv7，泳道6為Siv11，泳道7為Siv12，泳道8為陽(yáng)性對(duì)照，泳道9為陰性對(duì)照)。結(jié)果表明，如果以擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的葉片的基因組DNA為模板，能夠擴(kuò)增出約433bp的條帶，則該擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜即為轉(zhuǎn)sCT基因油菜；陰性對(duì)照不能獲得433bp的條帶；陽(yáng)性對(duì)照可以獲得433bp的條帶。

(2)RT-PCR檢測(cè)

編碼芝麻油體蛋白的基因(以下簡(jiǎn)稱芝麻油體基因)是在種子中特異表達(dá)的基因，一般在開(kāi)花后4-6周的種子中開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，9-11周的種子中mRNA的含量達(dá)到最高水平，種子的成熟后期的mRNA含量急劇降低。

(a)提取待測(cè)油菜(Siv1、Siv3、Siv4、Siv7、Siv11或Siv12)開(kāi)花后9-11周的種子的總RNA，然后該總RNA用M-MLV反轉(zhuǎn)錄出第一鏈cDNA，得到待測(cè)油菜的cDNA。待測(cè)油菜的cDNA中，DNA濃度為500ng/μL。

(b)以步驟(a)得到的待測(cè)油菜的cDNA為模板，以CT5：5'-GCCGGTCTCATTCTTACC-3'和CT3：5'-CTCAGCCTCGAGTTACTATCC-3'為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用等體積超純水代替待測(cè)油菜的cDNA，作為陰性對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保持。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6(泳道1為λDNA/EcoRI+HindⅢMarker，泳道2為Siv1，泳道3為Siv3，泳道4為Siv4，泳道5為陰性對(duì)照)。結(jié)果表明，如果以擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜的cDNA為模板，能夠擴(kuò)增出約433bp的條帶，則該擬轉(zhuǎn)sCT基因油菜即為轉(zhuǎn)sCT基因油菜，說(shuō)明sCT基因已經(jīng)整合到中雙4號(hào)的基因組，并轉(zhuǎn)錄表達(dá)；陰性對(duì)照不能獲得433bp的條帶。

PCR檢測(cè)和RT-PCR檢測(cè)的結(jié)果完全一致。因此，Siv1、Siv3、Siv4、Siv7、Siv11和Siv12均為轉(zhuǎn)sCT基因油菜。

待Siv1成熟后收集種子，然后進(jìn)行繁育和PCR檢測(cè)，直至獲得純合種子。將該純合種子命名為Siv1種子，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、鮭魚降鈣素的提取和純化

1、轉(zhuǎn)sCT基因油菜油體的提取

提取緩沖液為含2.5mM EDTA和500mM NaCl的pH8.0、20mM Tris-HCl緩沖液。

(1)取5g步驟二收集的Siv1種子，用粉碎機(jī)粉碎(粉碎程度200目)，得到油菜籽粉。

(2)完成步驟(1)后，取離心管(規(guī)格為50mL)，加入油菜籽粉和30mL提取緩沖液，充分混勻，然后置于冰上30min。

(3)完成步驟(2)后，取所述離心管，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體甲，下層為溶液甲。

(4)完成步驟(3)后，取一新的離心管(規(guī)格為50mL)，加入收集的油體甲和30mL提取緩沖液，充分混勻，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體乙，下層為溶液乙。

(5)完成步驟(4)后，取一新的離心管(規(guī)格為50mL)，加入收集的油體乙和30mL提取緩沖液，充分混勻，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體丙，下層為溶液丙。

收集油體丙，備用。

2、His-tag初步純化

鎳離子螯合磁珠的商品名稱為BeaverBeads^TM IDA-Nickel，具體為蘇州海貍生物醫(yī)學(xué)工程有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品編號(hào)為70501-5。

Buffer A為含500mM NaCl和10mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

Buffer B為含500mM NaCl和50mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

Buffer C為含500mM NaCl和500mM咪唑的pH7.4、20mM磷酸鈉緩沖液。

(1)取離心管，加入油體丙和30mL Buffer A，充分混勻，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體丁，下層為溶液丁。

(2)取一新的離心管，加入油體丁和10mL Buffer A，充分混勻；然后加入1mL鎳離子螯合磁珠，充分懸浮后置于旋轉(zhuǎn)混合儀上溫育60min；最后通過(guò)磁性分離，將所述鎳離子螯合磁珠轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

(3)完成步驟(2)后，取裝有所述鎳離子螯合磁珠的離心管，加入10mL Buffer B，用移液器輕輕吹打數(shù)次，使所述鎳離子螯合磁珠重新懸浮，然后通過(guò)磁性分離，將所述鎳離子螯合磁珠轉(zhuǎn)移到新的離心管中。

