一種雞傳染性法氏囊病毒復(fù)合亞單位疫苗制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種雞傳染性法氏囊病毒復(fù)合亞單 位疫苗制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞傳染性法氏囊?。↖nfectiousbursaldisease,IBD)是由傳染性法氏囊病毒 (Infectiousbursaldiseasevirus,I抓V)引起的危害雞的一種急性、高度接觸性傳染 病。該病主要感染3~12周齡的青年雞，主要侵害淋己組織，特別是法氏囊，IBDV能在法 氏囊B淋己細(xì)胞中迅速繁殖，引起法氏囊B淋己細(xì)胞的損傷，造成免疫抑制，從而增加對(duì)其 它疫病的易感性。目前IBD已成為危害世界養(yǎng)禽業(yè)的Ξ大主要傳染病之一，我國(guó)是禽類養(yǎng) 殖生產(chǎn)大國(guó)，生產(chǎn)規(guī)模居世界第一位。近年來(lái)由于IBDV超強(qiáng)毒株、變異株的流行，抗原變異 和血清亞型的多樣性，使傳統(tǒng)的疫苗已不能控制其流行性。因此開(kāi)發(fā)更為有效、安全的新型 疫苗已成為迫切的需要。
[0003] 目前市場(chǎng)上廣泛使用的法氏囊疫苗有法氏囊的全病毒滅活疫苗和基因工程疫苗， 法氏囊的全病毒滅活疫苗使用傳染性法氏囊病毒株適應(yīng)細(xì)胞制備，基因工程疫苗采用大腸 桿菌表達(dá)傳染性法氏囊病毒VP2基因制備。運(yùn)兩種疫苗可W產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)效果，但 是，由于IBDV在野外環(huán)境中的變異能力很強(qiáng)，每年均有超強(qiáng)毒力的IBDV野毒出現(xiàn)，很可能 突破現(xiàn)有的疫苗保護(hù)，出現(xiàn)疫苗保護(hù)性下降的情況。因此針對(duì)雞傳染性法氏囊病的發(fā)病趨 勢(shì)，現(xiàn)在主要是分離和篩選免疫原性好的、適應(yīng)細(xì)胞繁殖種毒的超強(qiáng)流行毒株進(jìn)行疫苗制 備，運(yùn)樣需要對(duì)不斷出現(xiàn)的IBD流行毒株進(jìn)行分析和防控，增加了對(duì)IBDV防治工作的繁重 性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種雞傳染性法氏囊病毒復(fù)合亞單位 疫苗制備方法，W解決現(xiàn)有技術(shù)中相關(guān)疫苗對(duì)不同病毒變種的通用性較差的技術(shù)問(wèn)題。
[0005] 本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)的相關(guān)疫苗對(duì)IBDV免疫效力較差。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)W上技術(shù)目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0007] 一種雞傳染性法氏囊病毒復(fù)合亞單位疫苗制備方法，包括W下步驟：
[0008] 1)取序列如SEQIDN01所示的基因片段，將其連接到線性表達(dá)載體祀T-22b上， 得到祀T-22b-N-VP2質(zhì)粒，將祀T-22b-N-VP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌B21，得到重組菌；
[0009]。培養(yǎng)步驟1)得到的重組菌，而后向培養(yǎng)液中加入終濃度為0.ImM的IPTG， 25°C、220rfm搖化，離屯、收集菌體；
[0010] 3)將步驟2)所述菌體重懸于PBS緩沖液中超聲破碎，離屯、收集上清，即得到粗蛋 白溶液； W11] 4)將步驟扣得到的粗蛋白溶液用Ni柱純化，PBS透析，即得到N-VP2蛋白抗原溶 液；
[0012] 5)培養(yǎng)雞傳染性法氏囊病毒，得到病毒培養(yǎng)液而后濃縮、滅活，即得到病毒抗原溶 液；
[0013] 6)取步驟4)制備的N-VP2蛋白抗原溶液、步驟5)制備的病毒抗原溶液混勻，向其 中加入4% (v/v)的Tween80,溶解即得到疫苗水相，再取疫苗油相制備疫苗。
[0014] 優(yōu)選的，步驟1)中將序列如SEQIDN01所示的基因片段連接到線性表達(dá)載體 pET-22b上時(shí)，所選的酶切位點(diǎn)是化0I和化0I。
[0015] 優(yōu)選的，步驟2)加入誘導(dǎo)劑前，培養(yǎng)液的ODe。。數(shù)值為0. 6~0. 8。
[0016] 優(yōu)選的，步驟3)中用于重懸菌體的PBS緩沖液，其體積是所述菌體的1/20。
[0017] 優(yōu)選的，步驟3)離屯、收集上清后，再次超聲破碎，離屯、收集上清，即得到粗蛋白溶 液。 陽(yáng)01引優(yōu)選的，步驟4)所述N-VP2蛋白抗原溶液中N-VP2蛋白濃度為500ug/mL。
[0019] 優(yōu)選的，步驟5)所述病毒抗原溶液中雞傳染性法氏囊病毒效價(jià) > 1〇7'5tCID5〇/0.ImL。
[0020] 優(yōu)選的，步驟6)中N-VP2蛋白抗原溶液和病毒抗原溶液w1:1 (v/v)比例混合。
