增強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明一般涉及具有導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)提高的基因改變的細(xì)菌細(xì)胞以及制備和使用該細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方面包括革蘭氏陽(yáng)性微生物如芽孢桿菌菌種，其具有改變ykf操縱子編碼的蛋白質(zhì)的活性并導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的基因改變。
【專(zhuān)利說(shuō)明】増強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2013年12月31日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)USSN 61/922,613的優(yōu)先 權(quán)的權(quán)益，該申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般涉及具有導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)提高的基因改變的細(xì)菌細(xì)胞以 及制備和使用該細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方面包括革蘭氏陽(yáng)性微生物如芽孢桿菌(Bacillus) 菌種，其具有改變ykf操縱子編碼的蛋白質(zhì)的活性并導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的基 因改變。
【背景技術(shù)】
[0004] 基因工程允許改良微生物以用作工業(yè)生物反應(yīng)器、細(xì)胞工廠(chǎng)并用于食品發(fā)酵。包 括多個(gè)芽孢桿菌菌種的革蘭氏陽(yáng)性生物用于產(chǎn)生大量有用的蛋白質(zhì)和代謝物（參見(jiàn)例如 Zukowski，"Production of commercially valuable products，''In:Doi和McGlouglin(編 輯）Biology of Bacilli:Applications to Industry ,Butterworth-He inemann, Stoneham.Mass第311-337頁(yè)[1992])。用于工業(yè)的常見(jiàn)芽孢桿菌菌種包括地衣芽孢桿菌 (B. licheniformis)、解淀粉芽抱桿菌（B.amyloliquefaciens)和枯草芽抱桿菌 (B.subtilis)。因?yàn)槠銰RAS(-般被認(rèn)為是安全的）狀態(tài)，所以這些芽孢桿菌菌種的菌株是 產(chǎn)生用于食品和制藥工業(yè)的蛋白質(zhì)的天然候選。革蘭氏陽(yáng)性生物所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的示例包 括酶例如α-淀粉酶、中性蛋白酶和堿性(或絲氨酸)蛋白酶。
[0005] 盡管對(duì)于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)的理解已有進(jìn)展，但仍需要開(kāi)發(fā)表達(dá)水平 提高的感興趣的蛋白質(zhì)的新重組菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供表達(dá)水平提高的感興趣的蛋白質(zhì)的重組革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞以及制備和 使用其的方法。具體地，本發(fā)明涉及具有這樣一種基因改變的細(xì)菌細(xì)胞，其與不具有基因改 變的細(xì)菌細(xì)胞相比導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)提高。本發(fā)明的方面包括革蘭氏陽(yáng)性微生物 如芽孢桿菌菌種，其具有改變ykf操縱子編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性并導(dǎo)致感興趣的 蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的基因改變。還提供了制備和使用該重組細(xì)菌細(xì)胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的方面包括一種用于使來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的感興趣的蛋白質(zhì)的表 達(dá)提高的方法，該方法包括:a)獲取能夠產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)的改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì) 胞，其中所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞包含至少一個(gè)改變ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多 個(gè)蛋白質(zhì)的活性的基因改變。以及b)在使得所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)所述感興 趣的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件 下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中所述感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)相比，所述感興 趣的蛋白質(zhì)在所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)提高。
[0008] 在某些實(shí)施方案中，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞為芽孢桿菌屬菌種的菌株(例如 芽孢桿菌屬菌種的菌株選自：地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、枯草芽孢桿菌、解 淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B. stearothermophilus)、嗜堿 芽孢桿菌(B.alkalophilus)、凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B. circulans)、 短小芽孢桿菌(B · pumi lus)、燦爛芽孢桿菌(B · lautus)、克勞氏芽孢桿菌(B · clausii)、巨大 芽孢桿菌(B.megaterium)和蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis))。在某些實(shí)施方案中，芽 孢桿菌屬菌種的菌株為枯草芽孢桿菌菌株。在某些實(shí)施方案中，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì) 胞進(jìn)一步在選自以下的基因中包含突變:degU、degQ、degS、scoC4、spoIIE和oppA。在某些實(shí) 施方案中，突變?yōu)閐egU(Hy)32。
[0009] 在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有降低的YkfA蛋白質(zhì)活 性。在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有提高的YkfA蛋白質(zhì)活性。
[0010] 在某些實(shí)施方案中，基因改變?cè)谒鰕kf操縱子的ykfA基因中。在一些實(shí)施方案 中，基因改變?cè)趛kf操縱子的內(nèi)源性ykfA基因中。在某些實(shí)施方案中，ykfA基因與SEQ ID NO: 1有至少60%同一性。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第252或253位 氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第 252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變 導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0: 4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨 基酸由V變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQIDN0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQIDN0:2的第 252位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基 酸位置處V變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。
[0011] 在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是同源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，感興趣的 蛋白質(zhì)是異源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是酶。在某些實(shí)施方案中，該酶 選自：蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸 酶。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，蛋白酶為枯草桿菌 蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，枯草桿菌蛋白酶選自：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶 BPN'、枯草菌溶素、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、以及它們 的變體。
[0012] 在某些實(shí)施方案中，該方法還包括回收所述感興趣的蛋白質(zhì)。
[0013] 本發(fā)明的方面包括改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下 生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞包含至少 一個(gè)基因改變，所述基因改變使ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性改變。在某些 實(shí)施方案中，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬菌種的菌株。在某些實(shí)施方案中，芽 孢桿菌屬菌種的菌株選自：地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、 短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿 菌、燦爛芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。在某些實(shí)施方案中， 芽孢桿菌屬菌種的菌株為枯草芽孢桿菌菌株。在某些實(shí)施方案中，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 細(xì)胞進(jìn)一步在選自以下的基因中包含突變:(^811、(168(>)、(1685、8(3〇04、8口〇1；^和(^口4。在某些 實(shí)施方案中，突變?yōu)閐egU(Hy)32。
[0014] 在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有降低的YkfA蛋白質(zhì)活 性。在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有提高的YkfA蛋白質(zhì)活性。
[0015] 在某些實(shí)施方案中，基因改變?cè)谒鰕kf操縱子的ykfA基因中。在一些實(shí)施方案 中，基因改變?cè)趛kf操縱子的內(nèi)源性ykfA基因中。在某些實(shí)施方案中，ykfA基因與SEQ ID NO: 1有至少60%同一性。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第252或253位 氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第 252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí) 施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng) (示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基酸對(duì) 應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V變?yōu)?L(示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，改變的細(xì)胞表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方 案中，感興趣的蛋白質(zhì)是同源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是異源蛋白質(zhì)。 在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是酶。
[0016] 在某些實(shí)施方案中，該酶選自：蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪 酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶。在某些 實(shí)施方案中，蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，枯草桿菌蛋白酶選自：枯草桿 菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草菌溶素、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147、 枯草桿菌蛋白酶309、以及它們的變體。
[0017] 本發(fā)明的方面包括用于獲取具有改善的蛋白質(zhì)產(chǎn)生能力的改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì) 菌細(xì)胞的方法，該方法包括將至少一個(gè)基因改變引入到親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中，從而 改變ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性。在某些實(shí)施方案中，改變的革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬菌種的菌株。在某些實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬菌種的菌株選自：地衣 芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿 菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、克勞氏芽 孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。在某些實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬菌種的菌株為枯 草芽孢桿菌菌株。在某些實(shí)施方案中，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)一步在選自以下的基 因中包含突變：(1681]、(168( >)、(1685、8(3〇04、8口〇1]^和〇口口4。在某些實(shí)施方案中，突變?yōu)?16區(qū)1] (Hy)32〇
[0018] 在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有降低的YkfA蛋白質(zhì)活 性。在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有提高的YkfA蛋白質(zhì)活性。
[0019] 在某些實(shí)施方案中，基因改變?cè)谒鰕kf操縱子的ykfA基因中。在一些實(shí)施方案 中，基因改變?cè)趛kf操縱子的內(nèi)源性ykfA基因中。在某些實(shí)施方案中，ykfA基因與SEQ ID NO: 1有至少60%同一性。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第252或253位 氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO:2的第 252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí) 施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng) (示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基酸對(duì) 應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID NO:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V變?yōu)?L(示于SEQ ID N0:4)。
[0020]在某些實(shí)施方案中，所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)。在某 些實(shí)施方案中，所述方法還包括將編碼所述感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)盒引入到所述親本革蘭 氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括將編碼所述感興趣的蛋白質(zhì)的表 達(dá)盒引入到所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是同 源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是異源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，感興趣 的蛋白質(zhì)是酶。在某些實(shí)施方案中，該酶選自：蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖 酶、脂肪酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶。 在某些實(shí)施方案中，蛋白酶為枯草桿菌蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，枯草桿菌蛋白酶選自： 枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草菌溶素、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白 酶147、枯草桿菌蛋白酶309、以及它們的變體。
[0021 ]在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括在使得所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá) 所述感興趣的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中， 該方法還包括回收所述感興趣的蛋白質(zhì)。
[0022]本發(fā)明的方面包括由上述方法產(chǎn)生的改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞。
[0023]本發(fā)明的方面包括一種包含來(lái)源于ykfA基因的變體序列的多核苷酸，其中所述變 體序列：
[0024]長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸，
[0025] 與全部或部分SEQ ID NO: 1有至少60%同一性，并且