(4)重復(fù)步驟(3)兩次。

(5)完成步驟(4)后，取裝有所述鎳離子螯合磁珠的離心管，加入5mL Buffer C，用移液器輕輕吹打數(shù)次，使所述鎳離子螯合磁珠重新懸浮，然后通過(guò)磁性分離，收集上清液。

(6)將步驟(5)收集的上清液利用分子量為3kD的超濾管進(jìn)行超濾濃縮，獲得融合蛋白乙的濃縮液。

鮭魚降鈣素主要用于治療骨質(zhì)疏松癥。通過(guò)基因工程法生產(chǎn)鮭魚降鈣素，主要是在大腸桿菌或酵母中表達(dá)鮭魚降鈣素，但由于鮭魚降鈣素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表達(dá)出的鮭魚降鈣素的生物學(xué)活性僅為100-200U/mg；而天然的鮭魚降鈣素的生物學(xué)活性為4500U/mg。已有研究結(jié)果表明，鮭魚降鈣素的前體(氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示)通過(guò)植物自身的酰胺化系統(tǒng)，可轉(zhuǎn)化為鮭魚降鈣素。

融合蛋白乙的氨基酸序列如序列表中序列6所示，且其C末端酰胺化。融合蛋白乙在轉(zhuǎn)sCT基因油菜體內(nèi)經(jīng)過(guò)如下轉(zhuǎn)化得到：轉(zhuǎn)sCT基因油菜中首先表達(dá)融合蛋白甲，之后通過(guò)自身的酰胺化系統(tǒng)，將融合蛋白甲轉(zhuǎn)化為C末端酰胺化的融合蛋白乙。

3、腸激酶酶切

(1)取融合蛋白乙的濃縮液，加入酶切buffer和腸激酶，得到酶切反應(yīng)體系；酶切反應(yīng)體系中，融合蛋白乙的濃度為1mg/mL，腸激酶的加入量為每100μg融合蛋白乙加入1U腸激酶。

酶切buffer和腸激酶均為大腸桿菌表達(dá)重組腸激酶中的組件；大腸桿菌表達(dá)重組腸激酶具體可為上海翊圣生物科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為20401ES80。

(2)完成步驟(1)后，取所述酶切反應(yīng)體系，先21℃酶切16h，然后4℃、15000g離心20min，收集上清液。

4、陽(yáng)離子交換純化

將步驟3收集的上清液在AKTA蛋白純化系統(tǒng)上經(jīng)陽(yáng)離子交換層析純化，得到鮭魚降鈣素溶液。具體步驟如下：

(1)將1體積份步驟3收集的上清液和3體積份pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液混合，得到混合液(電導(dǎo)率為7mS/cm)；然后將混合液用0.22μM的濾膜過(guò)濾，得到上樣液。

(2)取SP-Sepharose fast flow(5×1mL)(美國(guó)GE公司的產(chǎn)品)，先用10個(gè)柱體積的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液預(yù)平衡(流速為1mL/min)。

(3)完成步驟(2)后，取步驟(1)得到的上樣液，進(jìn)行上樣(流速為0.5mL/min)。

(4)完成步驟(3)后，用10個(gè)柱體積的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液洗脫(流速為1mL/min)至紫外檢測(cè)基線平穩(wěn)(檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm)。

(5)完成步驟(4)后，用含400mM NaCl的pH3.0、10mM檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫(流速為0.5mL/min)，收集洗脫峰約5-10mL的洗脫溶液。

5、醋酸化

(1)取步驟4收集的洗脫溶液，先加入磷酸調(diào)節(jié)pH值至2.0，得到溶液1。

(2)取1體積份溶液1，加入3體積份濃度為333mM的醋酸鈉水溶液，混合均勻，得到溶液2。

(3)取所述溶液2，室溫放置60min，得到溶液3。

6、反相色譜脫鹽及凍干

Amberchrom CG300md resin為北京慧德易科技有限責(zé)任公司的產(chǎn)品。

(1)取Amberchrom CG300md resin，用10個(gè)柱體積的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脫(流速為5mL/min)至電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