[0021] 優(yōu)選的，步驟5)所述滅活的方法是：向濃縮后的病毒培養(yǎng)液中加入甲醒至甲醒終 濃度為 1. 5%。（v/v)，37°C滅活 20h。
[0022] 優(yōu)選的，步驟6)中疫苗水相和疫苗油相的用量比為1:3 (v/v)。
[0023] 本發(fā)明主要針對(duì)IBDV在野外環(huán)境中變異能力很強(qiáng)，變異株和超強(qiáng)毒株不斷出現(xiàn) 的情況，提供一種免疫原性好、通用性好的雞傳染性法氏囊病毒復(fù)合亞單位疫苗的制備方 法。據(jù)研究表明VP2是IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，位于病毒粒子的外表面，占病毒總結(jié)構(gòu)蛋白 的51%，是病毒主要的宿主保護(hù)性抗原，VP2基因Ng2 417端的366bp的基因序列是VP2基因 的保守序列，不同毒株間差異不大，對(duì)IBDV的保護(hù)具有良好的通用性和免疫原性。N-VP2與 IBDV滅活全病毒共同制備復(fù)合亞單位疫苗降低了IBDV全病毒滅活疫苗制備的成本，N-VP2 蛋白具有良好的免疫原性和通用性，與IBDV滅活病毒協(xié)同作用，能夠提高雞體內(nèi)的抗體水 平、抗體產(chǎn)生快，提高雞對(duì)IBDV免疫的通用性，能夠抵抗不斷突變的IBDV的侵襲。
[0024] 本發(fā)明方法的技術(shù)優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在W下方面：
[0025] (1)本發(fā)明合成的N-VP2序列為IBDVVP2蛋白的保守序列，具有良好的免疫原性， 對(duì)IDBV的防治具有通用性，可W有效預(yù)防不斷出現(xiàn)的IBDV變異株的侵襲。 陽(yáng)0%] (2)本發(fā)明采用的祀T-2化表達(dá)載體含有信號(hào)膚，可W將N-VP2蛋白導(dǎo)入到周質(zhì) 腔，表達(dá)的祀T-22b-N-VP2蛋白為可溶性蛋白，具有天然的N-VP2蛋白的抗原活性，生產(chǎn)成 本低，表達(dá)量大，與法氏囊滅活病毒制備復(fù)合亞單位疫苗可W降低滅活疫苗的生產(chǎn)成本，又 突破了VP2亞單位疫苗的保護(hù)局限性。
[0027] (3)本發(fā)明采用了本±分離的具有較強(qiáng)免疫原性的雞傳染性法氏囊病毒，免疫原 性好，保護(hù)率高。
[0028] (4)本發(fā)明制備的復(fù)合亞單位疫苗使免疫后雞第一周即產(chǎn)生特異性抗體，抗體產(chǎn) 生快，抗體水平高，攻毒保護(hù)率提高，進(jìn)一步提高免疫效果。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是正常雞法氏囊形態(tài)圖。
[0030] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)雞攻擊BC6-85強(qiáng)毒后，其法氏囊形態(tài)圖，圖中可見(jiàn)法氏 囊腫大、有粘液。
[0031] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)雞攻擊BC6-85強(qiáng)毒后，其法氏囊形態(tài)圖，圖中可見(jiàn)法氏 囊萎縮。
[0032] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例中對(duì)雞攻擊BC6-85強(qiáng)毒后，其法氏囊形態(tài)圖，圖中可見(jiàn)法氏 囊發(fā)黃。
【具體實(shí)施方式】
[0033] W下將對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在 W下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0034] W下實(shí)施例中所使用的近似性語(yǔ)言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情 況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用"大約"、"左右"等語(yǔ)言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn) 確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，"大約"表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十（10%)的 范圍內(nèi)變化，比如，"大約100"表示的可W是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在"大約第 一數(shù)值到第二數(shù)值"的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近 似性語(yǔ)言可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。
[0035] 除有定義外，W下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員普遍理解的相同含義。