[0026]包含至少一個(gè)在ykfA基因中的核苷酸位置處的基因改變，當(dāng)所述至少一個(gè)突變存 在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)源性ykf A基因中時(shí)，所述基因改變導(dǎo)致Ykf A蛋白質(zhì)的活性改 變。
[0027] 在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第252或253位氨基酸對(duì)應(yīng)的 位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252和253位氨 基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第 252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基 因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO:2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位 置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID N0: 2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID NO:4)。在某些實(shí)施方案中，變體序列與全部或部分SEQ ID NO: 3有至少90%同一性。在某些 實(shí)施方案中，變體序列與全部或部分SEQ ID N0: 3相同。在某些實(shí)施方案中，變體序列的長(zhǎng) 度為至少20個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施方案中，變體序列的長(zhǎng)度為至少50個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施 方案中，變體序列的長(zhǎng)度為至少200個(gè)核苷酸。
[0028] 本發(fā)明的方面包括一種包含來(lái)源于野生型YkfA多肽序列(示于SEQ ID N0:2中）的 變體序列的分離的多肽，其中所述變體序列：
[0029]長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸，
[0030] 與全部或部分SEQ ID N0:2有至少60%同一性，并且
[0031] 在YkfA多肽序列基因中包含至少一個(gè)氨基酸改變，導(dǎo)致YkfA蛋白質(zhì)的活性改變。 [0032] 在某些實(shí)施方案中，改變?cè)谂cSEQ ID N0: 2的第252或253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處 的氨基酸中。在某些實(shí)施方案中，基因改變?cè)谂cSEQ ID N0:2的第252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的 位置處的氨基酸中。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第252位氨基酸對(duì) 應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與 SEQ ID N0: 2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。在某 些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO:2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng) 以及與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID N0:4)。在 某些實(shí)施方案中，變體多肽序列與全部或部分SEQ ID N0:4有至少90%同一性。在某些實(shí)施 方案中，變體多肽序列與全部或部分SEQ ID N0:4相同。在某些實(shí)施方案中，變體多肽序列 的長(zhǎng)度為至少5個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，變體多肽序列的長(zhǎng)度為至少20個(gè)氨基酸。在 某些實(shí)施方案中，變體多肽序列的長(zhǎng)度為至少50個(gè)氨基酸。
[0033] 本發(fā)明的方面包括包含如上所述的多核苷酸序列的載體。在某些實(shí)施方案中，載 體是靶向載體，所述靶向載體被設(shè)計(jì)成在轉(zhuǎn)化到所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中時(shí)通過(guò)同源重 組將所述多核苷酸序列中的至少一個(gè)突變引入到革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的ykf操縱子中的對(duì) 應(yīng)位置。
[0034] 本發(fā)明的方面包括一種用于增強(qiáng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)表達(dá)的 方法，所述方法包括：
[0035] a)用以上載體轉(zhuǎn)化親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞；
[0036] b)允許所述載體與所述親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的ykf操縱子中相應(yīng)區(qū)域的同源 重組，以產(chǎn)生改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞；以及
[0037] c)使所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞在適于表達(dá)所述感興趣的蛋白質(zhì)的條件下 生長(zhǎng)，其中與所述轉(zhuǎn)化步驟之前的所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞相比，所述感興趣的蛋白質(zhì)在 所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中的產(chǎn)量提高。
[0038] 在某些實(shí)施方案中，親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬菌種的菌株。在某些 實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬菌種的菌株選自：地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、解 淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿 菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。在某 些實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬菌種的菌株為枯草芽孢桿菌菌株。在某些實(shí)施方案中，改變的革 蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)一步在選自以下的基因中包含突變 :degU、degQ、degS、SC〇C4、sp 〇IIE 和oppA。在某些實(shí)施方案中，突變?yōu)閐egU(Hy)32。
[0039] 在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有降低的YkfA蛋白質(zhì)活 性。在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有提高的YkfA蛋白質(zhì)活性。
[0040]在某些實(shí)施方案中，突變?cè)谒鰕kf操縱子的ykfA基因中。在一些實(shí)施方案中，基 因改變?cè)趛kf操縱子的內(nèi)源性ykfA基因中。在某些實(shí)施方案中，ykfA基因與SEQ ID N0:1有 至少60%同一性。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第252或253位氨基酸 對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第252和 253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)(示于SEQ ID NO:4)。在某些實(shí)施方案 中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)(示于 SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的 氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V變?yōu)長(zhǎng)(示 于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是同源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中， 感興趣的蛋白質(zhì)是異源蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是酶。在某些實(shí)施方案 中，該酶選自：蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶 和磷酸酶。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，蛋白酶為枯 草桿菌蛋白酶。在某些實(shí)施方案中，枯草桿菌蛋白酶選自：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋 白酶BPN'、枯草菌溶素、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、以及 它們的變體。
[0041 ]在某些實(shí)施方案中，該方法還包括回收所述感興趣的蛋白質(zhì)。
【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1示出得自枯草芽孢桿菌的ykf操縱子的示意圖。示出了實(shí)施例所述的沉默突變 的位置。示出了ykfA、ykfB、ykfC和ykfD基因。示出了導(dǎo)致P252L和V253L的基因改變。
[0043] 圖2A示出表達(dá)蛋白酶的CB15-14衍生株：CB15-14#1和#2(對(duì)照菌株）以及CB15-14ykfA#l和#2(包含ykfA突變的菌株）的細(xì)胞密度圖。圖2B示出CB15-14衍生株:CB15-14#1 和#2(對(duì)照菌株）以及CB15-14ykfA#l和#2(包含ykfA突變的菌株）中FNA產(chǎn)量圖。
[0044] 圖3A示出產(chǎn)生GFP的CB15-14衍生株：CB15-14#1和#2(對(duì)照菌株）以及CB15-14ykfA#l和#2(包含ykfA突變的菌株）的細(xì)胞密度圖。在進(jìn)入穩(wěn)定期（生長(zhǎng)4至6小時(shí)之間） 時(shí)，ykfA突變株的細(xì)胞生長(zhǎng)的下降相較于對(duì)照菌株有延緩，這表明改善的細(xì)胞生存力歸因 于ykfA突變。圖3B示出CB15-14衍生株:CB15-14#1和#2(對(duì)照菌株）以及CB15-14ykfA#l和#2 (包含ykfA突變的菌株）中GFP產(chǎn)量圖。該圖示出GFP的產(chǎn)量從生長(zhǎng)6小時(shí)提高，這是由于ykfA 突變。
[0045] 圖4A示出產(chǎn)生BglC的CB15-14衍生株：CB15-14#1和#2(對(duì)照菌株）以及CB15-14ykfA#l和#2(包含ykfA突變的菌株）的細(xì)胞密度圖。包含ykfA突變的細(xì)胞具有更高的細(xì)胞 生長(zhǎng)，這表明由于存在ykfA突變而使細(xì)胞生存力改善。圖4B示出CB15-14衍生株:CB15-14#1 和#2(對(duì)照菌株）以及CB15-14ykfA#l和#2(包含ykfA突變的菌株）中BglC產(chǎn)量圖。該圖示出 BglC的產(chǎn)量在所有時(shí)間點(diǎn)提高，這是由于存在ykfA突變。
【具體實(shí)施方式】
[0046] 本發(fā)明一般涉及具有導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)提高的基因改變的細(xì)菌細(xì)胞以 及制備和使用該細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方面包括革蘭氏陽(yáng)性微生物如芽孢桿菌菌種的細(xì) 胞，其具有改變ykf操縱子所編碼的蛋白質(zhì)的活性的基因改變，導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá) 增強(qiáng)。
[0047] 在更詳細(xì)地描述本發(fā)明的組合物和方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明的組合物和方法并不 限于所描述的具體實(shí)施方案，因?yàn)檫@些實(shí)施方案當(dāng)然是可變的。還應(yīng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ) 僅出于描述具體的實(shí)施方案的目的，并不意在具有限制意義，因?yàn)楸景l(fā)明的組合物和方法 的范圍將僅受所附權(quán)利要求的限定。
[0048] 在提供數(shù)值范圍的情況中，應(yīng)當(dāng)理解，該范圍和在該所述范圍內(nèi)的任意其它所述 的值或中間值的上限和下限之間的每個(gè)中間數(shù)值(至下限的個(gè)位的十分之一，除非上下文 另有清楚規(guī)定)也涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法之中。這些較小范圍的上限和下限可獨(dú)立 地被包括在較小范圍中，并且還被涵蓋在本發(fā)明的組合物和方法中，但依據(jù)該規(guī)定的范圍 中的任何被具體排除的界限而定。在規(guī)定的范圍包括界限中的一個(gè)或兩個(gè)的情況中，排除 這些被包括的界限中的任一個(gè)或兩個(gè)的范圍，也被包括在本發(fā)明的組合物和方法中。
[0049] 某些范圍在本文中通過(guò)前面帶有術(shù)語(yǔ)"約"的數(shù)值表述。術(shù)語(yǔ)"約"在本文中用于為 它之后的確切數(shù)字以及接近或近似該術(shù)語(yǔ)之后的數(shù)字的數(shù)字提供字面支持。在確定數(shù)字是 否接近或近似于明確所記載的數(shù)字方面，接近或近似的未記載數(shù)字可以是在其中陳述它的 上下文中提供明確記載數(shù)字的基本上的等同物的數(shù)字。例如，與數(shù)值結(jié)合，術(shù)語(yǔ)"約"是指數(shù) 值的-10%至+10%范圍，除非術(shù)語(yǔ)在上下文中另外明確定義。又如，短語(yǔ)"約6的pH值"是指 5.4至6.6的pH值，除非pH值另有明確定義。
[0050] 本文提供的標(biāo)題并非對(duì)本發(fā)明的組合物和方法的各個(gè)方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，這 些方面或?qū)嵤┓桨缚赏ㄟ^(guò)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體來(lái)參考而得到。相應(yīng)地，下面就要定義的 術(shù)語(yǔ)通過(guò)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體來(lái)參考會(huì)得到更完全的定義。
[0051]本文件被組織成多個(gè)章節(jié)以便于閱讀;然而，讀者應(yīng)理解，在一個(gè)章節(jié)中作出的陳 述可適用于其它章節(jié)。這樣，用于本公開(kāi)的不同章節(jié)的標(biāo)題不應(yīng)理解為限制性的。
[0052]除非另有定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明的組合物和方 法所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。盡管與本文所述的那些類(lèi)似或等價(jià)的任何方法 和材料還可用于本發(fā)明的組合物和方法的實(shí)踐或測(cè)試，但現(xiàn)在將描述代表性的例示性方法 和材料。
[0053]本說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專(zhuān)利以引用方式并入本文，如同各單獨(dú)出版物或 專(zhuān)利具體和單獨(dú)地指示為通過(guò)引用并入一樣，并且以引用方式并入本文以公開(kāi)和描述與引 用出版物有關(guān)的方法和/或材料。任何出版物的引用均指其申請(qǐng)日之前的公開(kāi)，并不能被理 解為承認(rèn)由于先前發(fā)明而允許本發(fā)明組合物和方法不享受早于這些公布的權(quán)利。此外，提 出的【公開(kāi)日】期可以不同于實(shí)際的【公開(kāi)日】期，這可能需要單獨(dú)地確認(rèn)。
[0054]根據(jù)該【具體實(shí)施方式】，使用下面的縮寫(xiě)和定義。需注意，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種" 和"所述"包括多個(gè)指代物，除非上下文明確指明不是這樣。因此，例如，提到"酶"包括多種 此類(lèi)酶，而提到"劑量"包括提到一種或多種劑量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的它們的等同 物，以此類(lèi)推。
[0055]還應(yīng)該注意，權(quán)利要求書(shū)可能撰寫(xiě)成排除任何可選元素。因此，此陳述旨在充當(dāng)使 用與權(quán)利要求要素的引用相關(guān)的如"僅"、"只"等此類(lèi)排他性術(shù)語(yǔ)或使用"否定性"限制的前 提基礎(chǔ)。
[0056] 還應(yīng)當(dāng)注意，如本文所用術(shù)語(yǔ)"基本上由…組成"是指組合物，其中術(shù)語(yǔ)之后的一 個(gè)或多個(gè)組分是在總量為按所述組合物總體的重量計(jì)少于30%并不會(huì)影響或干擾一個(gè)或 多個(gè)組分的作用或活性的一個(gè)或多個(gè)其它已知組分的存在下的。
[0057] 還應(yīng)當(dāng)注意，如本文所用術(shù)語(yǔ)"包括"意指包括但不限于術(shù)語(yǔ)"包括"之后的一個(gè)或 多個(gè)組分。術(shù)語(yǔ)"包括"之后的一個(gè)或多個(gè)組分是必要的或強(qiáng)制性的，但是包含一個(gè)或多個(gè) 組分的組合物還可包括一個(gè)或多個(gè)其它非強(qiáng)制性或任選組分。
[0058] 還應(yīng)當(dāng)注意，如本文所用術(shù)語(yǔ)"由…組成"意指包括并限于術(shù)語(yǔ)"由…組成"之后的 一個(gè)或多個(gè)組分。術(shù)語(yǔ)"由…組成"之后的一個(gè)或多個(gè)組分因此是必要的或強(qiáng)制性的，并且 沒(méi)有一個(gè)或多個(gè)其它組分存在于組合物中。
[0059] 對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言，閱讀了本公開(kāi)內(nèi)容后將顯而易見(jiàn)的是，本文所述和 示意的各個(gè)單獨(dú)實(shí)施方案都具有獨(dú)立的部件和特征，在不背離本文所述的本發(fā)明的組合物 和方法的范圍或精神的前提下，這些部件和特征可容易地與其它多個(gè)實(shí)施方案中任意的特 征分離或合并。任何敘述的方法可以按照敘述事件的順序或以任何其它邏輯上可能的順序 進(jìn)行。
[0060]
[0061] ?文所用，"宿主細(xì)胞"是指具有能夠充當(dāng)用于新導(dǎo)入的DNA序列的宿主或表達(dá) 載體的細(xì)胞。
[0062] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞，例如革蘭氏陽(yáng)性宿主細(xì)胞芽 孢桿菌屬菌種。