(2)完成步驟(1)后，用10個(gè)柱體積的濃度為250mM醋酸鈉水溶液洗脫(流速為5mL/min)至pH值基線平穩(wěn)。

(3)完成步驟(2)后，取步驟5得到的溶液3，進(jìn)行上樣(流速2mL/min)。

(4)完成步驟(3)后，用10個(gè)柱體積的濃度為250mM醋酸鈉水溶液洗脫(流速為5mL/min)至pH值基線平穩(wěn)。

(5)完成步驟(4)后，用10個(gè)柱體積的0.1％(v/v)醋酸水溶液洗脫(流速為5mL/min)至電導(dǎo)率基線平穩(wěn)。

(6)完成步驟(5)后，用40％(v/v)乙醇水溶液洗脫(流速為2mL/min)，收集洗脫峰約5-10mL的洗脫溶液。

(7)用冷凍干燥機(jī)將步驟(6)收集的洗脫溶液凍干至粉末，即鮭魚降鈣素粉末。-20℃?zhèn)溆谩?/p>

取1mg鮭魚降鈣素粉末，加入1mL超純水溶解，得到鮭魚降鈣素溶液。

將鮭魚降鈣素溶液和濃度為1mg/mL鮭魚降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液進(jìn)行SDS-PAGE。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖7(1為蛋白Marker，2為鮭魚降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，3為鮭魚降鈣素溶液)。結(jié)果表明，鮭魚降鈣素溶液中含有鮭魚降鈣素，純度約90％。每10g步驟二收集的Siv1種子產(chǎn)生0.2mg鮭魚降鈣素(以100％純度計(jì))。

四、鮭魚降鈣素的HPLC檢測(cè)

使用配有Agilent Zorbax SB C18柱(5.0μm，150mm×2.1mm)的Agilent 1200液相色譜儀分析步驟三中的鮭魚降鈣素溶液和濃度為1mg/mL的鮭魚降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液。進(jìn)樣量20μL。流動(dòng)相由0.1％(v/v)三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)水溶液(A液)和0.1％(v/v)TFA乙腈溶液(B液)組成，流速為0.2mL/min，使用流動(dòng)相中B液遞增、A液遞減的梯度洗脫條件進(jìn)行梯度洗脫，具體如下(％均為體積百分比)：0-8min，流動(dòng)相中B液的體積百分含量由10％勻速升至30％；8-50min，流動(dòng)相中B液的體積百分含量由30％勻速升至55％；50-55min，流動(dòng)相中B液的體積百分含量由55％勻速升至100％。檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8(A為鮭魚降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，B為步驟三中的鮭魚降鈣素溶液)：步驟三中的鮭魚降鈣素溶液與鮭魚降鈣素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液的目的峰出峰時(shí)間基本一致(見(jiàn)圖8中箭頭標(biāo)注，出峰時(shí)間約為6.0min)。結(jié)果表明，步驟三中的鮭魚降鈣素溶液中含有鮭魚降鈣素。

五、檢測(cè)鮭魚降鈣素的生物學(xué)活性

Vr:CD1(ICR)小鼠為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。鈣測(cè)定試劑盒為北京中生北控生物科技股份有限公司的產(chǎn)品。

1、取30只體重為24-26g的健康Vr:CD1(ICR)小鼠，隨機(jī)分成鮭魚降鈣素組、密鈣息組和生理鹽水組(每組10只，雌雄各半)，禁食10-12h(僅給蒸餾水)后，分別進(jìn)行如下處理：

鮭魚降鈣素組：尾靜脈注射步驟三中的鮭魚降鈣素溶液(注射劑量為0.1mL/只)；

密鈣息組：尾靜脈注射密鈣息(注射劑量為0.5IU/只)；

生理鹽水組：尾靜脈注射0.9％(0.9mg/100mL)生理鹽水(注射劑量為0.1mL/只)。

2、完成步驟1 60min后，每只小鼠先腹腔注射10％(10mg/100mL)水合氯醛水溶液(注射劑量為0.15mL/只)，再分別從眼眶取血，室溫靜置2h；最后3000g離心15min，上清液即為血清。

3、完成步驟2后，取血清，按照鈣測(cè)定試劑盒的操作步驟，用全自動(dòng)生化分析測(cè)定每只小鼠的血鈣濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，密鈣息組小鼠的血鈣濃度比生理鹽水組降低20％，鮭魚降鈣素組小鼠的血鈣濃度比生理鹽水組降低23％，方差分析差異極顯著。因此，使用步驟一至步驟三的方法獲得的鮭魚降鈣素溶液具有降低血鈣的生物學(xué)活性。

表1

實(shí)施例2、利用轉(zhuǎn)基因油菜油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)鮭魚降鈣素

按照實(shí)施例1步驟一至步驟三的方法，將步驟一中的重組質(zhì)粒pBO-sCT2301替換為重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ，其它步驟均不變，得到鮭魚降鈣素溶液；每10g油菜種子產(chǎn)生0.16mg鮭魚降鈣素(以100％純度計(jì))。

