異源合成廣霍香醇的方法和微生物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物合成工程與生物制造技術(shù)領(lǐng)域，具體地提供了一種異源合成廣霍 香醇的方法和微生物。
【背景技術(shù)】
[0002] 廣蕾香醇（Patchoulialcohol)是一種重要的Η環(huán)倍半聰類化合物。廣蕾香醇又 稱百秋李醇，其分子式為。5&訴，分子量為222. 37,結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0003] 天然形式的廣霍香醇主要存在于唇形科刺蕊草屬植物廣蕾香（Pogostemon C油1in度lanco)Benth)的揮發(fā)油一廣蕾香油中，是廣蕾香揮發(fā)油的主要成分，是歷版《中國(guó) 藥典》規(guī)定的評(píng)價(jià)廣蕾香藥材及廣蕾香油質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分。
[0004] 廣蕾香醇單體為無(wú)色晶體，有較淡的廣蕾香香氣，其烙點(diǎn)為55-561：，沸點(diǎn) 28(TC(常壓下），相對(duì)密度為1. 0284,旋光度-97. 4°(C= 24,氯仿）；不溶于水，溶于醇、 離和常用有機(jī)溶劑。
[0005]廣蕾香醇具有獨(dú)特持久的香味，作為香料的標(biāo)志性成分被廣泛用于日用品和化妝 品中。
[0006] 近年來(lái)，隨著科研人員對(duì)廣蕾香醇研究的深入，廣蕾香醇被發(fā)現(xiàn)具有很好的神經(jīng) 保護(hù)、抗流感病毒、抗多種真菌、抗腫瘤、抗炎癥、抗錐蟲(chóng)病原體和毒殺白蟻等生物活性。此 夕b現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，廣蕾香醇還具有抗氧化等藥理活性，有一定的新藥開(kāi)發(fā)價(jià)值。
[0007]與大多數(shù)植物源天然產(chǎn)物一樣，目前廣蕾香醇主要通過(guò)化學(xué)合成和有機(jī)溶劑萃取 兩種方法制備。
[0008]作為含有5個(gè)手性碳原子的四面體結(jié)構(gòu)，廣蕾香醇的化學(xué)合成方法過(guò)于復(fù)雜，且 得率極低。
[0009] 有機(jī)溶劑萃取法主要通過(guò)天然的含廣霍香醇的植物進(jìn)行組織抽提來(lái)獲取廣霍香 醇，然而該方法受到植物生長(zhǎng)緩慢、廣霍香醇含量低、需要消耗有機(jī)溶劑等影響。
[0010] Joe化appell等通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法對(duì)煙草進(jìn)行遺傳改造，使得煙草能夠合成 0. 5μg/g濕重的廣蕾香醇。然而，植物基因工程方法仍具有植物生長(zhǎng)緩慢、廣霍香醇含量 低、需要消耗有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)。
[0011] 由于廣蕾香醇具有神經(jīng)保護(hù)、抗流感病毒等作用，并且，廣蕾香醇單體在國(guó)外日化 產(chǎn)品行業(yè)有較成熟的應(yīng)用基礎(chǔ)，而在國(guó)內(nèi)日化產(chǎn)品市場(chǎng)應(yīng)用仍接近空白，因此，其市場(chǎng)空間 廣泛，但亟需可解決其高成本難題的工業(yè)化生產(chǎn)方法。
[0012] 雖然人們嘗試開(kāi)發(fā)在微生物中生產(chǎn)廣霍香醇的技術(shù)，然而迄今為止，尚未有在微 生物中成功地合成廣蕾香醇的報(bào)道。此外，微生物發(fā)酵最大的瓶頸在于如何實(shí)現(xiàn)工業(yè)化，而 工業(yè)化的必要條件是其產(chǎn)量需要滿足可W工業(yè)化的水平。
[0013]綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)新的高效、簡(jiǎn)便、低成本地生產(chǎn)廣霍香醇的方法， 尤其是通過(guò)微生物制備純度較高的廣霍香醇的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的就是提供通過(guò)微生物生產(chǎn)廣霍香醇的新工藝，實(shí)現(xiàn)廣蕾香醇更清 潔，更經(jīng)濟(jì)的制造。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的目的是提供一種微生物異源合成倍半聰廣蕾香醇的 的方法。
[0015] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種基因組合，所述的組合包括（i)pts基因的多核 巧酸序列和（ii)ispA基因的多核巧酸序列。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述組合還包括選自下組的一種或多種多核巧酸序列：
[0017] (a)dxs2基因的多核巧酸序列；
[0018] 化）idi基因的多核巧酸序列；
[0019] (c)MVA途徑的合成蛋白基因的多核巧酸序列，較佳地所述合成蛋白基因選自： atoB、mvaS、mvaE,mvaKl、mvaK2、mvaD、或其組合。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合由（i)pts基因和m)ispA基因二種基因構(gòu)成。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因組合用于在植物體外合成廣蕾香醇和/或其衍生 物。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因組合為多核巧酸序列和/或載體的組合。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因組合包括：