[0063] 如本文所用，"芽孢桿菌屬"或"芽孢桿菌屬菌種"包括"芽孢桿菌"屬中的所有種， 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，包括但不限于枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短 芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿 菌(B · clausii)、耐鹽芽孢桿菌(B ·halodurans)、巨大芽孢桿菌(B .megaterium)、凝結(jié)芽孢 桿菌(B. coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B. circulans)、燦爛芽孢桿菌(B. lautus)和蘇云金芽 孢桿菌。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，芽孢桿菌屬繼續(xù)經(jīng)歷著分類(lèi)學(xué)上的重構(gòu)。因此，預(yù)期的是該屬包括已 被重新歸類(lèi)的種，包括但不限于諸如嗜熱脂肪芽孢桿菌(其現(xiàn)在被命名為嗜熱脂肪地芽孢 桿菌(Geobacillus stearothermophilus))之類(lèi)的生物體。在氧氣的存在下產(chǎn)生有抵抗力 的內(nèi)生孢子被認(rèn)為是芽孢桿菌屬的限定性特征，盡管該特征也適用于最新命名的脂環(huán)酸芽 孢桿菌（Alicyclobacillus)、雙芽孢桿菌（Amphibacillus)、解硫胺素芽孢桿菌 (八116111'；[11；^&(3；[11118)、厭氧芽抱桿菌(411(?5^&(3；[11118)、短芽抱桿菌(1^6￥；^&(3；[11118)、線(xiàn)狀 芽孢桿菌（Filobacillus)、薄壁芽孢桿菌（Gracilibacillus)、喜鹽芽孢桿菌 (他1(^&(3；[11118)、類(lèi)芽抱桿菌(？&611；^&(3；[11118)、土壤芽抱桿菌(3&1；^&(3；[11118)、耐熱芽抱 桿菌(Thermobacillus)、解脈芽抱桿菌(Ureibacillus)和枝芽抱桿菌(Virgibacillus)。
[0064] 如本文所用，"核酸"是指核苷酸或多核苷酸序列及其片段或部分，以及指可為雙 鏈或單鏈的基因組來(lái)源的或合成來(lái)源的DNA、cDNA和RNA，不論其代表有義鏈還是反義鏈。應(yīng) 當(dāng)理解，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，多個(gè)核苷酸序列可編碼給定的蛋白質(zhì)。
[0065] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"載體"是指能在細(xì)胞中被復(fù)制并且可將新基因或DNA片段攜帶 入細(xì)胞的任何核酸。因此，該術(shù)語(yǔ)是指設(shè)計(jì)成在不同宿主細(xì)胞之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移的核酸構(gòu)建體。 "表達(dá)載體"是指能夠?qū)愒碊NA片段摻入外源細(xì)胞中并使其表達(dá)的載體。許多原核和真核 表達(dá)載體可商購(gòu)獲得。"靶向載體"是包含多核苷酸序列的載體，所述多核苷酸序列與多核 苷酸序列轉(zhuǎn)化到其中的宿主細(xì)胞的染色體區(qū)域同源并且可在該區(qū)域促使同源重組。靶向載 體可用于通過(guò)同源重組將突變引入細(xì)胞的染色體中。在一些實(shí)施方案中，靶向載體包含例 如添加到末端的其它非同源序列（即填充序列或旁側(cè)序列）?？墒苟瞬块]合，由此使得靶向 載體形成封閉的環(huán)，例如插入載體中。適當(dāng)載體的選擇和/或構(gòu)建在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范 圍內(nèi)。
[0066] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"質(zhì)粒"是指用作克隆載體的環(huán)狀雙鏈(ds)DNA構(gòu)建體，并且其在 許多細(xì)菌和一些真核生物中形成染色體外自我復(fù)制的遺傳元件。在一些實(shí)施方案中，質(zhì)粒 被摻入宿主細(xì)胞的基因組中。
[0067] "純化的"或"分離的"或"富集的"意指生物分子(例如多肽或多核苷酸）由其天然 狀態(tài)進(jìn)行改變，這是通過(guò)將其與部分或所有與天然狀態(tài)相關(guān)的天然存在的組分進(jìn)行分離。 此類(lèi)分離或純化可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的分離技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如離子交換層析、親和層析、疏 水分離、透析、蛋白酶處理、硫酸銨沉淀或者其它蛋白質(zhì)鹽沉淀、離心、大小排阻層析、過(guò)濾、 微過(guò)濾、凝膠電泳或者梯度分離來(lái)除去全部細(xì)胞、細(xì)胞碎肩、雜質(zhì)、外來(lái)蛋白質(zhì)、或在最終組 合物中不期望的酶。然后還可向純化或分離的生物分子組合物中加入提供附加有益效果的 組分，例如活化劑、抗抑制劑、期望的離子、控制pH的化合物或者其它酶或化學(xué)物質(zhì)。
[0068] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"增強(qiáng)的"、"改善的"和"提高的"在涉及感興趣的生物分子(例如 感興趣的蛋白質(zhì)）的表達(dá)時(shí)在本文互換使用，其意指生物分子的表達(dá)在未根據(jù)本文教導(dǎo)改 變但在基本相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)宿主菌株(例如野生型和/或親本株）中的表達(dá)水 平之上。
[0069] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"在用于蛋白質(zhì)時(shí)是指這樣一種方法:通過(guò)該方法基于基 因的核酸序列產(chǎn)生蛋白質(zhì)并因此包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩者。
[0070] 如本文所用，在將多核苷酸引入細(xì)胞中的語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"引入"是指任何適于將多 核苷酸轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞中的方法。用于引入的此類(lèi)方法包括但不限于原生質(zhì)體融合、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn) 化、綴合和轉(zhuǎn)導(dǎo)（參見(jiàn)例如Ferrari等人，"Genetics，" in Hardwood等人(編輯），Bacillus, Plenum Publishing Corp·，第57-72頁(yè)，[1989])〇
[0071] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化的"和"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的"是指通過(guò)人工干預(yù)將多核苷酸序列引 入其中的細(xì)胞?？蓪⒍嗪塑账嵴线M(jìn)細(xì)胞的基因組中或作為被維持至少兩代的附加體質(zhì)粒 存在。
[0072] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"可選標(biāo)記"或"選擇性標(biāo)記"是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)的核酸 (例如基因），其使得能容易地選擇含有該核酸的那些宿主。此類(lèi)可選標(biāo)記的示例包括但不 限于抗微生物劑。因此，術(shù)語(yǔ)"可選標(biāo)記"是指提供這樣指示的基因：宿主細(xì)胞已吸收引入感 興趣的DNA或已發(fā)生一些其它反應(yīng)。通常，可選標(biāo)記是賦予宿主細(xì)胞抗微生物抗性或代謝優(yōu) 勢(shì)的基因以允許將含有外源DNA的細(xì)胞與在轉(zhuǎn)化過(guò)程中未接受任何外源序列的細(xì)胞區(qū)分 開(kāi)。根據(jù)本發(fā)明可用的其它標(biāo)記包括但不限于營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，例如色氨酸;和檢測(cè)標(biāo)記， 例如β-半乳糖苷酶。
[0073] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"啟動(dòng)子"是指起到引導(dǎo)下游基因的轉(zhuǎn)錄的作用的核酸序列。在 實(shí)施方案中，啟動(dòng)子適于在其中表達(dá)靶基因的宿主細(xì)胞。啟動(dòng)子以及其他轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控 核酸序列（也稱(chēng)為"控制序列"）是表達(dá)給定基因所必需的。通常，轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列包括 但不限于啟動(dòng)子序列、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增 強(qiáng)子或激活子序列。
[0074] 如本文所用，"功能性地連接"或"可操作地連接"意指具有已知或期望活性的調(diào)控 區(qū)或功能結(jié)構(gòu)域例如啟動(dòng)子、終止子、信號(hào)序列或增強(qiáng)子區(qū)域以使得調(diào)控區(qū)或功能結(jié)構(gòu)域 根據(jù)其已知或期望活性控制靶標(biāo)(例如基因或多肽)的表達(dá)、分泌或功能的方式連接至或附 接至該祀標(biāo)。
[0075] 術(shù)語(yǔ)"基因改變"或"遺傳改變"在用于描述重組細(xì)胞時(shí)意指細(xì)胞相較于親本細(xì)胞 具有至少一個(gè)基因差異。一個(gè)或多個(gè)遺傳差異可為染色體突變(例如一個(gè)染色體區(qū)被另一 個(gè)染色體區(qū)插入、缺失、取代、倒位、替換(例如用異源啟動(dòng)子替換染色體啟動(dòng)子)等)和/或 引入染色體外多核苷酸(例如質(zhì)粒）。在一些實(shí)施方案中，可將染色體外多核苷酸整合進(jìn)宿 主細(xì)胞的染色體中以產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體/轉(zhuǎn)化體。本公開(kāi)的實(shí)施方案包括改變由ykf操縱子 (ykfA、ykfB、ykfC和ykfD)中基因編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性的基因改變。如本文詳 述，此類(lèi)改變改善感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
[0076] 如本文所述，改變蛋白質(zhì)活性可以以任何便利方式實(shí)現(xiàn)。例如，可通過(guò)提高或降低 蛋白質(zhì)的活性來(lái)改變蛋白質(zhì)活性。也可通過(guò)例如改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的 相互作用或結(jié)合、或改變蛋白質(zhì)的底物特異性來(lái)改變蛋白質(zhì)活性。活性的改變可處于轉(zhuǎn)錄、 mRNA穩(wěn)定化、翻譯的水平，或者可能是由于在一個(gè)或多個(gè)由ykf操縱子產(chǎn)生的多肽中存在降 低其活性的變異（即其為基于多肽活性的表達(dá)的"功能性"減少）。由此，并不意欲限制基因 改變的類(lèi)型或通過(guò)其使ykf操縱子所編碼的至少一個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性改變的方式。例 如，在一些實(shí)施方案中，革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中的基因改變?yōu)楦淖円粋€(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的基因改 變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性降低。在某些實(shí)施方案中，改變導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄物的水平降低?；蛘?，革蘭氏 陽(yáng)性細(xì)胞中的基因改變可為改變核苷酸的基因改變，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的穩(wěn)定性降低。 在某些實(shí)施方案中，減少一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)的多于一個(gè)基因改變可存在于經(jīng)基因改變 的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中。
[0077] 基因"失活"意指基因的表達(dá)或其編碼的生物分子的活性被阻斷或以其它方式不 能發(fā)揮其已知功能。失活可通過(guò)任何適宜的方式發(fā)生，例如通過(guò)如上所述的基因改變。在一 個(gè)實(shí)施方案中，失活基因的表達(dá)產(chǎn)物是具有相應(yīng)的蛋白質(zhì)生物活性改變的截短的蛋白質(zhì)。 在一些實(shí)施方案中，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌菌株包括一個(gè)或多個(gè)基因的失活，其優(yōu)選導(dǎo)致 穩(wěn)定的且不可逆的失活。
[0078] 在一些實(shí)施方案中，失活通過(guò)缺失來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)同源重組缺失 靶向缺失的區(qū)域(例如基因）。例如，使用包含具有選擇性標(biāo)記的引入序列的DNA構(gòu)建體(其 中該序列在本文可稱(chēng)為"同源盒"），該選擇性標(biāo)記在每一側(cè)側(cè)接有與靶向缺失的區(qū)域同源 的序列。將DNA構(gòu)建體與宿主染色體的同源序列進(jìn)行比對(duì)并在雙交換事件中從宿主染色體 中切除靶向缺失的區(qū)域。
[0079] "插入"或"添加"是核苷酸或氨基酸序列的變化，相較于天然存在的或親本序列， 其分別導(dǎo)致添加了 一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基酸殘基。
[0080] 如本文所用，"取代"是分別用不同核苷酸或氨基酸替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸或氨基 酸的結(jié)果。
[0081] 使基因突變的方法在本領(lǐng)域中是公知的并且包括但不限于定點(diǎn)突變、產(chǎn)生隨機(jī)突 變以及缺口雙鏈方法(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利4,760，025;Moring等人，Biotech. 2:646[ 1984]; 和Kramer等人，Nucleic Acids Res·, 12:9441[1984])。
[0082] 如本文所用，"同源基因"是指來(lái)自于不同的但通常相關(guān)的物種的一對(duì)基因，它們 彼此對(duì)應(yīng)，并且彼此相同或非常相似。該術(shù)語(yǔ)包括通過(guò)物種形成（即新物種的進(jìn)化)分離的 基因（例如直系同源基因），以及通過(guò)遺傳復(fù)制已分離的基因（例如旁系同源基因）。
[0083]如本文所用，"直系同源物"和"直系同源基因"是指不同物種中通過(guò)物種形成而從 共同的先祖基因（即同源基因）進(jìn)化而來(lái)的基因。通常，直系同源物在進(jìn)化的過(guò)程中保留了 相同的功能。對(duì)直系同源物的鑒別可用于可靠地預(yù)測(cè)新測(cè)序的基因組中的基因功能。
[0084] 如本文所用，"旁系同源物"和"旁系同源基因"是指因基因組內(nèi)的復(fù)制而相關(guān)聯(lián)的 基因。直系同源物在進(jìn)化的過(guò)程中保留相同的功能，而旁系同源物進(jìn)化出新的功能，雖然一 些功能通常與原始的功能相關(guān)。旁系同源基因的示例包括但不限于編碼胰蛋白酶、胰凝乳 蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，它們都是絲氨酸蛋白酶并一起出現(xiàn)在相同的物種中。
[0085] 如本文所用，"同源性"是指序列相似性或同一性，同一性是優(yōu)選的。使用本領(lǐng)域中 已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)確定此種同源性（參見(jiàn)例如Smith and Waterman，Adv.Appl .Math.，2: 482[1981];Needlemar^PWunsch，J.Mol.Biol.，48:443[1970];Pearsor^PLipman, Pro c .Natl .Acad.Sci .USA 85:2444[1988] ;Wisconsin Genetics 軟件包（Genetics 人，Nucl.Acid Res.，12:387-395[1984])。
[0086] 如本文所用，"相似序列"其中的基因功能與枯草芽孢桿菌菌株168表示的基因基 本上相同。另外，相似基因與枯草芽孢桿菌菌株168基因的序列有至少60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%序列同一性。作為另外一種選擇，相 似序列具有枯草芽孢桿菌168區(qū)域所見(jiàn)的基因的70至100%的比對(duì)和/或具有與枯草芽孢桿 菌168染色體中的基因所比對(duì)的區(qū)域中所見(jiàn)的至少5-10個(gè)基因。在另外的實(shí)施方案中，將多 于一個(gè)以上特性應(yīng)用于序列。通過(guò)已知的序列比對(duì)方法來(lái)測(cè)定相似序列。常用的比對(duì)方法 為BLAST，但如上文和下文所指出的那樣，還存在還可用于比對(duì)序列的其它方法。
[0087] 可用的算法的一個(gè)示例是PILEUP1ILEUP利用漸進(jìn)性雙序列比對(duì)從一組相關(guān)序列 產(chǎn)生多序列比對(duì)。其還可以繪出關(guān)系樹(shù)，該關(guān)系樹(shù)示出了用于產(chǎn)生比對(duì)的聚類(lèi)關(guān)系。PILEUP 使用Feng和Doolittle的漸進(jìn)比對(duì)方法的簡(jiǎn)化形式(Feng and Doolittle，J.Mol .Evol ·， 35 : 351 _360[ 1987])。該方法類(lèi)似于Higgins和Sharp所描述的方法（Higgins和Sharp， CABI0S 5: 5:151-153[ 1989])。可用的PILEUP參數(shù)包括:默認(rèn)空位權(quán)重=3.00，默認(rèn)空位長(zhǎng) 度權(quán)重= 0.10,以及加權(quán)的末端空位。
[0088] 可用算法的另一個(gè)示例為BLAST算法，Altschul等人（Altschul等人， J .Mol · Biol ·，215:403-410，[ 1990];和Karl in等人，Proc · Natl · Acad · Sci · USA 90:5873-5787[ 1993])對(duì)其進(jìn)行了描述。特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(參見(jiàn)Altschul等 人，Meth·Enzymol ·，266:460-480[ 1996]) JU-BLAST-2使用數(shù)個(gè)搜索參數(shù)，其中大多數(shù)被設(shè) 置為默認(rèn)值?？烧{(diào)整的參數(shù)用下列值來(lái)設(shè)定：重疊跨度（overlap span) = 1，重疊分?jǐn)?shù) (overlapfraction)=0.125,字閥值（word thresholdKT):]^。]^? S和HSP S2參數(shù)是動(dòng) 態(tài)的值，并且取決于具體序列的組成和據(jù)以對(duì)所關(guān)注序列進(jìn)行檢索的具體數(shù)據(jù)庫(kù)的組成而 由程序本身確立。然而，可調(diào)節(jié)所述值以提高靈敏度。氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)值是由匹配 的相同殘基的數(shù)目除以比對(duì)區(qū)域中"較長(zhǎng)"序列的殘基總數(shù)來(lái)確定。所述"較長(zhǎng)"序列是在比 對(duì)區(qū)域中具有最多實(shí)際殘基的序列（忽略由WU-Blast-2引入以使比對(duì)得分最大化的空位）。
[0089] 如本文所用，相對(duì)于本文所鑒定的氨基酸或核苷酸序列的"序列同一性百分比 (%)"定義為，在比對(duì)序列和引入缺口（如果需要的話(huà)）以獲得最大序列同一性百分比之后， 與Mal3A序列中氨基酸殘基或核苷酸相同的候選序列中的氨基酸殘基或核苷酸的百分比， 而不考慮任何保守替代作為序列同一性的一部分。
