一種發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因燈盞花毛狀根轉(zhuǎn)化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)中的植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種發(fā)根 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因燈盞花毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細胞的遺傳轉(zhuǎn)化是植物基因工程的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。自Abel等（1986)將煙草 花葉病毒燈MV)衣殼蛋白cDNA導(dǎo)入煙草細胞，獲得抗TMV病毒的轉(zhuǎn)基因煙草植株后，先后 發(fā)展了許多植物遺傳轉(zhuǎn)化方法和技術(shù)。
[0003] 燈盞花Elrigeron breviscapus (Vant. )Hand-Mazz.又名燈盞細辛、短亭飛蓬，是為 菊科飛蓬屬多年生草本植物。其主要有效成分為燈盞花素，即燈盞乙素和少量燈盞甲素的 混合物。燈盞花素具有舒張血管、改善微循環(huán)、抑制血小板及紅細胞聚集，治療冠屯、病、屯、絞 痛、腎衰和高血脂癥等疾病等多種作用。但是作為云南最有發(fā)展前景的藥物之一，卻面臨著 種質(zhì)退化的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。因此，從處于代謝節(jié)點處的關(guān)鍵基因著手，改善燈盞花的種質(zhì)，提高 燈盞花素的含量成為亟待解決的問題。
[0004]目前尚未有燈盞花遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的報道。
[0005] 自 1907 年Smith和Townsend發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenes)會b 誘導(dǎo)植物形成毛狀根化ai巧root)W來，迄今為止已經(jīng)有160多種植物成功地利用化質(zhì) 粒進行了轉(zhuǎn)化。例如：中國專利CN200910237579. 2,申請公布號為CN102057868A，發(fā)明名稱 為"一種金鐵鎖毛狀根系的誘導(dǎo)與培養(yǎng)方法"，公開了一種金鐵鎖毛狀根系高效誘導(dǎo)與培養(yǎng) 方法：取金鐵鎖幼嫩莖為外植體進行脫分化處理，獲得新鮮金鐵鎖愈傷組織，將愈傷組織與 含有化質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌（ACCC10060)共培養(yǎng)，W無菌紙吸取多余菌液后轉(zhuǎn)入到誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，在金鐵鎖愈傷組織處生長出金鐵鎖毛狀根；抑菌培養(yǎng)后將具有毛狀根的外 植體放入擴增培養(yǎng)基中進行毛狀根的擴大培養(yǎng)。又如：中國專利申請CN201310603423. 8， 申請公布號為CN103695462A，發(fā)明名稱為"一種甜葉菊毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)綠原酸和二 咖啡酷奎寧酸的方法"，公開了一種采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用發(fā)根農(nóng)桿菌侵染甜葉菊外植體，獲 得產(chǎn)綠原酸和二咖啡酷奎寧酸的甜葉菊毛狀根的方法。
[0006] 影響發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化成功的因素有很多，包括轉(zhuǎn)化植株的種類、部位、生理狀態(tài)； 發(fā)根農(nóng)桿菌的種類、細胞懸浮液密度；培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件等等。
[0007] 不同的植物要通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)形成毛狀根，W及W此為基礎(chǔ)獲得高品質(zhì)的轉(zhuǎn) 基因植株還是要付出艱辛的工作的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)燈盞花形成毛狀根的方法。
[0009] 本發(fā)明提供了一種發(fā)根農(nóng)桿菌巧8C1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因燈盞花毛狀根轉(zhuǎn)化方法，本發(fā) 明為了做到取材方便，直接用燈盞花無菌苗葉作為外植體，在此基礎(chǔ)上建立了W葉片為外 植體的發(fā)根農(nóng)桿菌巧8C1介導(dǎo)的燈盞花轉(zhuǎn)基因毛狀根遺傳體系的方法，不僅減少所使用儀 器的費用，使實驗操作技術(shù)容易在普通實驗室進行，而且也為今后利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對燈盞 花進行遺傳改良提供了技術(shù)上的支持。
[0010] 本發(fā)明選擇的MS和B5培養(yǎng)基，是植物細胞工程的常用培養(yǎng)基，廣泛地應(yīng)用于植物 組織培養(yǎng)，效果良好。本發(fā)明所用的植物培養(yǎng)基除培育無菌苗是WMS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基外， 其余均WB5為基本培養(yǎng)基，根據(jù)不同的培養(yǎng)期，特定地添加了不同種類、不同濃度的抗生 素。
[0011] 本發(fā)明是將預(yù)培養(yǎng)后的燈盞花葉片外植體浸入含有攜帶目的基因和篩選基因的 重組質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，具體的技術(shù)方案如下： 陽〇1引 （1)提取攜帶目的基因的重組閒B-Flag質(zhì)粒
[0013] 將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌化ansl-Tl菌檢、測序驗證后，接種到含75mg/L卡那 霉素化an)的LB液體培養(yǎng)基（配制試劑購自生工生物公司）中，在37°C、200巧m的條件下 過夜培養(yǎng)；用質(zhì)粒小提試劑盒（購自全式金生物公司）提取重組質(zhì)粒。該方法屬于一般分 子生物學(xué)常規(guī)操作。