重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ的構(gòu)建方法為：按照實(shí)施例1步驟一的方法，將步驟1中“人工合成序列表中序列1所示的雙鏈DNA分子”替換為“人工合成序列表中序列7所示的雙鏈DNA分子”，其它步驟均不變，得到重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ。重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ也表達(dá)序列表中序列5所示的融合蛋白甲。

序列表中序列7中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的識(shí)別序列，第7至21位為腸激酶的識(shí)別序列，第22至120位為鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(以下簡(jiǎn)稱sCT-DZ基因)，第121至126位為兩個(gè)終止密碼子，第127至132位為限制性內(nèi)切酶XhoⅠ的識(shí)別序列。重組質(zhì)粒pBO-sCT2301和重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ的唯一不同在于：重組質(zhì)粒pBO-sCT2301的鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(即sCT基因)為序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示，重組質(zhì)粒pBO-sCT2301-DZ的鮭魚降鈣素的前體的編碼基因(即sCT-DZ基因)為序列表中序列7自5′末端起第22至120位所示。

實(shí)施例3、利用轉(zhuǎn)基因油菜油體表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)狂犬病病毒CVS株糖蛋白

一、重組質(zhì)粒pBO-G2301的構(gòu)建

1、人工合成序列表中序列8所示的雙鏈DNA分子。序列表中序列8中，自5′末端起第1至6位為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ的識(shí)別序列，第7至30位為編碼8×His標(biāo)簽的核苷酸序列，第31至1347位為狂犬病病毒CVS株糖蛋白(以下簡(jiǎn)稱G蛋白)的編碼基因(以下簡(jiǎn)稱G基因)，第1348至1353位為兩個(gè)終止密碼子，第1354至1359位為限制性內(nèi)切酶XhoⅠ的識(shí)別序列。

2、將步驟1合成的雙鏈DNA分子連接至載體pUC57，得到重組質(zhì)粒phG。

3、用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒phG，回收1359bp的DNA片段1。

4、用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切實(shí)施例1步驟一構(gòu)建的重組質(zhì)粒pBO-sCT2301，回收約13.0kb的載體骨架1。

5、將DNA片段1和載體骨架1進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pBO-G2301。重組質(zhì)粒pBO-G2301表達(dá)序列表中序列9所示的融合蛋白。序列表中序列9中，自N末端起第1位為甲硫氨酸(起始氨基酸)，第2至7位為6×His標(biāo)簽，第8至150位為芝麻油體蛋白自N末端起第2至144位，第153至160位為8×His標(biāo)簽，第161至599位為G蛋白。

重組質(zhì)粒pBO-sCT2301和重組質(zhì)粒pBO-G2301的唯一不同在于：重組質(zhì)粒pBO-sCT2301的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ識(shí)別序列間的小片段為序列表中序列1自5′末端起第7至126位所示的DNA分子，重組質(zhì)粒pBO-G2301的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ識(shí)別序列間的小片段為序列表中序列8自5′末端起第7至1353位所示的DNA分子。

二、油菜遺傳轉(zhuǎn)化

1、農(nóng)桿菌侵染液的制備

(1)采用電擊法將重組質(zhì)粒pBO-G2301導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌，命名為L(zhǎng)BA4404/pBO-G2301。

(2)將LBA4404/pBO-G2301的單克隆接種至5mL含100mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)12h，得到培養(yǎng)菌液甲。

(3)將1mL培養(yǎng)菌液甲接種至50mL含100mg/L Kan和50mg/L Rif的YEB液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)至OD_600nm值為0.3～0.4，得到培養(yǎng)菌液乙。

(4)取步驟(3)得到的培養(yǎng)菌液乙，4℃、5000rpm離心5min，收集菌體甲。

(5)取步驟(4)收集的菌體甲，用含1.0mg/L 6-BA的MS₀培養(yǎng)基重懸，然后4℃、5000rpm離心5min，收集菌體乙。

(6)取步驟(5)收集的菌體乙，用含100mg/L As的MS₀培養(yǎng)基重懸，得到農(nóng)桿菌侵染液。以含100mg/L As的MS₀培養(yǎng)基為參照，調(diào)整農(nóng)桿菌侵染液的OD_600nm值至0.15～0.25。

2、中雙4號(hào)的子葉的獲得

取中雙4號(hào)的種子，先用75％(v/v)的乙醇水溶液浸泡2min，然后用次氯酸鈉水溶液(由1體積份次氯酸鈉溶液(有效氯≥10.0)和4體積份水混合而成)浸泡10min，最后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，瀝干后接種于MS₀培養(yǎng)基上，光暗交替培養(yǎng)5d，得到中雙4號(hào)的材料。