[0090] "同源物"（或"同系物"）將意指與主題氨基酸序列和主題核苷酸序列具有指定程 度的同一性的實(shí)體。同源序列可包括使用常規(guī)序列對(duì)比工具(例如Clustal、BLAST等)與主 題序列有至少 60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或甚至99%同一性的氨基酸序列。通常，除非另外指明， 同源物將包括與例如主題氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)殘基。
[0091] 用于進(jìn)行序列比對(duì)和測(cè)定序列同一性的方法對(duì)技術(shù)人員是已知的，可以在無(wú)需過(guò) 多實(shí)驗(yàn)的情況下進(jìn)行，并且可以明確得到同一性的計(jì)算值。參見(jiàn)例如Ausubel等人編輯 (1995)Current Protocols in Molecular Biology，第19章 （Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York);和 ALIGN程序（Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5:增干丨j3(National Biomedical Research Foundation, Washington，D.C.)。多個(gè)算法可用于比對(duì)序列和測(cè)定序列同一"性，并且包括例如Needleman 等人（1970) J.Mol .Biol ·48:443的同源比對(duì)算法；Smith等人（1981 )Adv. Appl .Math· 2:482 的局部同源性算法;Pearson等人（1988)Proc ·Natl .Acad· Sci ·85:2444的相似性搜索方法； Smith-Waterman算法(Meth ·Mo 1 · Bio 1 · 70:173-187(1997);以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算 法（參見(jiàn)Altschul等人（1990)J.Mol .Biol .215:403-410)。
[0092] 使用這些算法的計(jì)算機(jī)化程序也是可用的，并且包括但不限于:ALIGN或Megalign (DNASTAR)軟件、或WU-BLAST-2(Altschul等人，Meth.Enzym. ,266:460-480( 1996));或GAP、 BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，在遺傳學(xué)計(jì)算組（GCG)軟件包（版本8，Madison， Wisconsin，USA)可得到；和Inte 11 igenetics(Mountain View,California)的PC/Gene程序 中的CLUSTAL。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括在要比較的序列的 長(zhǎng)度上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的算法。優(yōu)選地，序列同一性用程序所確定的預(yù)設(shè)參數(shù)來(lái)測(cè)定。具 體地，序列同一性可通過(guò)使用Clustal W(Thompson J.D.等人（1994)Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)采用預(yù)設(shè)參數(shù)來(lái)確定。 空位開(kāi)放罰分： 10.0 空位延伸罰分： 0.05 蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣： BLOSUM系列 DNA權(quán)重矩陣： MJB 延遲發(fā)散序列％: 40 Γ ^ 空位間隔距離： 8 DNA轉(zhuǎn)換權(quán)重： 0.50 親水性殘基列表： GPSNDQEKR. 使用負(fù)矩陣： 關(guān)（OFF) 切換殘基特定罰分： 開(kāi)_(.ΟΝ). 切換親水性罰分： 開(kāi)(GN ) 切換末端空位間隔罰分 關(guān)（OFF)
[0094] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"雜交"是指用于使一條核酸鏈通過(guò)本領(lǐng)域已知的堿基配對(duì)與互 補(bǔ)鏈接合的方法。
[0095] 如果一條核酸序列與參考核酸序列在中等至高嚴(yán)格性雜交和洗滌條件下彼此特 異性雜交，則該核酸序列被認(rèn)為是與該參考核酸序列"可選擇性雜交"。雜交條件是基于核 酸結(jié)合復(fù)合物或探針的解鏈溫度(Tm)。例如，"最大嚴(yán)格性"通常發(fā)生在約Tm-5°C(低于探針 的Tm5°C )下；"高嚴(yán)格性"在低于該Tm約5-10°C下；"中度嚴(yán)格性"在低于探針的Tm約10-20°C 下；而"低嚴(yán)格性"在低于該Tm約20-25Γ下。功能上，最大嚴(yán)格性條件可用于鑒別與雜交探 針有嚴(yán)格同一性或接近嚴(yán)格同一性的序列;而中度或低嚴(yán)格性雜交可用于鑒別或檢測(cè)多核 苷酸序列同源物。
[0096] 中等和高嚴(yán)格性雜交條件是本領(lǐng)域所熟知的。高嚴(yán)格性條件的示例包括在約42°C 下，在50% 甲酰胺、5X SSC、5X鄧哈特溶液(Denhardt's solution)、0.5%SDS和100μg/ml變 性載體DNA中雜交，然后在室溫下，在2X SSC和0.5 % SDS中洗滌兩次，并且在42°C下，在0.1 X SSC和0.5 % SDS中再洗滌兩次。中度嚴(yán)格性條件的示例包括在37°C下，在包含20 %甲酰胺、 5x SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉）、50mM磷酸鈉 (pH 7.6)、5x鄧哈特溶液、10%硫酸葡 聚糖和20mg/ml變性剪切鮭魚(yú)精子DNA的溶液中過(guò)夜溫育，然后在約37-50°C下，在lx SSC中 洗滌過(guò)濾器。本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解如何根據(jù)需要來(lái)調(diào)整溫度、離子強(qiáng)度等以適應(yīng)諸如探 針長(zhǎng)度等的因素。
[0097] 術(shù)語(yǔ)"重組的"在用于生物組分或組合物（例如細(xì)胞、核酸、多肽/酶、載體等）時(shí)是 指生物組分或組合物處于非天然存在的狀態(tài)。換言之，生物組分或組合物已通過(guò)人工干預(yù) 由其自然狀態(tài)進(jìn)行修飾。例如，重組細(xì)胞涵蓋表達(dá)一個(gè)或多個(gè)在其天然親本(非重組)細(xì)胞 中未發(fā)現(xiàn)的基因的細(xì)胞，表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)天然基因的量不同于其天然親本細(xì)胞的細(xì)胞， 和/或在不同于其天然親本細(xì)胞的條件下表達(dá)一個(gè)或多個(gè)天然基因的細(xì)胞。重組核酸可與 天然序列有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的差異，可被可操作地連接至異源序列(例如異源啟動(dòng)子、編 碼非天然或變體信號(hào)序列的序列等），可不含內(nèi)含子序列，和/或可為分離形式。重組多肽/ 酶可與天然序列有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的差異，可與異源序列融合，可為截短的或具有內(nèi)部 缺失的氨基酸，可以以在天然細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)的方式表達(dá)(例如來(lái)自過(guò)表達(dá)多肽的重組細(xì)胞， 這是由于細(xì)胞中存在編碼多肽的表達(dá)載體），和/或可為分離形式。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)在一些實(shí)施方 案中，重組多核苷酸或多肽/酶具有與其野生型對(duì)應(yīng)物相同但為非天然形式(例如為分離或 富集形式)的序列。
[0098] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"祀序列"是指宿主細(xì)胞中的DNA序列，其所編碼的序列是引入序 列插入到宿主細(xì)胞基因組中的期望位置。在一些實(shí)施方案中，靶序列編碼功能性野生型基 因或操縱子，而在其它實(shí)施方案中，靶序列編碼功能性突變基因或操縱子，或非功能性基因 或操縱子。
[0099] 如本文所用，"旁側(cè)序列"是指所討論序列的上游或下游的任何序列（例如對(duì)于基 因 A-B-C，基因 B偵賭有A和C基因序列）。在一個(gè)實(shí)施方案中，引入序列在各側(cè)側(cè)接有同源盒。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，引入序列和同源盒包含在各側(cè)側(cè)接有填充序列的單元。在一些實(shí)施 方案中，旁側(cè)序列僅存在于單側(cè)(3'或5'），而在一些實(shí)施方案中，其存在于被側(cè)接序列的各 偵k各個(gè)同源盒的序列與芽孢桿菌染色體的序列同源。這些序列指導(dǎo)新構(gòu)建體在芽孢桿菌 染色體中得以整合的地方以及芽孢桿菌染色體將被引入序列所替代的部分。在一個(gè)實(shí)施方 案中，選擇性標(biāo)記的5'和3'端側(cè)接有包含失活染色體片段的部分的多核苷酸序列。在一些 實(shí)施方案中，旁側(cè)序列僅存在于單側(cè)(3 '或5 '），而在一些實(shí)施方案中，其存在于被側(cè)接序列 的各側(cè)。
[0100]如本文所用，術(shù)語(yǔ)"可擴(kuò)增標(biāo)記"、"可擴(kuò)增基因"和"擴(kuò)增載體"是指在適當(dāng)生長(zhǎng)條 件下允許該基因擴(kuò)增的基因或編碼基因的載體。
[0101] "模板特異性"在大多數(shù)擴(kuò)增技術(shù)中是通過(guò)酶的選擇來(lái)實(shí)現(xiàn)的。擴(kuò)增酶是這樣的 酶:在它們被使用的條件下，僅加工異源核酸混合物中核酸的特異性序列。例如，就如復(fù)制 酶而言，MDV-1RNA是復(fù)制酶的特異性模板(參見(jiàn)例如Kacian等人，Proc.Natl. Acad. Sci . USA 69:3038[ 1972])。該擴(kuò)增酶不對(duì)其它核酸進(jìn)行復(fù)制。相似地，就T7RNA聚合酶而言，該擴(kuò)增酶 對(duì)其自身啟動(dòng)子具有嚴(yán)格的特異性（參見(jiàn)Chamber 1 in等人，Nature 228: 227 [ 1970 ])。就 T4DNA連接酶而言，當(dāng)寡核苷酸或多核苷酸底物與模板之間在連接結(jié)合點(diǎn)處存在錯(cuò)配時(shí)，該 酶不會(huì)連接兩個(gè)寡核苷酸或多核苷酸(參見(jiàn)Wu和Wallace，Genomics 4: 560[1989])。最后， Taq和Pfu聚合酶由于其能夠在高溫下發(fā)揮作用而發(fā)現(xiàn)對(duì)于被引物結(jié)合并由此被限定的序 列展現(xiàn)出高特異性;高溫導(dǎo)致了有利于引物與靶序列雜交而不與非靶序列雜交的熱力學(xué)條 件。
[0102] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"可擴(kuò)增核酸"是指可通過(guò)任何擴(kuò)增方法進(jìn)行擴(kuò)增的核酸。預(yù)期 "可擴(kuò)增核酸"將通常包括"樣品模板"。
[0103] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"樣品模板"是指源自被用于分析"祀"（在下面給予定義）的存在 的樣品的核酸。相比之下，"背景模板"被用來(lái)指代除樣品模板之外的核酸，其可能存在于或 可能不存在于樣品中。背景模板通常是最容易被疏忽的。這可為物質(zhì)遺留的結(jié)果，或者可能 是由于試圖從樣品中純化去除的核酸污染物的存在。例如，來(lái)自生物體而非那些待檢測(cè)的 核酸可在測(cè)試樣品中作為背景而存在。
[0104] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"引物"是指天然存在的寡核苷酸(如經(jīng)純化限制性消化物中）或 合成產(chǎn)生的寡核苷酸，當(dāng)置于與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成被誘導(dǎo)的條件下（即在 存在核苷酸和誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶的情況下，以及在合適的溫度和pH下）時(shí)，它能夠作為合 成的起始點(diǎn)而發(fā)揮作用。引物優(yōu)選為單鏈以達(dá)到最大的擴(kuò)增效率，但也可為雙鏈。如果是雙 鏈的，在用于制備延伸產(chǎn)物之前，首先對(duì)該引物進(jìn)行處理以使其雙鏈分開(kāi)。優(yōu)選地，引物為 寡聚脫氧核苷酸。該引物必須足夠長(zhǎng)，以在誘導(dǎo)劑存在的情況下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物 的確切長(zhǎng)度將依賴(lài)于許多因素，包括溫度、引物的來(lái)源以及使用的方法。
[0105] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"探針"是指能夠與另一種感興趣的寡核苷酸雜交的一種寡核苷 酸（即核苷酸的序列），無(wú)論其是作為經(jīng)純化限制性酶消化物而天然存在還是以合成、重組 或通過(guò)PCR擴(kuò)增方式而產(chǎn)生。探針可為單鏈或雙鏈的。探針可用于檢測(cè)、鑒定和和分離特定 基因序列。預(yù)期本發(fā)明使用的任何探針都可以用任何"報(bào)告分子"標(biāo)記，以便在任何檢測(cè)系 統(tǒng)中可檢測(cè)到，包括但不限于酶(例如ELISA，以及基于酶的組織化學(xué)測(cè)定法）、熒光、放射活 性和發(fā)光系統(tǒng)。無(wú)意于將本發(fā)明限制為任何特定的檢測(cè)系統(tǒng)或標(biāo)簽。
[0106] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"祀"在用于聚合酶鏈反應(yīng)中時(shí)，是指由用于聚合酶鏈反應(yīng)的引 物所結(jié)合的核酸區(qū)域。因此，試圖將"祀"從其它核酸序列中挑選出來(lái)。"片段"定義為在靶序 列內(nèi)的核酸區(qū)域。
[0107] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"聚合酶鏈反應(yīng)"（"PCR"）是指美國(guó)專(zhuān)利4，683，195 4，683，202和 4，965，188的方法，其以引用方式并入本文，這些專(zhuān)利包括不通過(guò)克隆或純化而提高靶序列 的片段在基因組DNA混合物中的濃度的方法。用于擴(kuò)增靶序列的該過(guò)程包括將大大過(guò)量的 兩種寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混合物中，之后在存在DNA聚合酶的情況下 進(jìn)行精確順序的熱循環(huán)。這兩種引物與其雙鏈靶序列中的對(duì)應(yīng)鏈互補(bǔ)。為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，使混 合物變性，然后使引物退火到其在靶分子內(nèi)的互補(bǔ)序列上。在退火之后，采用聚合酶使引物 延伸，以便形成一對(duì)新的互補(bǔ)鏈。變性、引物退火和聚合酶延伸的步驟可重復(fù)多次（即變性、 退火和延伸構(gòu)成一個(gè)"循環(huán)"；可以有多個(gè)"循環(huán)），以獲得高濃度的期望靶序列的擴(kuò)增片段。 期望靶序列的擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度由引物相對(duì)于彼此的相對(duì)位置決定，因此該長(zhǎng)度為可控制的 參數(shù)。由于該過(guò)程的重復(fù)方面，該方法被稱(chēng)為"聚合酶鏈反應(yīng)"（下文為"PCR"）。由于靶序列 的期望擴(kuò)增片段成為混合物中的優(yōu)勢(shì)序列(就濃度而言），所以它們被稱(chēng)為"PCR擴(kuò)增的"。
[0108] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增試劑"是指除引物、核酸模板和擴(kuò)增酶之外擴(kuò)增所需的那 些試劑(脫氧核糖核苷酸三磷酸、緩沖劑等）。通常，擴(kuò)增試劑以及其它反應(yīng)組分被放置于和 包含于反應(yīng)容器中（試管、微孔等）。
[0109] 借助PCR，可以將基因組DNA中的特定靶序列的單一拷貝擴(kuò)增到通過(guò)幾種不同的方 法可檢測(cè)的水平(例如與標(biāo)記探針雜交；引入生物素?；?，之后進(jìn)行抗生物素蛋白-酶 偶聯(lián)物檢測(cè);將 32P標(biāo)記的脫氧核糖核苷三磷酸例如dCTP或者dATP引入到擴(kuò)增片段中）。除了 基因組DNA之外，任何寡核苷酸或多核苷酸序列也可用適當(dāng)組合的引物分子來(lái)擴(kuò)增。具體 地，經(jīng)由PCR過(guò)程自身而產(chǎn)生的擴(kuò)增片段，其本身就是后續(xù)PCR擴(kuò)增的有效模板。
[0110] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"PCR產(chǎn)物"、"PCR片段"和"擴(kuò)增產(chǎn)物"指在變性、退火和延伸的 PCR步驟的兩個(gè)或更多個(gè)循環(huán)完成后所得的化合物的混合物。這些術(shù)語(yǔ)涵蓋這樣的情況，即 一個(gè)或多個(gè)靶序列的一個(gè)或多個(gè)片段已被擴(kuò)增。 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"RT-PCR"是指RNA序列的復(fù)制和擴(kuò)增。在該方法中，逆轉(zhuǎn)錄與PCR 偶聯(lián)，最經(jīng)常使用其中采用熱穩(wěn)定聚合酶的一步酶法(one enzyme procedure)，如在美國(guó) 專(zhuān)利5，322，770中有所描述，其以引用方式并入本文。在RT-PCR中，RNA模板由于聚合酶的逆 轉(zhuǎn)錄酶活性而轉(zhuǎn)化為cDNA，然后利用聚合酶的聚合活性進(jìn)行擴(kuò)增(即如在其它PCR方法中）。
[0112]如本文所用，"基因改變的宿主菌株"（例如基因改變的芽孢桿菌菌株)是指遺傳工 程化的宿主細(xì)胞，也稱(chēng)為重組宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，與在基本相同的生長(zhǎng)條件下生 長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的宿主細(xì)胞中的相同感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)和/或產(chǎn)量相比，經(jīng)基因改變 的宿主細(xì)胞的感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)(提高）。在一些實(shí)施方案中，增強(qiáng)水平的表達(dá)由 ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性改變引起。在一些實(shí)施方案中，改變的菌株為 具有一個(gè)或多個(gè)缺失的固有染色體區(qū)域或其片段的經(jīng)遺傳工程化的芽孢桿菌屬菌種，其中 與在基本相同的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的芽孢桿菌宿主菌株相比，感興趣的蛋白質(zhì) 具有增強(qiáng)水平的表達(dá)或產(chǎn)量。
[0113] 如本文所用，"相應(yīng)未改變的芽孢桿菌菌株"等為不具有指示的基因改變的宿主菌 株(例如，起始(親本)和/或野生型菌株）。
[0114] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"染色體整合"是指這樣一種方法，通過(guò)該方法將引入序列引入到 宿主細(xì)胞(例如芽孢桿菌）的染色體中。對(duì)轉(zhuǎn)化的DNA的同源區(qū)域與染色體的同源區(qū)域進(jìn)行 比對(duì)。隨后，在雙交換（即同源重組）中，同源盒之間的序列被引入序列替換。在本發(fā)明的一 些實(shí)施方案中，將DNA構(gòu)建體的失活染色體片段的同源部分與芽孢桿菌染色體的固有染色 體區(qū)域的旁側(cè)同源區(qū)進(jìn)行比對(duì)。隨后，在雙交換（即同源重組）中通過(guò)DNA構(gòu)建體缺失掉固有 染色體區(qū)域。