[0014] 本發(fā)明所述目的基因可W依實驗?zāi)康牟煌煌?，在本發(fā)明的具體實施例中W CHI(查爾酬異構(gòu)酶基因）為例；也可選擇C服（查爾酬合成酶基因）、F3H(類黃酬3'-徑化 酶基因）等目的基因。
[0015] 本發(fā)明所述的篩選基因是指P皿-Flag質(zhì)粒自身攜帶的潮霉素（Hyb)抗性基因。
[0016] (2)準(zhǔn)備遺傳轉(zhuǎn)化使用的燈盞花外植體 陽017] 將燈盞花種子用0. 1 %升隸消毒lOmin后，無菌水漂洗3-5次，用無菌吸水紙吸除 殘留水分，接種到MS培養(yǎng)基上，在溫度25 +rC、光照強度40001X、光周期為1化光照化黑 暗的條件下培養(yǎng)45-60天，獲得燈盞花無菌苗。
[0018] 將燈盞花無菌苗葉片剪成0.5-lcm2大小的葉盤，接種到預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上，在 25 +rC條件下暗培養(yǎng)2天，作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體。
[0019] 培養(yǎng)燈盞花無菌苗的培養(yǎng)基為：MS+30g/L薦糖巧.5g/L瓊脂。pH5. 6-5. 8 ;
[0020] 葉盤預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為：B5+30g/L薦糖巧.5g/L瓊脂。抑5. 8-6. 0。
[0021] (3)含攜帶目的基因CHI的P皿-Flag重組質(zhì)粒的巧8C1發(fā)根農(nóng)桿菌工程菌的獲得
[0022] 將提取的重組質(zhì)粒通過凍融法導(dǎo)入巧8C1發(fā)根農(nóng)桿菌中，再經(jīng)抗生素抗性篩選及 PCR菌檢鑒定，獲得含有重組質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌。
[0023] (4)燈盞花葉片外植體的遺傳轉(zhuǎn)化
[0024] 將用含40mg/L利福平巧if)(巧8C1發(fā)根農(nóng)桿菌抗性）和75mg/L卡那霉素化an) (P皿-Flag載體抗性）的Y邸培養(yǎng)基活化培養(yǎng)至ODe。。為0.6+ 0. 1的巧8C1發(fā)根農(nóng)桿菌工 程菌，室溫下5000巧m離屯、lOmin，無菌條件下去上清，用等體積新鮮的含100μmol/L乙酷 下香酬（As)的B5液體培養(yǎng)基重懸菌體。28°C，10化pm振蕩解育30min后，將預(yù)培養(yǎng)好的葉 盤在超凈工作臺中于菌液中浸染lOmin，期間不斷輕輕搖晃使其浸染充分。取出外植體，用 無菌濾紙吸除殘留菌液，接種于共培養(yǎng)培養(yǎng)基，25°C，暗培養(yǎng)2天。
[00巧]將共培養(yǎng)的外植體轉(zhuǎn)移到除菌培養(yǎng)基上于25Γ無光條件下進行除菌培養(yǎng)，待毛狀 根長出至2-3cm長后，將其剪下，連續(xù)轉(zhuǎn)接至新的除菌培養(yǎng)基中，W除去發(fā)根農(nóng)桿菌。 陽0%] 共培養(yǎng)培養(yǎng)基為：B5+30g/L薦糖巧.5g/L瓊脂，pH5. 8-6. 0 ;
[0027]除菌培養(yǎng)基為：B5+500mg/l，300mg/l，lOOmg/L頭抱霉素（Cef) +30g/L薦糖巧.5g/ L瓊脂，pH5.8-6.ο。
[0028] (5)篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因毛狀根
[0029] 將除菌完全，生長狀況良好的毛狀根轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基，25°C，暗培養(yǎng)至少15天。
[0030] 篩選培養(yǎng)基為：B5+5mg/L潮霉素B(Hyb) +30g/L薦糖巧.5g/L瓊脂，pH5.8-6. 0 ;
[0031] 化)PCR擴增鑒定毛狀根 陽03引取在篩選培養(yǎng)基上仍然生長良好的毛狀根一小段，用CTAB法提取總DNA，W此DNA為模板，進行PCR檢測，鑒定是否含轉(zhuǎn)入的目的基因CHIW及巧8C1發(fā)根農(nóng)桿菌特有的 rolB、role基因。引物根據(jù)目的基因CHI和P皿-Flag表達載體W及農(nóng)桿菌rolB、role特 異序列設(shè)計。
[003引 目的基因CHI擴增引物為： 陽的4] P皿-CHI-F:5>-CTCAAGCTTGGATCCATGGCTGCC-3> (沈QIDN0:1)
[0035] P皿-CHI-R:5,-CGATACCGTCACTAGTCAAACCATA-3,（SEQIDN0:2)
[0036] roIB基因擴增引物為：
[0037] rolB-F:5'-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3'(沈QIDN0:3) 陽的8] rolB-R:5'-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3'(沈QIDN0:4)
[0039] role基因擴增引物為：
[0040] rolC-F:5'-TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3'(沈QIDN0:5)
[0041] rolC-R:5'-CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3,（沈QIDN0:6)
[0042] 反應(yīng)體系均為（20yL) :d地20Ty^TemplateDM1yLR)rward P;rime;r(10yM)lyL，ReverseP;rime;r(10yM)lyL2X;rTaqPCRSuperMixlOyL。
[0043] PCR反應(yīng)條件為：94°C5min，35 個循環(huán)（94°C30sec，55°C30sec，72°C60sec)， 72°C5min。
[0044] PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測。rolB的擴增條帶大小為423bp，rolC為 62化P，目的基因CHI為714bp(如圖1)。 W45] 本發(fā)明所述的CTAB法的全稱是十六烷基立甲基漠化錠法，CTAB法能夠提取植物 基因組DNA，屬于一般分子生物學(xué)常規(guī)操作。
[0046] 本發(fā)明所述的PCR是"聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)"，是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的實驗方法，根 據(jù)PCR引物