取中雙4號(hào)的材料，剪取子葉(盡量靠近生長(zhǎng)點(diǎn))，得到中雙4號(hào)的子葉。

3、侵染

取步驟2獲得的中雙4號(hào)的子葉，置于離心管，然后加入農(nóng)桿菌侵染液(OD_600nm值為0.2)浸泡10min。

4、共培養(yǎng)

完成步驟3后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)共培養(yǎng)4d。

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：含1.25mg/L NAA、5.0mg/L 6-BA和5.0mg/L AgNO₃的MS₀培養(yǎng)基。

共培養(yǎng)條件：25℃，暗培養(yǎng)。

5、選擇培養(yǎng)

完成步驟4后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)，光暗交替培養(yǎng)4d。

選擇培養(yǎng)基：含1.0mg/L NAA、3.0mg/L 6-BA和100mg/L頭孢噻吩(cefalotin，Cf)的MS₀培養(yǎng)基。

6、分化培養(yǎng)

完成步驟5后，將所述中雙4號(hào)的子葉轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上(子葉需正面朝上)，光暗交替培養(yǎng)4周，得到長(zhǎng)約1cm的分化芽。

分化培養(yǎng)基：含0.2mg/L NAA、2.0mg/L 6-BA、40mg/L Kan、100mg/L Cf的MS₀培養(yǎng)基。

7、生根培養(yǎng)

完成步驟6后，將所述分化芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上，光暗交替培養(yǎng)2周，獲得擬轉(zhuǎn)G基因油菜。

生根培養(yǎng)基：含100mg/L Kan和100mg/L Cf的MS₀培養(yǎng)基。

隨機(jī)選擇3株擬轉(zhuǎn)G基因油菜，依次命名為BG1、BG2和BG3。

8、分子檢測(cè)

分別提取步驟7獲得的3株擬轉(zhuǎn)G基因油菜葉片的基因組DNA并作為模板，以G5：

5’-CCATATATACCATCCCGGAC-3’和G3：5’-CTCTTATCGTAAGGGTCCAAG-3’為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用等體積超純水代替擬轉(zhuǎn)G基因油菜的葉片的基因組DNA，作為陰性對(duì)照。用等體積重組質(zhì)粒pBO-G2301的DNA代替擬轉(zhuǎn)G基因油菜的葉片的基因組DNA，作為陽(yáng)性對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火1min，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保持。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，取10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9(泳道1為λDNA/EcoRI+HindⅢMarker，泳道2為BG1，泳道3為BG2，泳道4為BG3，泳道5為陰性對(duì)照)。結(jié)果表明，如果以擬轉(zhuǎn)G基因油菜的葉片的基因組DNA為模板，能夠擴(kuò)增出約436bp的條帶，則該擬轉(zhuǎn)G基因油菜即為轉(zhuǎn)G基因油菜；陰性對(duì)照不能獲得436bp的條帶；陽(yáng)性對(duì)照可以獲得436bp的條帶。

因此，BG1、BG2和BG3均為轉(zhuǎn)G基因油菜。

待BG1成熟后收集種子，然后進(jìn)行繁育和PCR檢測(cè)，直至獲得純合種子。將該純合種子命名為BG1種子，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

三、目的蛋白的檢測(cè)

提取步驟二收集的BG1種子的油體蛋白，具體步驟如下：

1、取5g步驟二收集的BG1種子，用粉碎機(jī)粉碎，得到油菜籽粉。

2、完成步驟1后，取離心管(規(guī)格為50mL)，加入油菜籽粉和30mL提取緩沖液，充分混勻，然后置于冰上30min。

3、完成步驟2后，取所述離心管，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體甲，下層為溶液甲。

4、完成步驟3后，取一新的離心管(規(guī)格為50mL)，加入收集的油體甲和30mL提取緩沖液，充分混勻，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體乙，下層為溶液乙。

5、完成步驟4后，取一新的離心管(規(guī)格為50mL)，加入收集的油體乙和30mL提取緩沖液，充分混勻，4℃、15000g離心30min。離心后，液相體系呈現(xiàn)兩層分層，上層為油體丙，下層為溶液丙。

6、完成步驟5后，取油體丙，加入1mL提取緩沖液，混勻，得到混合溶液。

7、取一新的離心管(規(guī)格為50mL)，加入500μL步驟6得到的混合溶液和1mL乙醚，充分混勻，4℃、12000g離心4min。離心后，液相體系呈現(xiàn)三層分層，收集中間相。