[0115] "同源重組"意指在相同或幾乎相同的核苷酸序列的位點(diǎn)處DNA片段在兩個(gè)DNA分 子或成對(duì)染色體之間進(jìn)行交換。在一個(gè)實(shí)施方案中，染色體整合是同源重組。
[0116]如本文所用"同源序列"意指在最佳比對(duì)進(jìn)行比較時(shí)，核酸或多肽序列與另一個(gè)核 酸或多肽序列有 100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、88%、 85%、80%、75%或70%序列同一性。在一些實(shí)施方案中，同源序列具有85%和100%之間的 序列同一性，而在其它實(shí)施方案中，存在90%和100 %之間的序列同一性，并且在更多實(shí)施 方案中，存在95%和100%的序列同一性。
[0117]如本文所用，"氨基酸"是指肽或蛋白質(zhì)序列或其部分。術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"、"肽"和"多 肽"可互換使用。
[0118]如本文所用，"感興趣的蛋白質(zhì)"和"感興趣的多肽"是指期望的和/或待評(píng)估的蛋 白質(zhì)/多肽。在一些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)，而在其它實(shí)施方案中，其為分泌 性多肽。具體地講，多肽包括酶，包括但不限于選自淀粉分解酶、蛋白水解酶、溶細(xì)胞酶、氧 化還原酶和植物細(xì)胞壁降解酶的那些。更具體地，這些酶包括但不限于淀粉酶、蛋白酶、木 聚糖酶、脂肪酶、漆酶、酚氧化酶、氧化酶、角質(zhì)酶、纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、過(guò)氧化物 酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖氧化酶、植酸酶、果膠酶、葡萄糖苷酶、異構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶 和殼多糖酶。在本發(fā)明的特定實(shí)施方案中，感興趣的多肽為蛋白酶。在一些實(shí)施方案中，感 興趣的蛋白質(zhì)是融合至信號(hào)肽的分泌性多肽（即在待分泌蛋白質(zhì)上氨基端的延伸）。幾乎所 有的分泌性蛋白質(zhì)采用氨基末端蛋白質(zhì)延伸，這在靶向前體蛋白質(zhì)和前體蛋白質(zhì)跨膜運(yùn)輸 中起至關(guān)重要的作用。該延伸在膜傳輸期間或緊接膜傳輸之后通過(guò)信號(hào)肽酶蛋白水解切 除。
[0119]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，感興趣的多肽選自激素、抗體、生長(zhǎng)因子、受體等。本 發(fā)明所涵蓋的激素包括但不限于卵泡刺激激素、黃體化激素、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子、 促生長(zhǎng)素抑制素、促性腺激素、后葉加壓素、催產(chǎn)素、促紅細(xì)胞生成素、胰島素等。生長(zhǎng)因子 包括但不限于血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、成 纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子例如白介素(例如IL-1至IL-13)、干擾素、集落 刺激因子等?？贵w包括但不限于直接從期望由其產(chǎn)生抗體的任何物種獲得的免疫球蛋白。 此外，本發(fā)明涵蓋修飾的抗體。本發(fā)明也涵蓋多克隆和單克隆抗體。在特定實(shí)施方案中，抗 體為人抗體。
[0120] 如本文所用，多肽的"衍生物"或"變體"是指這樣的多肽:通過(guò)在C末端或N末端任 一端或這兩個(gè)末端添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸、在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)不同位點(diǎn)置換一 個(gè)或多個(gè)氨基酸、在多肽的任一端或兩個(gè)末端或在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一 個(gè)或多個(gè)氨基酸、在氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸、以及它們的 任意組合而來(lái)源于前體多肽(例如，天然多肽）。多肽衍生物/變體的制備可以以任意方便的 方式實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)修飾編碼天然多肽的DNA序列、將該DNA序列轉(zhuǎn)化進(jìn)合適的宿主中并使 該經(jīng)修飾的DNA序列表達(dá)而形成衍生多肽/變體多肽。衍生物或變體還包括經(jīng)化學(xué)修飾的多 肽。
[0121] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"異源蛋白質(zhì)"是指不在宿主細(xì)胞中天然出現(xiàn)的蛋白質(zhì)或多肽。 異源蛋白質(zhì)的示例包括酶，例如水解酶，包括蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、糖酶和脂肪酶;異 構(gòu)酶例如消旋酶、表異構(gòu)酶、互變異構(gòu)酶或變位酶;轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在一些實(shí)施方案 中，蛋白質(zhì)是治療上有意義的蛋白質(zhì)或肽，包括但不限于生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、配體、受體和 抑制劑、以及疫苗和抗體。在另外的實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)是商業(yè)上重要的工業(yè)蛋白質(zhì)/肽(例 如蛋白酶、糖酶例如淀粉酶和葡糖淀粉酶、纖維素酶、氧化酶和脂肪酶）。在一些實(shí)施方案 中，編碼蛋白質(zhì)的基因?yàn)樘烊淮嬖诘幕?，而在其它?shí)施方案中，使用突變的和/或合成的 基因。
[0122] 如本文所用，"同源蛋白質(zhì)"是指細(xì)胞中天然的或天然存在的蛋白質(zhì)或多肽。在一 些實(shí)施方案中，細(xì)胞為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，而在特定實(shí)施方案中，細(xì)胞為芽孢桿菌宿主細(xì)胞。 在另選的實(shí)施方案中，同源蛋白質(zhì)是其它生物體產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)，包括但不限于大腸桿 菌(E.coli)。本發(fā)明涵蓋經(jīng)由重組DNA技術(shù)產(chǎn)生同源蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞。
[0123] 如本文所用，"操縱子"包括可從一個(gè)共同的啟動(dòng)子作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位被轉(zhuǎn)錄并由 此經(jīng)受共調(diào)節(jié)的連續(xù)基因組。在一些實(shí)施方案中，操縱子可包括驅(qū)動(dòng)多個(gè)不同mRNA轉(zhuǎn)錄的 多個(gè)啟動(dòng)子。
[0124] 本發(fā)明一般涉及具有導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)提高的基因改變的細(xì)菌細(xì)胞以 及制備和使用該細(xì)胞的方法。本發(fā)明的方面包括革蘭氏陽(yáng)性微生物如芽孢桿菌菌種，其具 有改變ykf操縱子所編碼的蛋白質(zhì)的活性并導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)的基因改變。
[0125] 如上所概述，本發(fā)明的方面包括用于使來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的感興趣的蛋白 質(zhì)的表達(dá)提高的方法，并且基于如下觀(guān)察：在經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中產(chǎn)生的感興 趣的蛋白質(zhì)提高，從而與相應(yīng)的未經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞(例如野生型和/或親本細(xì) 胞）中相同的感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平相比，ykf操縱子(例如ykfA)所編碼的一個(gè)或多個(gè) 蛋白質(zhì)的活性改變。在一些實(shí)施方案中，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行基因改變，以降低由ykf操 縱子(例如ykfA)所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性。在一些實(shí)施方案中，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì) 胞進(jìn)行基因改變，以提高由ykf操縱子(例如ykfA)所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性。遺傳 改變意指宿主細(xì)胞中的任何改變，例如通過(guò)附加體添加和/或染色體插入、缺失、倒位、堿基 改變等改變宿主細(xì)胞基因組成。并非意欲對(duì)這一點(diǎn)進(jìn)行限制。
[0126] 在某些實(shí)施方案中，該方法涉及制備或獲取包含至少一個(gè)基因改變的改變的革蘭 氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，該基因改變使ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性改變并能夠 產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)，并在使得改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的條件下 培養(yǎng)改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞。與基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)相比，感興趣的蛋白質(zhì)在改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞 中的表達(dá)由此提尚。
[0127] 根據(jù)某些實(shí)施方案，經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞(或產(chǎn)生經(jīng)基因改變的革 蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的親本細(xì)胞)可為芽孢桿菌菌株。在一些實(shí)施方案中，感興趣的芽孢桿菌 菌株是嗜堿性的。已知多種嗜堿芽孢桿菌菌株(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利5,217,878;和Aunstrup 等人，Proc IV IFS:Ferment.Technol .Today，299_305[1972])。在一些實(shí)施方案中，感興趣 的芽孢桿菌菌株是工業(yè)芽孢桿菌菌株。工業(yè)芽孢桿菌菌株的示例包括但不限于地衣芽孢桿 菌、遲緩芽孢桿菌(B. 1 entus)、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌。在另外的實(shí)施方案中，芽 孢桿菌宿主菌株選自遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié) 芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌和巨大芽孢桿 菌(B.megaterium)以及如上所述的芽孢桿菌屬內(nèi)的其它生物體。在特定實(shí)施方案中，使用 枯草芽孢桿菌。例如，美國(guó)專(zhuān)利5，264，366和4，760，025 (RE 34，606)描述了在本發(fā)明可使用 的各種芽孢桿菌宿主菌株，但其它適宜的菌株也預(yù)期可用于本發(fā)明。
[0128] 如本文所述的經(jīng)基因改變的細(xì)胞的親本株(例如親本芽孢桿菌菌株)可為工業(yè)用 菌株，其包括非重組菌株、天然存在的菌株的突變變株、或重組菌株。在某些實(shí)施方案中，親 本株為重組宿主菌株，其中已將編碼感興趣的多肽的多核苷酸引入宿主中。雖然編碼感興 趣的多肽的多核苷酸的引入可在親本株中進(jìn)行時(shí)，但該步驟還可在已經(jīng)基因改變以提高多 肽產(chǎn)量(如本文詳述）的菌株中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，宿主菌株為枯草芽孢桿菌宿主菌 株，例如重組枯草芽孢桿菌宿主菌株。
[0129] 已知多種枯草芽孢桿菌菌株可用于本發(fā)明的方面，包括但不限于1A6(ATCC 39085)、168( 1厶01)、5819、123、了885、8637、？81753至？81758、卩83360、貝642、1厶243(厶丁〇： 39,087)、ATCC 21332、ATCC 6051、MI113、DE100(ATCC 39,094)、GX4931、PBT 110和PEP 211 菌株（參見(jiàn)例如Hoch等人，Genetics ,73:215-228[ 1973];美國(guó)專(zhuān)利4,450,235;美國(guó)專(zhuān)利4， 302，544;和EP 0134048) lalva等人和其他人（參見(jiàn)Palva等人，Gene 19:81-87[ 1982];還 參見(jiàn)Fahnestock和Fischer，J.Bacteriol ·，165:796-804[ 1986];和Wang等人，Gene 69:39-47[1988])進(jìn)一步描述了枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主的用途。
[0130] 在某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生芽孢桿菌菌株的工業(yè)用蛋白酶可用作親本表達(dá)宿主。在 一些實(shí)施方案中，在本發(fā)明使用的這些菌株提供效率和蛋白酶產(chǎn)量的進(jìn)一步增強(qiáng)。兩種通 用類(lèi)型的蛋白酶通常由芽孢桿菌屬菌種分泌，即中性(或"金屬蛋白酶"）和堿性(或"絲氨 酸"）蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點(diǎn)存在必需的絲氨酸殘基。 絲氨酸蛋白酶具有范圍為25,000至30,000的分子量（參見(jiàn)Priest，Bacteriol. Rev. ,41: 711-753[1977])。枯草桿菌蛋白酶為用于本發(fā)明的絲氨酸蛋白酶。已鑒定并測(cè)序了各種各 樣的枯草芽孢桿菌，例如枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶BPN'、枯草菌溶素、枯草桿菌 蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶309(參見(jiàn)例如EP 414279 B;W0 89/ 06279;和Stahl等人，J.Bacteriol. ,159:811-818[ 1984])。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，芽 孢桿菌宿主菌株產(chǎn)生突變(例如變體)蛋白酶。多個(gè)參考文獻(xiàn)提供變體蛋白酶和基準(zhǔn)的示例 (參見(jiàn)例如TO 99/20770;W0 99/20726;W0 99/20769;W0 89/06279;RE 34,606;美國(guó)專(zhuān)利4， 914,031;美國(guó)專(zhuān)利4,980，288;美國(guó)專(zhuān)利5,208,158;美國(guó)專(zhuān)利5,310,675;美國(guó)專(zhuān)利5,336， 611;美國(guó)專(zhuān)利5,399,283;美國(guó)專(zhuān)利5,441，882;美國(guó)專(zhuān)利5,482,849 ;美國(guó)專(zhuān)利5,631，217; 美國(guó)專(zhuān)利5,665,587;美國(guó)專(zhuān)利5,700,676;美國(guó)專(zhuān)利5,741，694 ;美國(guó)專(zhuān)利5,858,757;美國(guó) 專(zhuān)利5，880，080;美國(guó)專(zhuān)利6，197，567;和美國(guó)專(zhuān)利6，218，165)。
[0131] 此處應(yīng)注意，本發(fā)明不限于作為感興趣的蛋白質(zhì)的蛋白酶。實(shí)際上，本公開(kāi)涵蓋各 種各樣的感興趣的蛋白質(zhì)，期望該感興趣的蛋白質(zhì)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中的表達(dá)提高（以下 詳述）。
[0132] 在其它實(shí)施方案中，用于本發(fā)明的方面的菌株可在提供有益表型的其它基因中具 有另外的基因改變。例如，可采用在至少一個(gè)以下基因 degU、degS、degR和degQ中包含突變 或缺失的芽孢桿菌屬菌種。在一些實(shí)施方案中，突變?cè)赿egU基因中，例如degU(Hy)32突變。 (參見(jiàn)Msadek等人，J· Bacteriol ·，172:824_834[ 1990];和Olmos等人，Mol .Gen ·Genet ·， 253:562-567[1997])。因此，可用于本發(fā)明的方面的親本/基因改變的革蘭氏陽(yáng)性菌株的一 個(gè)示例為攜帶degU32(Hy)突變的枯草芽孢桿菌細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，芽孢桿菌宿主 可包含scoC4(參見(jiàn)Caldwell等人，J.Bacteriol. ,183 : 7329-7340[2001]) ;spoIIE(參見(jiàn) Arigoni等人，Mol .Microbiol ·，31:1407-1415[ 1999]) ;oppA或opp操縱子的其它基因（參見(jiàn) Perego等人，Mol .Microbiol ·，5:173_185[1991])的突變或缺失。實(shí)際上，預(yù)期opp操縱子中 的任何突變(導(dǎo)致與oppA基因中的突變相同的表型）可用于本發(fā)明的改變的芽孢桿菌菌株 的一些實(shí)施方案中。在一些實(shí)施方案中，這些突變可單獨(dú)發(fā)生，而在其它實(shí)施方案中，存在 突變的組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的改變的芽孢桿菌獲自親本芽孢桿菌宿主菌株，該 菌株已包含一個(gè)或多個(gè)以上所提及基因的突變。在另選實(shí)施方案中，使本發(fā)明的先前經(jīng)基 因改變的芽孢桿菌進(jìn)一步工程化以包含一個(gè)或多個(gè)以上提及基因的突變。
[0133] 在某些實(shí)施方案中，在經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中，ykf操縱子編碼的一個(gè)或 多個(gè)蛋白質(zhì)的活性降低至在基本相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的野生型和/或親本細(xì)胞中的活性水 平的約3%，包括約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11 %、約12%、約 13%、約14%、約 15%、約 16%、約17%、約18%、約19%、約 20%、約 21 %、約 22%、約 23%、約 24%、約 25%、約 26%、約 27%、約28%、約 29%、約30%、約 35%、約40%、約45%、約 50%、約 55%、約60%、約65%、約70%、約75%、或約80%。因此，ykf操縱子中一個(gè)或多個(gè)基因的表 達(dá)減少的范圍可為約3 %至約80 %、約4%至約75%、約5%至約70 %、約6 %至約65 %、約7 % 至約60%、約8%至約50%、約9%至約45%、約10%至約40%、約11 %至約35%、約12%至約 30%、約13%至約25%、約14%至約20%等?？梢钥紤]如上所述范圍內(nèi)的表達(dá)的任何子范 圍。