[0036] W下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；W下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置Ξ次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 取平均值；W下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。 陽(yáng)〇37] 實(shí)施例1
[0038] 一種雞傳染性法氏囊病毒復(fù)合亞單位疫苗的制備方法，包括W下工藝步驟：
[0039] 1)N-VP2蛋白的表達(dá)與純化；
[0040] 2)雞傳染性法氏囊病毒抗原液制備與滅活；
[0041] 3)雞傳染性法氏囊病毒復(fù)合亞單位疫苗的制備：將步驟1)得到的N-VP2蛋白與 步驟2)得到的雞傳染性法氏囊病抗原液按1 : 1的比例混合后添加4%的TweenSO,再與 熬制好的Marcol52進(jìn)口白油按1 : 3比例（w/w)乳化制備復(fù)合亞單位疫苗。
[0042] 其中，步驟DN-VP2蛋白的表達(dá)與純化包括W下步驟： 陽(yáng)0創(chuàng) （1)表達(dá)載體的構(gòu)建將優(yōu)化合成的VP2基因Ns2 417端的366bp的N-VP2序列（具 體如SEQIDN01所示）亞克隆到線性表達(dá)載體祀T-2化上，酶切位點(diǎn)為化0I、化0I，新 質(zhì)粒命名為祀T-22b-N-VP2,轉(zhuǎn)化E.coli.BL21，并對(duì)重組菌進(jìn)行測(cè)序鑒定。
[0044] (2)大腸桿菌中的表達(dá)過(guò)程挑取化21/PET-2化-N-VP2單菌落，接種Amp(lOOug/ mL)LB液體培養(yǎng)基中，37°C震搖培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)好的菌液按照1:100接種至含有 Amp(lOOug/mL)LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至ODe。。到0. 6-0. 8 (大約2.化后可達(dá)到），加 誘導(dǎo)劑終濃度為0.ImM，25°C、搖化后，800化化離屯、lOmin得到菌體，加PBS混懸后 進(jìn)行超聲波破碎，離屯、收集上清。
[0045] (3)蛋白的純化制備的可溶性蛋白用Ni柱進(jìn)行純化，PBS進(jìn)行透析，將透析后 pET-22b-N-VP2 蛋白稀釋到 500ug/mL。
[0046] 步驟2)雞傳染性法氏囊病毒抗原液制備與滅活包括W下步驟：
[0047] (1)種細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)雞胚傳代細(xì)胞系DF1細(xì)胞系經(jīng)膜酶細(xì)胞分散液消化傳 代，W細(xì)胞生長(zhǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，形成良好單層時(shí)，用于繼續(xù)傳代或接種病毒。
[0048] (2)病毒接種當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿單層時(shí)，按細(xì)胞懸液1%的比例接種本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定 的雞傳染性法氏囊病毒強(qiáng)毒山東株（SD)，控制溫度在37°C。
[0049] (3)病毒收獲當(dāng)DF1細(xì)胞出現(xiàn)80%W上病變時(shí)，反復(fù)凍融3次，得到含上清液的細(xì) 胞毒液。
[0050] (4)病毒效價(jià)測(cè)定按照中華人民共和國(guó)獸藥典規(guī)定的半數(shù)感染量測(cè)定方法，進(jìn)行 病毒含量測(cè)定，該病毒的效價(jià)應(yīng)> 1〇7'5tCIDw/〇.ImL。
[0051] (5)病毒的滅活將檢測(cè)合格的細(xì)胞毒液置于滅菌容器內(nèi)，加入甲醒溶液充分搖勻， 甲醒溶液的加入量為病毒液體積的0. 5%。-2%。，37°C滅活12-4化，轉(zhuǎn)速為18化/min。
[0052] (6)病毒的滅活檢驗(yàn)將滅活后的病毒進(jìn)行10 2稀釋后按5%接毒量接種已長(zhǎng)成良 好單層的雞胚傳代細(xì)胞系DF1細(xì)胞，觀察96h，應(yīng)不出現(xiàn)細(xì)胞病變，并再盲傳1代，觀察96h， 若不出現(xiàn)細(xì)胞病變，則判定為滅活完全。 陽(yáng)〇5引實(shí)施例2
[0054] 2. 1 N-VP2蛋白的表達(dá)與純化 W55] (1)將優(yōu)化合成的VP2基因Ns2 417端的36化P的N-VP2序列（具體如SEQID N01所示）亞克隆到線性表達(dá)載體祀T-22b上，酶切位點(diǎn)為化0I、化0I，新質(zhì)粒命名為pET-22b-N-VP2,轉(zhuǎn)化E.coli.BL21，并對(duì)重組菌進(jìn)行測(cè)序鑒定。
[0056] (2)