8、完成步驟7后，將收集的中間相置于一新的離心管(規(guī)格為50mL)中，然后加入1mL乙醚，4℃、12100g離心4min，收集上層液相。

9、向步驟8收集的上層液相中加入1mL乙醚，4℃、12100g離心4min，收集沉淀。

10、將步驟9收集的沉淀，冷凍抽干30min(目的為除去殘留的乙醚)，得到樣品甲。

11、將500μL氯仿和250μL甲醇充分混勻后洗滌樣品甲，然后4℃、12100g離心8min，收集沉淀。

12、將500μL氯仿、250μL甲醇和250μL無(wú)菌水充分混勻后洗滌步驟11收集的沉淀，然后4℃、12100g離心8min，收集沉淀。

13、將500μL氯仿、250μL甲醇和250μL無(wú)菌水充分混勻后洗滌步驟12收集的沉淀，然后4℃、12100g離心8min，收集沉淀。將該沉淀吹干，-70℃保存。步驟13收集的沉淀即為BG1種子的油體蛋白。

按照上述步驟，將BG1種子替換為中雙4號(hào)種子，其它步驟均不變，得到中雙4號(hào)種子的油體蛋白。

取步驟13收集的沉淀，加入水溶解，得到濃度為1mg/mL的BG1種子的油體蛋白溶液。

取中雙4號(hào)種子的油體蛋白，加入水溶解，得到濃度為1mg/mL的中雙4號(hào)種子的油體蛋白溶液。

將BG1種子的油體蛋白溶液和中雙4號(hào)種子的油體蛋白溶液進(jìn)行SDS-PAGE。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10(從左至右依次為：BG1種子的油體蛋白溶液、中雙4號(hào)種子的油體蛋白溶液和蛋白Marker)。結(jié)果表明，BG1種子的油體蛋白溶液中含有66.12kD的蛋白，與預(yù)期蛋白大小完全一致；而中雙4號(hào)種子的油體蛋白溶液中則不含有66.12kD的蛋白。

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所

<120> 一種表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的方法及其專用表達(dá)盒

<160> 10

<170> PatentInversion3.5

<210>1

<211>132

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ggatccgatg atgacgataa gtgctcaaac ttgtctacct gtgttcttgg taagttgtct 60

caggaacttc acaagttgca aacctaccca aggactaaca ctggttctgg aaccccagga 120

tagtaactcg ag 132

<210>2

<211>465

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ctgcagatgc atcatcacca tcatcatgcg gacgaacccc acgaccagcg ccccaccgac 60

gtcatcaaga gctacctccc cgaaaagggt ccctccacct ctcaagtcct cgccgtcgtg 120

accctcttcc ccctcggcgc cgtcctcctc tgcctagccg gtctcattct taccgggacc 180

atcatcggcc tcgccgtcgc caccccgctc ttcgtcatct tcagccccat cttggtcccc 240

gccgccctaa ccatcgccct agccgtcacc ggtttcttga cctccggagc tttcggcatc 300

accgccctgt cctcgatttc gtggttgctg aactacgtta ggcgaatgcg ggggagcttg 360

ccagagcagc tggatcatgc acggcggcgc gtgcaggaga cggtgggcca gaagacaagg 420

gaggcggggc agagaagcca agatgtaata agaccgggat cccat 465

<210>3

<211>905

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

attcaagctt gtcggatcat gacgtttcca gaaaacatcg agcaagctct caaagctgac 60

ctctttcgga tcgtactgaa cccgaacaat ctcgttatgc cccgtcgtct ccgaacagac 120

atcctcgtaa gtaggattgt cgacgaatcc atggctatac ccaacctccg tcttcgtcac 180

gcctggaacc ctctggtaag ccaattccgc tccccagaag caaccggcgc cgaattgcgc 240

gaattgctga ccaggcgaag gaacatcgtc gtcgggtcct tgtgcgattg cggaggaagc 300

cgccgggtcg ggttggggac gagacccgaa tccgagcctg gtgaataggt tgttcatcgg 360

agatttatag acggagatgg atcgagcggt tttggggaaa ggggaagtgg gtttggctct 420

tttggataga gagagtgcag ctttggcgag agactggaga ggtttagaga gagacacggc 480

ggagattacc ggaggagagg cgacgataga tagcattatc gaagggacgg gagaaagagt 540

gacgtggaga aataagaaac cgttaagagt cggatattta ttatattaaa agcccactgg 600

gcctaaaccc atttaaacaa gacaagataa atgggccgtg tgtgagtgtt aacgttcggt 660

ttcaaatgcc aacgccattg gaacaaaaca aacgtgtcct caagtaaacc cctgtcgttt 720

acacctcaat ggctgcatgg tgaagccatt aacacgtggc gtagaatgca tgacgacgcc 780

attgacacct gactctcttt ccttctcttc atatatctct aatcaattca acactcattg 840

tcatagctat tcggaaaata tatacacatc cttttctctt cgatctctct caattctgca 900

gaagc 905

<210>4

<211>1721

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gtcggatcat gacgtttcca gaaaacatcg agcaagctct caaagctgac ctctttcgga 60