[0134] 在某些實(shí)施方案中，在經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中，ykf操縱子編碼的一個(gè)或 多個(gè)蛋白質(zhì)的活性提高至在基本相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的野生型和/或親本細(xì)胞中的活性水 平的約3%，包括約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11 %、約12%、約 13%、約14%、約 15%、約 16%、約17%、約18%、約19%、約 20%、約 21 %、約 22%、約 23%、約 24%、約 25%、約 26%、約 27%、約28%、約 29%、約30%、約 35%、約40%、約45%、約 50%、約 55%、約60%、約65%、約70%、約75%、或約80%。因此，ykf操縱子中一個(gè)或多個(gè)基因的表 達(dá)減少的范圍可為約3 %至約80 %、約4%至約75%、約5%至約70 %、約6 %至約65 %、約7 % 至約60%、約8%至約50%、約9%至約45%、約10%至約40%、約11 %至約35%、約12%至約 30%、約13%至約25%、約14%至約20%等?？梢钥紤]如上所述范圍內(nèi)的表達(dá)的任何子范 圍。
[0135] 在某些實(shí)施方案中，與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性 細(xì)菌細(xì)胞中的這些蛋白質(zhì)活性相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞具有改變的YkfA蛋白質(zhì)、 和/或Ykf B蛋白質(zhì)、和/或Ykf C蛋白質(zhì)、和/或Ykf D蛋白質(zhì)、或它們的任何組合的活性。
[0136] 在一個(gè)實(shí)施方案中，突變的基因?qū)儆陔拿窼66超家族。在某些實(shí)施方案中，突變的 基因是屬于肽酶S66超家族的羧肽酶。在某些實(shí)施方案中，突變的羧肽酶與由ykf操縱子編 碼的基因至少60%同源。在某些實(shí)施方案中，突變的羧肽酶與由ykfA(示于SEQ ID NO: 1)編 碼的基因至少60 %同源。
[0137] 在某些實(shí)施方案中，基因改變?cè)趛kf操縱子的ykfA基因中。在親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞 中的ykfA基因（即如本文所述，在被基因改變之前)為與SEQ ID NO: 1有至少60%同一性，包 括與SEQ ID NO: 1有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少 約90 %、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95 %、至少約96%、至少 約97%、至少約98%、至少約99%或100%同一性的基因。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致 與SEQ ID N0:2的第252或253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基 因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí) 施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng) (如示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸 對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)(如示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致 與SEQ ID N0: 2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID N0:2的第253 位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V變?yōu)長(zhǎng)(如示于SEQ ID N0:4)。
[0138] 如所指出的那樣，許多不同蛋白質(zhì)可在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中用作感興趣的蛋白質(zhì) (即其表達(dá)在經(jīng)基因改變的細(xì)胞中提高的蛋白質(zhì)）。感興趣的蛋白質(zhì)可為同源蛋白質(zhì)或異源 蛋白質(zhì)并且可為野生型蛋白質(zhì)或天然或重組變體。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是 酶，其中在某些例子中，該酶選自蛋白酶、纖維素酶、支鏈淀粉酶、淀粉酶、糖酶、脂肪酶、異 構(gòu)酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶和磷酸酶。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶，其中蛋白酶可 為枯草桿菌蛋白酶，例如，該枯草桿菌蛋白酶選自：枯草桿菌蛋白酶168、枯草桿菌蛋白酶 BPN'、枯草菌溶素、枯草桿菌蛋白酶DY、枯草桿菌蛋白酶147、枯草桿菌蛋白酶309、以及它們 的變體。在某些實(shí)施方案中，感興趣的蛋白質(zhì)是熒光蛋白，例如綠熒光蛋白（GFP)。
[0139] 在某些實(shí)施方案中，該方法還包括回收該感興趣的蛋白質(zhì)。因?yàn)楦信d趣的蛋白質(zhì) 在經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞(相較于野生型或親本細(xì)胞）中的表達(dá)/產(chǎn)量的水平提高， 所以與在基本相同的培養(yǎng)條件下（并在相同規(guī)模下）培養(yǎng)的相應(yīng)野生型和/或親本細(xì)胞相 比，回收的感興趣的蛋白質(zhì)的量提高。存在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知的各種測(cè)定法來(lái)檢 測(cè)和測(cè)定細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外表達(dá)的多肽的表達(dá)水平/產(chǎn)量。此類(lèi)測(cè)定法由本發(fā)明的用戶(hù)決定 并可取決于感興趣的蛋白質(zhì)的同一性和/或活性(例如酶活性）。例如，對(duì)于蛋白酶，存在基 于從酪蛋白或血紅蛋白釋放的酸溶性肽而在280nm處測(cè)為吸光度或通過(guò)比色使用Fol in方 法的測(cè)定法（參見(jiàn)例如Bergmeyer等人，"Methods of Enzymatic Analysis"第5卷， Peptidases,Proteinases and their Inhibitors,Verlag Chemie,ffeinheim[1984])〇其 它測(cè)定法涉及生色底物的增溶（參見(jiàn)例如Ward , "Proteinases in Fogarty (編輯）·， Microbial Enzymes and Biotechnology.Applied Science，London，[1983]，第251-317 頁(yè)）。測(cè)定法的其它示例包括琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-對(duì)硝基酰苯胺測(cè)定法(SAAPFpNA)和 2，4，6-三硝基苯磺酸鈉鹽測(cè)定法(TNBS測(cè)定法）。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多個(gè)其它參考文獻(xiàn) 提供適當(dāng)?shù)姆椒ǎ▍⒁?jiàn)例如Wei Is等人，Nucleic Acids Res. 11:7911-7925 [1983]; Christianson等人，Anal · Biochem.，223 :119-129[ 1994];和Hsia等人，Anal Biochem.， 242:221-227[1999])〇
[0140] 也如以上所指出的那樣，用于測(cè)定感興趣的蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中的分泌水平并檢 測(cè)表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法包括使用采用對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)特異的多克隆或單克隆抗體的免 疫測(cè)定法。示例包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、放射免疫測(cè)定法(RIA)、熒光免疫測(cè)定法 (FIA)和熒光激活細(xì)胞分選(FACS)。然而，其它方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并可用于 評(píng)估感興趣的蛋白質(zhì)（參見(jiàn)例如Hampton等人,Serological Methods , A Laboratory Manual, APS Press，St .Paul，MN[ 1990];和 Maddox 等人，J .Exp .Med ·，158:1211 [ 1983])。如 在本領(lǐng)域中已知，用本發(fā)明產(chǎn)生的改變的芽孢桿菌細(xì)胞在適用于在表達(dá)并從細(xì)胞培養(yǎng)物回 收感興趣的多肽的條件下維持和生長(zhǎng)（參見(jiàn)例如Hardwood和Cutting (編輯)Molecular Biological Methods for Bacillus, John Wiley&Sons[1990])。還應(yīng)注意，如本文所述的 經(jīng)基因改變的細(xì)胞可表達(dá)多于一種感興趣的蛋白質(zhì)，包括兩種或更多種、三種或更多種、四 種或更多種、五種或更多種、六種或更多種、七種或更多種、八種或更多種、九種或更多種、 十種或更多種等。在一些實(shí)施方案中，期望細(xì)菌分泌蛋白質(zhì)組中的蛋白質(zhì)表達(dá)提高，其包括 由細(xì)胞分泌的多種不同蛋白質(zhì)。
[0141] 本發(fā)明的方面包括一種用于獲取具有改善的蛋白質(zhì)產(chǎn)生能力的改變的革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌細(xì)胞的方法。一般來(lái)講，該方法包括對(duì)親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行基因改變以產(chǎn)生經(jīng) 基因改變的菌株，其中ykf操縱子編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性改變(如上定義）。
[0142] 在某些實(shí)施方案中，該方法包括將多核苷酸序列引入親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞 中，在整合進(jìn)染色體或作為附加體遺傳因子維持時(shí)，產(chǎn)生經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞，其 中ykf操縱子編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性改變。
[0143] 已知轉(zhuǎn)化芽孢桿菌菌種的各種方法，從而采用多核苷酸載體(例如質(zhì)粒構(gòu)建體)改 變芽孢桿菌的染色體或維持芽孢桿菌中的附加體遺傳因子，這是公知的。用于將多核苷酸 序列引入到芽孢桿菌細(xì)胞中的適宜方法見(jiàn)于例如Ferrari等人，"Genetics，" in Harwood等 人（編輯），Bacillus，Plenum Publishing Corp. [1989]，第57-72頁(yè)；還可參見(jiàn)Saunders等 人，J.Bacteriol.，157:718-726[1984] ;Hoch等人，J.Bacteriol.，93:1925-1937[1967]; Mann等人，Current Microbiol ·，13:131-135[ 1986];和Holubova，F(xiàn)olia Microbiol ·，30: 97[ 1985];對(duì)于枯草芽抱桿菌，Chang等人，Mol .Gen.Genet · ,168:11_115[1979];對(duì)于巨大 芽抱桿菌，Vorobjeva等人，F(xiàn)EMS Microbiol .Lett.，7:261_263[1980];對(duì)于解淀粉芽抱桿 菌，Smith等人，Appl ·Εην·Microbiol · ,51:634(1986);對(duì)于蘇云金芽抱桿菌，F(xiàn)isher等人， Arch.Microbiol. , 139:213-217[1981];并且對(duì)于球形芽抱桿菌（Β· sphaericus)， McDonald，J.Gen.Microbiol. ,130:203[ 1984]。實(shí)際上，諸如轉(zhuǎn)化(包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和中 板集合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和原生質(zhì)體融合)之類(lèi)的方法是已知的并且適用于本發(fā)明。轉(zhuǎn)化的方法具體地 而言是將本發(fā)明提供的DNA構(gòu)建體引入到宿主細(xì)胞中。
[0144] 此外，DNA構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的引入包括本領(lǐng)域已知的物理和化學(xué)方法來(lái)將DNA引 入到宿主細(xì)胞中而無(wú)需將靶向DNA構(gòu)建體插入到質(zhì)?；蜉d體中。此類(lèi)方法包括但不限于氯 化鈣沉淀、電穿孔、裸DNA、脂質(zhì)體等。在另外的實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體可與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，而 無(wú)需插入質(zhì)粒中。
[0145] 在其中可選標(biāo)記基因用于選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體的一些實(shí)施方案中，可期望使用任何 常規(guī)方法從經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性菌株中除去選擇性標(biāo)記，其中許多方法在本領(lǐng)域中是 已知的（參見(jiàn)Stahl等人，J.Bacteriol ·，158:411-418[1984];和Palmeros等人，Gene 247: 255-264[2000])。
[0146] 在一些實(shí)施方案中，將兩個(gè)或更多個(gè)DNA構(gòu)建體（即各自設(shè)計(jì)用于基因改變宿主細(xì) 胞的DNA構(gòu)建體）引入到親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞中，從而導(dǎo)致將兩個(gè)或更多個(gè)基因改變引入細(xì) 胞中，例如在兩個(gè)或更多個(gè)染色體區(qū)域的改變。在一些實(shí)施方案中，這些區(qū)域是連續(xù)的（例 如在ykf操縱子內(nèi)或在ykf操縱子和相鄰基因或操縱子內(nèi)的兩個(gè)區(qū)域），而在其它實(shí)施方案 中，區(qū)域是分開(kāi)的。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)基因改變通過(guò)添加附加體遺傳因子實(shí) 現(xiàn)。
[0147] 在一些實(shí)施方案中，用一個(gè)或多個(gè)根據(jù)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生 改變的芽孢桿菌菌株，其中兩個(gè)或更多個(gè)基因在宿主細(xì)胞中已失活。在一些實(shí)施方案中，宿 主細(xì)胞染色體中缺失兩個(gè)或更多個(gè)基因。在另選的實(shí)施方案中，通過(guò)插入DNA構(gòu)建體而使兩 個(gè)或更多個(gè)基因失活。在一些實(shí)施方案中，失活基因是連續(xù)的（無(wú)論是通過(guò)缺失和/或插入 而失活），而在其它實(shí)施方案中，它們不是連續(xù)的基因。
[0148] 一旦產(chǎn)生經(jīng)基因改變的宿主細(xì)胞，就可在使得感興趣的蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下對(duì)其 進(jìn)行培養(yǎng)，而在某些實(shí)施方案中，對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行回收。
[0149] 本發(fā)明的方面包括改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下 生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞相比，改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞包含至少一個(gè) 基因改變，所述基因改變使ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性改變。在一些實(shí)施 方案中，經(jīng)基因改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)胞如上文所述產(chǎn)生。進(jìn)一步由上可見(jiàn)，改變的革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌細(xì)胞可為芽孢桿菌屬菌種的菌株，例如地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、枯草芽孢桿 菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀 芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、克勞氏芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿 菌菌株。在某些實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬菌種的菌株為枯草芽孢桿菌菌株。在一些方面，改 變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞還包含改善細(xì)胞表型的附加突變，例如在選自d egU、degQ、degS、 SC〇C4、sp〇IIE和oppA的基因中的突變。在某些實(shí)施方案中，突變?yōu)閐egU(Hy)32。
[0150] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括包含引入序列的DNA構(gòu)建體，該引入序列在穩(wěn)定摻 入宿主細(xì)胞時(shí)會(huì)使細(xì)胞發(fā)生基因改變，使得ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性 改變(如以下所詳述）。在一些實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體在體外組裝，之后將構(gòu)建體直接克隆 到感受態(tài)革蘭氏陽(yáng)性(例如芽孢桿菌)宿主中，使得DNA構(gòu)建體整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中。例 如，PCR融合和/或連接可用于在體外組裝DNA構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，DNA構(gòu)建體為非質(zhì) 粒構(gòu)建體，而在其它實(shí)施方案中，將其摻入載體(例如質(zhì)粒）中。在一些實(shí)施方案中，使用環(huán) 狀質(zhì)粒。在一些實(shí)施方案中，環(huán)狀質(zhì)粒設(shè)計(jì)成使用適當(dāng)?shù)南拗菩悦福床黄茐腄NA構(gòu)建體的 限制性酶）。因此，線(xiàn)性質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明。然而，其它方法適用于本發(fā)明，如本領(lǐng)域技術(shù)人 員所知的（參見(jiàn)例如，Perego，"Integrational Vectors for Genetic Manipulation in Bacillus subtilis，'' in(Sonenshein等人（編輯），Bacillussubtilis and Other Gram-Positive Bacteria,American Society for Microbiology Washington,DC[1993])〇