tcgtactgaa cccgaacaat ctcgttatgc cccgtcgtct ccgaacagac atcctcgtaa 120

gtaggattgt cgacgaatcc atggctatac ccaacctccg tcttcgtcac gcctggaacc 180

ctctggtaag ccaattccgc tccccagaag caaccggcgc cgaattgcgc gaattgctga 240

ccaggcgaag gaacatcgtc gtcgggtcct tgtgcgattg cggaggaagc cgccgggtcg 300

ggttggggac gagacccgaa tccgagcctg gtgaataggt tgttcatcgg agatttatag 360

acggagatgg atcgagcggt tttggggaaa ggggaagtgg gtttggctct tttggataga 420

gagagtgcag ctttggcgag agactggaga ggtttagaga gagacacggc ggagattacc 480

ggaggagagg cgacgataga tagcattatc gaagggacgg gagaaagagt gacgtggaga 540

aataagaaac cgttaagagt cggatattta ttatattaaa agcccactgg gcctaaaccc 600

atttaaacaa gacaagataa atgggccgtg tgtgagtgtt aacgttcggt ttcaaatgcc 660

aacgccattg gaacaaaaca aacgtgtcct caagtaaacc cctgtcgttt acacctcaat 720

ggctgcatgg tgaagccatt aacacgtggc gtagaatgca tgacgacgcc attgacacct 780

gactctcttt ccttctcttc atatatctct aatcaattca acactcattg tcatagctat 840

tcggaaaata tatacacatc cttttctctt cgatctctct caattctgca gatgcatcat 900

caccatcatc atgcggacga accccacgac cagcgcccca ccgacgtcat caagagctac 960

ctccccgaaa agggtccctc cacctctcaa gtcctcgccg tcgtgaccct cttccccctc 1020

ggcgccgtcc tcctctgcct agccggtctc attcttaccg ggaccatcat cggcctcgcc 1080

gtcgccaccc cgctcttcgt catcttcagc cccatcttgg tccccgccgc cctaaccatc 1140

gccctagccg tcaccggttt cttgacctcc ggagctttcg gcatcaccgc cctgtcctcg 1200

atttcgtggt tgctgaacta cgttaggcga atgcggggga gcttgccaga gcagctggat 1260

catgcacggc ggcgcgtgca ggagacggtg ggccagaaga caagggaggc ggggcagaga 1320

agccaagatg taataagacc gggatccgat gatgacgata agtgctcaaa cttgtctacc 1380

tgtgttcttg gtaagttgtc tcaggaactt cacaagttgc aaacctaccc aaggactaac 1440

actggttctg gaaccccagg atagtaactc gaggctgagt aaggttaact ttgagtatta 1500

tggcattgga aaagccattg ttctgcttgt aatttactgt gttctttcag ttttgttttc 1560

ggacatcaag ttaaccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaat tttaccaaaa aaaaaaaaaa 1620

aaaaaaaaaa atttccccaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atttaaagag ctcgaatttc 1680

cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat t 1721

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<211>190

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Met His His His His His His Ala Asp Glu Pro His Asp Gln Arg Pro

1 5 10 15

Thr Asp Val Ile Lys Ser Tyr Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser Thr Ser

20 25 30

Gln Val Leu Ala Val Val Thr Leu Phe Pro Leu Gly Ala Val Leu Leu

35 40 45

Cys Leu Ala Gly Leu Ile Leu Thr Gly Thr Ile Ile Gly Leu Ala Val

50 55 60

Ala Thr Pro Leu Phe Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Ile Ala Leu Ala Val Thr Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe

85 90 95

Gly Ile Thr Ala Leu Ser Ser Ile Ser Trp Leu Leu Asn Tyr Val Arg

100 105 110

Arg Met Arg Gly Ser Leu Pro Glu Gln Leu Asp His Ala Arg Arg Arg

115 120 125

Val Gln Glu Thr Val Gly Gln Lys Thr Arg Glu Ala Gly Gln Arg Ser

130 135 140

Gln Asp Val Ile Arg Pro Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Cys Ser Asn

145 150 155 160

Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu

165 170 175

Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly

180 185 190

<210>6

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Met His His His His His His Ala Asp Glu Pro His Asp Gln Arg Pro

1 5 10 15

Thr Asp Val Ile Lys Ser Tyr Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser Thr Ser

20 25 30

Gln Val Leu Ala Val Val Thr Leu Phe Pro Leu Gly Ala Val Leu Leu

35 40 45

Cys Leu Ala Gly Leu Ile Leu Thr Gly Thr Ile Ile Gly Leu Ala Val

50 55 60

Ala Thr Pro Leu Phe Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Ile Ala Leu Ala Val Thr Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe

85 90 95

Gly Ile Thr Ala Leu Ser Ser Ile Ser Trp Leu Leu Asn Tyr Val Arg

100 105 110

Arg Met Arg Gly Ser Leu Pro Glu Gln Leu Asp His Ala Arg Arg Arg

115 120 125

Val Gln Glu Thr Val Gly Gln Lys Thr Arg Glu Ala Gly Gln Arg Ser

130 135 140

Gln Asp Val Ile Arg Pro Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Cys Ser Asn

145 150 155 160

Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu His Lys Leu

165 170 175

Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro

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<212>DNA

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<223>

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<223>

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ttggggccat ggtccccaat tgacatacat cacttatctt gcccgaataa cctagtagtg 120

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tcactccaca acccttatcc ggattatcac tggttgagaa ctgtccgaac aacaatcgaa 420

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tcacgtgtct ttcctggggg caagtgttcg ggtatcactg ttagttcgac gtactgttcg 540

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cttgtggtgg aagagttagt gaaaaagcgt gaagaatgcc tcgatgccct tgagtctatc 900

atgaccacca agagcgttag cttcaggagg ttgtctcatt tacgtaagtt agtcccaggc 960

ttcggaaaag cgtacaccat ttttaacaaa accttgatgg aagccgatgc tcattacaaa 1020

tccgtccgaa cttggaacga aattatccct tctaaggggt gcctgaaagt cggaggaaga 1080

tgccaccctc atgtgaacgg tgttttcttt aacggactga tacttggtcc cgatgatcat 1140

gttctgatcc ccgaaatgca atcctcactc ctacagcaac acatggagct acttgagagc 1200

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gaagctgaag actttgttga ggtgcatttg ccagacgttt acaagcaaat ttctggtgtg 1320

gacctaggac ttcccaactg gggtaaataa tgactcgag 1359

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<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Met His His His His His His Ala Asp Glu Pro His Asp Gln Arg Pro

1 5 10 15

Thr Asp Val Ile Lys Ser Tyr Leu Pro Glu Lys Gly Pro Ser Thr Ser

20 25 30

Gln Val Leu Ala Val Val Thr Leu Phe Pro Leu Gly Ala Val Leu Leu

35 40 45

Cys Leu Ala Gly Leu Ile Leu Thr Gly Thr Ile Ile Gly Leu Ala Val

50 55 60

Ala Thr Pro Leu Phe Val Ile Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Ala

65 70 75 80

Leu Thr Ile Ala Leu Ala Val Thr Gly Phe Leu Thr Ser Gly Ala Phe

85 90 95

Gly Ile Thr Ala Leu Ser Ser Ile Ser Trp Leu Leu Asn Tyr Val Arg

100 105 110

Arg Met Arg Gly Ser Leu Pro Glu Gln Leu Asp His Ala Arg Arg Arg

115 120 125

Val Gln Glu Thr Val Gly Gln Lys Thr Arg Glu Ala Gly Gln Arg Ser

130 135 140

Gln Asp Val Ile Arg Pro Gly Ser His His His His His His His His

145 150 155 160

Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Glu Leu Gly Pro Trp Ser Pro

165 170 175

Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val Val Glu Asp

180 185 190

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325 330 335

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340 345 350

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370 375 380

Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp Gly Thr Trp

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530 535 540

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595

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

aagcttcata cagagctcaa tgacaagaag aaaatcttcg tcaacatggt ggagctctct 60

tacgaacgac acgattgtct actccaaaaa tatcaaagat acagtctcag aagaccaaag 120

ggcaattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc 180

agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct tacaatgcca 240

tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga 300

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gcaagtggat tgatgtgata ctccaaaaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 420

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gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag gtggctcctt acaatgccat 540

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actcgaggct gagtaaggtt aactttgagt attatggcat tggaaaagcc attgttctgc 960

ttgtaattta ctgtgttctt tcagttttgt tttcggacat caagttaacc aaaaaaaaaa 1020

aaaaaaaaaa aaattttacc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatttcc ccaaaaaaaa 1080

aaaaaaaaaa aaaaatttaa agagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata 1140

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gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt 1260

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tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa 1380

ttc 1383