[0151] 在某些實(shí)施方案中，DNA靶向載體的引入序列包括包含來(lái)源于ykfA基因的變體序 列的多核苷酸。在這些實(shí)施方案的一些中，變體序列的長(zhǎng)度為至少約15個(gè)核苷酸，與全部或 部分SEQ ID NO: 1有至少60%同一性，并且在ykfA基因的核苷酸位置具有至少一個(gè)突變，從 而當(dāng)突變存在于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)源性ykfA基因中時(shí)導(dǎo)致ykf操縱子編碼的蛋白質(zhì) 的活性改變。變體序列可為至少約20個(gè)核苷酸、約30個(gè)核苷酸、約40個(gè)核苷酸、約50個(gè)核苷 酸、約60個(gè)核苷酸、約80個(gè)核苷酸、約90個(gè)核苷酸、約100個(gè)核苷酸、約200個(gè)核苷酸、約300個(gè) 核苷酸、約400個(gè)核苷酸、約500個(gè)核苷酸、約600個(gè)核苷酸、約700個(gè)核苷酸、約800個(gè)核苷酸、 約900個(gè)核苷酸、約1000個(gè)核苷酸、約1100個(gè)核苷酸、約1200個(gè)核苷酸、約1300個(gè)核苷酸、約 1400個(gè)或更多個(gè)核苷酸。如以上進(jìn)一步指出，變體序列可與SEQ ID NO: 1有至少60%同一 性，包括與SEQ ID NO: 1有至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、 至少約90%、至少約91 %、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、 至少約97%、至少約98%或至少約99%同一性。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第252或253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo) 致與SEQ ID N0:2的第252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中， 基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0: 2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)(如示于 SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的 位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)(如示于SEQ ID N0:4)。在某些實(shí)施方案中，基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID N0: 2的第253位氨基 酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V變?yōu)長(zhǎng)(如示于SEQ ID N0:4)。
[0152] 本發(fā)明的方面包括包含如上所述的多核苷酸序列的載體。在某些實(shí)施方案中，載 體是靶向載體，所述靶向載體被設(shè)計(jì)成在轉(zhuǎn)化到革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中時(shí)通過(guò)同源重組將 多核苷酸序列中的至少一個(gè)突變引入到革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的ykf操縱子中的對(duì)應(yīng)位置。 在一些實(shí)施方案中，引入序列/載體包含選擇性標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，選擇性標(biāo)記位于 兩個(gè)ΙοχΡ位點(diǎn)之間（參見(jiàn)Kuhn和Torres，Meth.Mol .Biol ·，180:175-204[2002])，并且然后 抗微生物基因通過(guò)Cre蛋白質(zhì)的作用而缺失。
[0153] 本發(fā)明的方面包括一種用于增強(qiáng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá) 的方法，該方法包括用以上所述DNA構(gòu)建體或載體(即包含引入序列的DNA構(gòu)建體或載體，該 引入序列在穩(wěn)定摻入宿主細(xì)胞時(shí)會(huì)使細(xì)胞發(fā)生基因改變，使得ykf操縱子所編碼的一個(gè)或 多個(gè)蛋白質(zhì)的活性改變，例如在如上所述ykf A基因中包含突變的DNA構(gòu)建體或載體)轉(zhuǎn)化親 本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，從而允許載體和親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的ykf操縱子中的相應(yīng) 區(qū)域發(fā)生同源重組以產(chǎn)生改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞;并使改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞在 適于表達(dá)感興趣的蛋白質(zhì)的條件下生長(zhǎng)，其中與在轉(zhuǎn)化步驟之前的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞相 比，在改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中產(chǎn)生的感興趣的蛋白質(zhì)提高?？捎糜诒景l(fā)明的該方面 的革蘭氏陽(yáng)性菌株、突變及其它特征的示例如上所詳述。
[0154] 無(wú)論DNA構(gòu)建體摻入載體中或在不存在質(zhì)粒DNA的情況下使用，其均用于轉(zhuǎn)化微生 物。預(yù)期用于轉(zhuǎn)化的任何適宜方法可用于本發(fā)明。在一些實(shí)施方案中，將DNA構(gòu)建體的至少 一個(gè)拷貝整合進(jìn)宿主芽孢桿菌染色體中。在一些實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)DNA 構(gòu)建體來(lái)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
[0155] 本領(lǐng)域技術(shù)人員參照以下實(shí)施例，可以更充分理解實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方式和方法，這 些實(shí)施例并非意在以任何方式限制本發(fā)明或其權(quán)利要求書(shū)指定的范圍。
[0156]
[0157] 提供下面的實(shí)施例，從而證明和進(jìn)一步闡述本發(fā)明的某些實(shí)施方案和方面，但不 應(yīng)該理解為限制其范圍。
[0158] 在隨后的實(shí)驗(yàn)公開(kāi)中，應(yīng)用以下縮寫(xiě)中的某些：°°C(攝氏度）；rpm(轉(zhuǎn)/分鐘）；yg (微克）;mg(毫克）；μ1(微升）;ml(毫升）;mM(毫摩爾）;μΜ(微摩爾）；sec(秒）;min(s)(分鐘）； hr(s)(小時(shí)）；0D28Q(280nm處光密度）；0D6(x)(600nm處光密度）；PCR(聚合酶鏈反應(yīng)）；RT-PCR (逆轉(zhuǎn)錄PCR) ;SDS(十二烷基硫酸鈉）。
[0159] 實(shí)施例1
[Ο·] ykf A基因的突變對(duì)芽孢桿菌菌種中蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
[0161] 枯草芽孢桿菌的ykfA基因是參與肽聚糖的循環(huán)利用的ykf操縱子（圖1)的第一編 碼序列。YfkA是切割L-和D-氨基酸之間酰胺鍵的LD-羧肽酶，其天然存在于細(xì)菌肽聚糖中。
[0162] 已鑒定出三種單核苷酸多態(tài)性，其導(dǎo)致芽孢桿菌菌株的ykfA基因的兩種非同義突 變(P252L和V253L)。使用Janes和Stibitz( Infection and Immunity，74(3): 1949，2006)所 述的方法將}^1^4突變引入適宜的芽孢桿菌菌株0515-14(31115^::1711^1714(3〇1111(-61'111〇，八 ορρΑ, Δ spoIIE, Δ aprE, Δ nprE，degUHy32，Δ scoC)中。
[0163] 為了測(cè)試ykfA突變對(duì)FNA蛋白酶(包含Y217L取代的枯草桿菌蛋白酶BPN'）表達(dá)的 影響，將PaprE-FNA catR構(gòu)建體引入CB15-14和CB15-14ykfA突變株的aprE基因座中，并在 含有25μg/ml氯霉素的Luria瓊脂平板上對(duì)構(gòu)建體進(jìn)行擴(kuò)增。使ykfA突變的菌株和野生型菌 株在5mL的Luria肉湯培養(yǎng)基(Luria broth medium)中生長(zhǎng)過(guò)夜。在250rpm下用lml的預(yù)培 養(yǎng)物在Thompson燒瓶中接種25ml的2XNB(2X營(yíng)養(yǎng)肉湯，1XSNB鹽，如在W02010/14483中有所 描述），以測(cè)試蛋白酶表達(dá)。使用SpectraMax分光光度計(jì)(Molecular Devices，Downington, PA，USA)以每小時(shí)間隔在600nm處測(cè)定稀釋20X的整個(gè)液體培養(yǎng)基的細(xì)胞密度。使600nm處的 吸光度作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行作圖，并且結(jié)果示于圖2Α<^1^Α突變的存在導(dǎo)致2XSNB培養(yǎng)基中 細(xì)胞的生長(zhǎng)更高。
[0164] 用N-suc-AAPF-pNA底物（得自Sigma Chemical Co.)來(lái)監(jiān)測(cè)蛋白酶表達(dá)，如在W0 2010/144283中有所描述。簡(jiǎn)而言之，整個(gè)液體培養(yǎng)基用測(cè)定緩沖液（100mM Tris，0.005% Tween 80，pH 8.6)稀釋40X，并使10μ1的經(jīng)稀釋樣品排列在微量滴定板中。對(duì)AAPF原液進(jìn)行 稀釋并將測(cè)定緩沖液（用DMS0將100mg/ml AAPF原液稀釋100X)和190μ1的該溶液添加至微 量滴定板中，并使用SpectraMax分光光度計(jì)(Molecular Devices，Downington，PA,USA)在 405nm處測(cè)定溶液的吸光度。使405nm處的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行作圖，并且結(jié)果示于 圖2B。FNA的產(chǎn)量在較后的時(shí)間點(diǎn)(8小時(shí))提高，這是由于ykf A突變。
[0165] 實(shí)施例2
[0166] ykfA突變對(duì)芽孢桿菌菌種中綠熒光蛋白表達(dá)的影響
[0167]為了測(cè)試ykfA突變對(duì)其它蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，將PaprE-GFP catR構(gòu)建體引入 CB15-14和CB15-14ykfA突變株的aprE基因座中，并在含有5μg/ml氯霉素的Luria瓊脂平板 上選擇轉(zhuǎn)化體。使ykfA突變的菌株和野生型菌株在5mL的Luria肉湯中生長(zhǎng)過(guò)夜。在37°C和 250rpm下用lml的預(yù)培養(yǎng)物在搖瓶中接種25ml的2XNB培養(yǎng)基(2X營(yíng)養(yǎng)肉湯，IX SNB鹽），以測(cè) 試綠色焚光蛋白（GFP)的表達(dá)。使用SpectraMax分光光度計(jì)（Molecular Devices， Downington，PA，USA)以每小時(shí)間隔在600nm處測(cè)定稀釋20X的整個(gè)液體培養(yǎng)基的細(xì)胞密度。 使600nm處的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行作圖，并且結(jié)果示于圖3A。在進(jìn)入穩(wěn)定期（在2XNB 中生長(zhǎng)的4至6小時(shí)之間）時(shí)，ykfA突變株的細(xì)胞生長(zhǎng)的下降相較于對(duì)照菌株有延緩，這表明 改善的細(xì)胞生存力歸因于ykfA突變。
[0168] 為了測(cè)定GFP表達(dá)，將100μΙ的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板并在熒光讀板機(jī)(采 用485nm的激發(fā)波長(zhǎng)，508nm的發(fā)射波長(zhǎng)，具有495nm發(fā)射截止濾波器）中測(cè)定GFP表達(dá)。使 485/508nm處的相對(duì)熒光單位(RFU)作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行作圖，并且結(jié)果示于圖3BXFP的產(chǎn) 量從生長(zhǎng)6小時(shí)提高，這是由于ykfA突變。
[0169] 實(shí)施例3
[0170] ykfA突變對(duì)芽孢桿菌菌種中β-D-葡糖苷酶表達(dá)的影響
[0171] 為了測(cè)試ykfA突變對(duì)β-D-葡糖苷酶表達(dá)的影響，將PaprE-BglC catR構(gòu)建體引入 CB15-14和CB15-14ykfA突變株的aprE基因座中，并在含有5μg/ml氯霉素的Luria瓊脂平板 上選擇轉(zhuǎn)化體。使ykfA突變的菌株和野生型菌株在5mL的Luria肉湯中生長(zhǎng)過(guò)夜。在37°C和 250rpm下用lml的預(yù)培養(yǎng)物在搖瓶中接種25ml的2XNB培養(yǎng)基(2X營(yíng)養(yǎng)肉湯，IX SNB鹽），以測(cè) 試分泌的β-D-葡糖苷酶的表達(dá)。使用SpectraMax分光光度計(jì)（Molecular Devices， Downington，PA，USA)以每小時(shí)間隔在600nm處測(cè)定稀釋20X的整個(gè)液體培養(yǎng)基的細(xì)胞密度。 使600nm處的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行作圖，并且結(jié)果示于圖4A。包含ykfA突變的細(xì)胞具 有更高的細(xì)胞生長(zhǎng)，這表明由于存在ykfA突變而使細(xì)胞生存力改善。
[0172] 使用4-硝基苯基-β-D-纖維二糖底物(Sigma Chemicals, St .Louis，M0, USA, Cat·# N57590)來(lái)監(jiān)測(cè)β-D-葡糖苷酶表達(dá)。將底物溶解于lml的DMS0中以制成lOOmg/ml的原液。通 過(guò)用l〇ml的測(cè)定緩沖液（100mM Tris，0.005%Tween 80，pH 8.6)稀釋35μ1的原液來(lái)制備底 物工作溶液。將40微升的各培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板中并向各個(gè)孔添加180μ1的底物 工作溶液。在室溫下將微量滴定板溫育5小時(shí)，并且在溫育期結(jié)束時(shí)，用SpectraMax分光光 度計(jì)(]\1〇16〇111&1〇6￥；[06 8,00￥11；[1^1:011，？4，1]34)在405111]1處測(cè)定溶液的吸光度。使405111]1處 的吸光度作為時(shí)間的函數(shù)進(jìn)行作圖，并且結(jié)果示于圖4B』glC的產(chǎn)量在所有時(shí)間點(diǎn)提高，這 是由于存在ykfA突變。
[0173]根據(jù)上述數(shù)據(jù)，顯而易見(jiàn)的是，當(dāng)在相同或基本相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)時(shí)，革蘭氏 陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞（即相較于親本細(xì)胞）中ykf操縱子(例如ykfA基因）所編碼的蛋白質(zhì)的活性的 改變導(dǎo)致感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)相較于親本細(xì)胞而言提高。
[0174] 雖然出于清楚地理解的目的通過(guò)說(shuō)明和實(shí)施例對(duì)前述組合物和方法進(jìn)行了相當(dāng) 詳細(xì)的描述，但根據(jù)本文的教導(dǎo)，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，在不脫離 所附權(quán)利要求書(shū)的精神或范圍的情況下，可以對(duì)前述組合物和方法進(jìn)行某些改變和修改。
[0175] 因此，以上僅僅示例了本發(fā)明組合物和方法的原理。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員能 夠設(shè)計(jì)出各種布置，盡管這些布置在本文中未明確說(shuō)明或示出，但它們?nèi)泽w現(xiàn)了本發(fā)明組 合物和方法的原理并且包括在其精神和范圍內(nèi)。此外，本文引用的所有實(shí)施例和條件語(yǔ)言 原則上旨在輔助讀者理解本發(fā)明的組合物和方法的原理及
【發(fā)明人】為改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)所貢獻(xiàn) 的概念，并且應(yīng)當(dāng)理解為不局限于這些具體引用的實(shí)施例和條件。此外，本文闡述的本發(fā)明 的組合物和方法的原理、方面和實(shí)施方案以及其具體實(shí)施例的所有表述旨在涵蓋其結(jié)構(gòu)和 功能的等同物。此外，希望此類(lèi)等同物包括當(dāng)前已知的等同物以及未來(lái)開(kāi)發(fā)的等同物，即所 開(kāi)發(fā)的任何執(zhí)行相同功能的要素，無(wú)論結(jié)構(gòu)如何。因此本發(fā)明的組合物和方法的范圍并非 旨在限于本文所示和所述的實(shí)施方案。
[0176] )ψβ]
[0177] SEQ ID Ν0:1 -ykfA野生型核苷酸序列
[0178] atgaaaggagtgttttcgttgaattacaagccgaaagcgttgaacaagggtgatacagtcggagtgatcgcgcccgc aagtccgccggatccaaaaaagcttgacaccgcgcttttatttttagaagagctcggtcttcaggtgaagttgggca aggcgctgaaaaaccagcacggctatttagcgggacaggatgatgagcggctggcggatctccatgagatgttcaga gacgatgaggtaaaagcagtgttgtgcgcatgcgggggttttgggacaggacgtatcgccgcgggcattgatttcag cttgatccgcaaacaccctaaaatcttttggggatacagcgatattacgtttttacatactgccattcatcaaaaca caggtcttgtcactttccatggcccgatgctcagcacggatattggccttgacgacgttcacccgctgacaaaagcg tcatataagcagctcttccaggagacggaattcacctatacagaagagctttctccgctgaccgagcttgttcctgg aaaagcggaaggcgagcttgtcgggggaaatctgtctttgctgacgtctacactgggcacgccatttgaaattgata cgagaggaaagcttctgtttattgaagatattgacgaggagccttatcaaatcgaccggatgctgaatcagctgaaa atgggggggaagctgacggacgcggcgggaattctagtttgtgattttcacaattgtgtcccggtgaagcgagagaa gtctctctcgcttgagcaggtgctggaagactatattatttctgcgggcaggcctgctctgagaggatttaaaatcg gccactgctcgccaagtattgccgttccgatcggtgcgaaagctgctatgaatacagcagaaaaaacagccgtaata gaggcgggcgtttcagaaggggcgctgaagacatga
[0179] SEQ ID NO:2-YkfA野生型蛋白質(zhì)序列
[0180] MKGVFSLNYKPKALNKGDTVGVIAPASPPDPKKLDTALLFLEELGLQVKLGKALKNQHGYLAGQDDERL ADLHEMFRDDEVKAVLCACGGFGTGRIAAGIDFSLIRKHPKIFWGYSDITFLHTAIHQNTGLVTFHGPMLSTDIGLD DVHPLTKASYKQLFQETEFTYTEELSPLTELVPGKAEGELVGGNLSLLTSTLGTPFEIDTRGKLLFIEDIDEEPYQI DRMLNQLKMGGKLTDAAGILVCDFHNCVPVKREKSLSLEQVLEDYIISAGRPALRGFKIGHCSPSIAVPIGAKAAMN TAEKTAVIEAGVSEGALKT
[0181] SEQ ID NO :3-ykfA突變核苷酸序列
[0182] atgaaaggagtgttttcgttgaattacaagccgaaagcgttgaacaagggtgatacagtcggagtgatcgcgcccgc aagtccgccggatccaaaaaagcttgacaccgcgcttttatttttagaagagctcggtcttcaggtgaagttgggca aggcgctgaaaaaccagcacggctatttagcgggacaggatgatgagcggctggcggatctccatgagatgttcaga gacgatgaggtaaaagcagtgttgtgcgcatgcgggggttttgggacaggacgtatcgccgcgggcattgatttcag cttgatccgcaaacaccctaaaatcttttggggatacagcgatattacgtttttacatactgccattcatcaaaaca caggtcttgtcactttccatggcccgatgctcagcacggatattggccttgacgacgttcacccgctgacaaaagcg tcatataagcagctcttccaggagacggaattcacctatacagaagagctttctccgctgaccgagcttgttcctgg aaaagcggaaggcgagcttgtcgggggaaatctgtctttgctgacgtctacactgggcacgccatttgaaattgata cgagaggaaagcttctgtttattgaagatattgacgaggagccttatcaaatcgaccggatgctgaatcagctgaaa atgggggggaagctgacggacgcggcgggaattctagtttgtgattttcacaattgtgtcctgctcaagcgagagaa gtctctctcgcttgagcaggtgctggaagactatattatttctgcgggcaggcctgctctgagaggatttaaaatcg gccactgctcgccaagtattgccgttccgatcggtgcgaaagctgctatgaatacagcagaaaaaacagccgtaata gaggcgggcgtttcagaaggggcgctgaagacatga
[0183] SEQ ID N0:4:YkfA突變蛋白質(zhì)序列（具有P252L和V253L改變)
[0184] MKGVFSLNYKPKALNKGDTVGVIAPASPPDPKKLDTALLFLEELGLQVKLGKALKNQHGYLAGQDDERL ADLHEMFRDDEVKAVLCACGGFGTGRIAAGIDFSLIRKHPKIFWGYSDITFLHTAIHQNTGLVTFHGPMLSTDIGLD DVHPLTKASYKQLFQETEFTYTEELSPLTELVPGKAEGELVGGNLSLLTSTLGTPFEIDTRGKLLFIEDIDEEPYQI DRMLNQLKMGGKLTDAAGILVCDFHNCVLLKREKSLSLEQVLEDYIISAGRPALRGFKIGHCSPSIAVPIGAKAAMN TAEKTAVIEAGVSEGALKT
[0185] SEQ ID N0:5:FNA蛋白質(zhì)序列（具有原結(jié)構(gòu)域)
[0186] AQSVPYGVSQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGI DSSHPDLKVAGGASMVPSETNPFQDNNSHGTHVAGTVAA LNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLGADGSGQYSWIINGIEW AIANNMDVINMSLGGPSGSAALKAAVDKAVASGVVVVAA AGNEGTSGSSSTVGYPGKYPSVIAVGAVDSSNQRASFSS VGPELDVMAPGVSIQSTLPGNKYGALNGTSMASPHVAGA AALILSKHPNWTNTQVRSSLENTTTKLGDSFYYGKGLIN V Q A A A Q
[0187] SEQ ID NO:6:GFP蛋白質(zhì)序列
[0188] VNRNVLKNTGLKEIMSAKASVEGIVNNHVFSMEGF GKGNVLFGNQLMQIRVTKGGPLPFAFDIVSIAFQYGNRT FTKYPDDIADYFVQSFPAGFFYERNLRFEDGAIVDIRSD ISLEDDKFHYKVEYRGNGFPSNGPVMQKAILGMEPSFEV VYMNSGVLVGEVDLVYKLESGNYYSCHMKTFYRSKGGVK EFPEYHFIHHRLEKTYVEEGSFVEQHETAIAQLTTIGKP LGSLHEWV
[0189] SEQ ID N0:7:BglC蛋白質(zhì)序列
[0190] AAGTKTPVAKNGQLSIKGTQLVNRDGKAVQLKGIS SHGLQWYGEYVNKDSLKWLRDDWGITVFRAAMYTADGGY IDNPSVKNKVKEAVEAAKELGIYVIIDWHILNDGNPNQN KEKAKEFFKEMSSLYGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDI KPYAEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAADDQL KDANVMYALHFYAGTHGQFLRDKANYALSKGAPIFVTEff GTSDASGNGGVFLDQSREWLKYLDSKTISffVNWNLSDKQ ESSSALKPGASKTGGWRLSDLSASGTFVRENILGTKDST KDIPETPSKDKPTQENGISVQYRAGDGSMNSNQIRPQLQ IKNNGNTTVDLKDVTARYWYKAKNKGQNFDCDYAQIGCG NVTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKNGTLAPGASTGNIQ LRLHNDDWSNYAQSGDYSFFKSNTFKTTKKITLYDQGKL I ff G T E P N
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于使來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)提高的方法，所述方 法包括： a) 獲取能夠產(chǎn)生感興趣的蛋白質(zhì)的改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，其中所述改變的革蘭 氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞包含至少一個(gè)改變ykf操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性的基因改 變；以及 b) 在使得所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞表達(dá)所述感興趣的蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所 述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭 氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中所述感興趣的蛋白質(zhì)的表達(dá)相比，所述感興趣的蛋白質(zhì)在所述改變的革 蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中的表達(dá)提高。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞是芽孢桿菌屬菌 種(Bacillus sp.)的菌株。3. 根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相 應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞 具有改變的Ykf A蛋白質(zhì)活性。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相 應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞 具有降低的YkfA蛋白質(zhì)活性。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相 應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞 具有提尚的Ykf A蛋白質(zhì)活性。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述突變?cè)谒鰕kf操縱子的ykfA基 因中。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述ykfA基因與SEQ ID NO: 1有至少60%同一性。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252或253位 氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。9. 根據(jù)權(quán)利要求7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第 252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基 酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)。11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第253位氨基 酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)。12. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252位氨基 酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID NO:2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處V 變?yōu)棣│? 根據(jù)權(quán)利要求 1 至 12 中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述感興趣的蛋白質(zhì)是酶。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括回收所述感興趣的蛋白 質(zhì)。16. -種改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的相應(yīng)未 改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞包含至少一個(gè)改變ykf 操縱子所編碼的一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)的活性的基因改變。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的改變的細(xì)胞，其中所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞是芽孢 桿菌屬菌種的菌株。18. 根據(jù)權(quán)利要求16至17中任一項(xiàng)所述的改變的細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件 下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌細(xì)胞具有改變的YkfA蛋白質(zhì)活性。19. 根據(jù)權(quán)利要求16至17中任一項(xiàng)所述的改變的細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件 下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌細(xì)胞具有降低的YkfA蛋白質(zhì)活性。20. 根據(jù)權(quán)利要求16至17中任一項(xiàng)所述的改變的細(xì)胞，其中與在基本相同的培養(yǎng)條件 下生長(zhǎng)的相應(yīng)未改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中YkfA蛋白質(zhì)活性相比，所述改變的革蘭氏陽(yáng) 性細(xì)菌細(xì)胞具有提高的YkfA蛋白質(zhì)活性。21. 根據(jù)權(quán)利要求16至20中任一項(xiàng)所述的改變的細(xì)胞，其中所述突變?cè)谒鰕kf操縱子 的ykfA基因中。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的改變的細(xì)胞，其中所述ykfA基因與SEQ ID NO: 1有至少60% 同一,性。23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的改變的細(xì)胞，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO: 2的第 252或253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。24. 根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的改變的細(xì)胞，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID NO:2的第252和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。25. 根據(jù)權(quán)利要求21至23所述的改變的細(xì)胞，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的 第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)。26. 根據(jù)權(quán)利要求21至23所述的改變的細(xì)胞，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的 第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)。27. 根據(jù)權(quán)利要求21至23所述的改變的細(xì)胞，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的 第252位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID NO: 2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨 基酸位置處V變?yōu)長(zhǎng)。28. 根據(jù)權(quán)利要求16至27中任一項(xiàng)所述的改變的細(xì)胞，其中所述改變的細(xì)胞表達(dá)感興 趣的蛋白質(zhì)。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的改變的細(xì)胞，其中所述感興趣的蛋白質(zhì)是酶。30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的改變的細(xì)胞，其中所述感興趣的蛋白質(zhì)是蛋白酶。31. -種包含來(lái)源于ykf A基因的變體序列的多核苷酸，其中所述變體序列： 長(zhǎng)度為至少15個(gè)核苷酸， 與全部或部分SEQ ID NO: 1有至少60%同一性，并且 包含至少一個(gè)在ykfA基因中的核苷酸位置處的基因改變，當(dāng)所述至少一個(gè)突變存在于 革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的內(nèi)源性ykf A基因中時(shí)，所述基因改變導(dǎo)致Ykf A蛋白質(zhì)的活性改變。32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252 或253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。33. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252 和253位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸改變。34. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252 位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由P變?yōu)長(zhǎng)。35. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第253 位氨基酸對(duì)應(yīng)的位置處的氨基酸由V變?yōu)長(zhǎng)。36. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的多核苷酸，其中所述基因改變導(dǎo)致與SEQ ID N0:2的第252 位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸位置處P變?yōu)長(zhǎng)以及與SEQ ID NO: 2的第253位氨基酸對(duì)應(yīng)的氨基酸 位置處V變?yōu)長(zhǎng)。37. -種包含權(quán)利要求31至36中任一項(xiàng)所述的多核苷酸序列的載體。38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的載體，其中所述載體是革E1向載體，所述祀向載體被設(shè)計(jì)成在 轉(zhuǎn)化到所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中時(shí)通過(guò)同源重組將所述多核苷酸序列中的至少一個(gè)突 變引入到所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的ykf操縱子中的對(duì)應(yīng)位置。39. -種用于增強(qiáng)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中感興趣的蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，所述方法包括： a) 用權(quán)利要求38所述的載體轉(zhuǎn)化親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞； b) 允許所述載體與所述親本革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞的ykf操縱子中相應(yīng)區(qū)域的同源重 組，以產(chǎn)生改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞；以及 c) 使所述改變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞在適于表達(dá)所述感興趣的蛋白質(zhì)的條件下生長(zhǎng)， 其中與所述轉(zhuǎn)化步驟之前的所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞相比，所述感興趣的蛋白質(zhì)在所述改 變的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞中的產(chǎn)量提高。
【文檔編號(hào)】C07K14/32GK106068273SQ201480076332
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2014年12月8日 公開(kāi)號(hào)201480076332.6, CN 106068273 A, CN 106068273A, CN 201480076332, CN-A-106068273, CN106068273 A, CN106068273A, CN201480076332, CN201480076332.6, PCT/2014/69019, PCT/US/14/069019, PCT/US/14/69019, PCT/US/2014/069019, PCT/US/2014/69019, PCT/US14/069019, PCT/US14/69019, PCT/US14069019, PCT/US1469019, PCT/US2014/069019, PCT/US2014/69019, PCT/US2014069019, PCT/US201469019
【發(fā)明人】C·邦焦?fàn)柲? B·F·施密特, R·奧楚卡, A·范齊蒙耐德
【申請(qǐng)人】丹尼斯科美國(guó)公司