[0024] 第一序列，其中所述第一序列含有pts基因的多核巧酸序列；W及 [00巧]第二序列，其中所述第二序列含有ispA基因的多核巧酸序列。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因組合包括：
[0027] 第一載體，其中所述第一載體含有pts基因的多核巧酸序列；W及
[0028]第二載體，其中所述第二載體含有ispA基因的多核巧酸序列。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一載體和第二載體是同一載體（即pts基因的多核巧 酸序列和ispA基因的多核巧酸序列位于同一載體上）。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的基因的多核巧酸序列包括基因組序列和cDNA序列。
[0031]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種構(gòu)建物，所述的構(gòu)建物含有第一表達(dá)盒和第二 表達(dá)盒，其中所述第一表達(dá)盒表達(dá)pts蛋白；而所述的第二表達(dá)盒表達(dá)ispA蛋白。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物用于在植物體外合成廣蕾香醇和/或其衍生物。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物為表達(dá)載體。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的構(gòu)建物為1個(gè)或2個(gè)表達(dá)載體。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，第一表達(dá)盒從5'至3'依次含有啟動(dòng)子、pts蛋白編碼序列、終 止密碼子和任選的3' -UTR。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，第二表達(dá)盒從5'至3'依次含有啟動(dòng)子、ispA蛋白編碼序列、終 止密碼子和任選的3' -UTR。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的pts蛋白編碼序列是序列優(yōu)化的編碼序列，較佳地如SEQ IDNO. : 3 所示。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的ispA蛋白編碼序列是序列優(yōu)化的編碼序列，較佳地如 沈QIDNO. : 6所示。
[0039] 在本發(fā)明的第Η方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞中含有攜帶外源的 第一表達(dá)盒的第一表達(dá)載體和外源的第二表達(dá)盒的第二表達(dá)載體，或者所述的宿主細(xì)胞的 基因組中整合有外源的第一表達(dá)盒和外源的第二表達(dá)盒，
[0040] 其中所述第一表達(dá)盒表達(dá)pts蛋白；而所述的第二表達(dá)盒表達(dá)ispA蛋白。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一載體和第二載體是同一載體（即pts基因的多核巧 酸序列和ispA基因的多核巧酸序列位于同一載體上）。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的真核細(xì)胞包括酵母。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，所述的真核細(xì)胞是除了廣蕾香（PogostemonC油lin)之外的植 物細(xì)胞。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的原核細(xì)胞是大腸桿菌。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞選自下組：釀酒酵母、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞還含有第Η表達(dá)載體，所述的第Η表達(dá)載體攜 帶用于表達(dá)選自下組蛋白的第Η表達(dá)盒：
[0048] (a)dxs2 蛋白；
[004引化）idi蛋白；
[0050] (c)MVA途徑的合成蛋白，較佳地選自；atoB、mvaS、mv址,mvaKl、mvaK2、mvaD、或其 組合；
[00川（d)上述（a)、化）、（C)的任意組合。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的（C)是atoB、mvaS、mv址,mvaKl、mvaK2、mvaD六種蛋白所 構(gòu)成的組合。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的第Η表達(dá)盒同時(shí)表達(dá)dxs2蛋白和idi蛋白。
[0054] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)廣蕾香醇的方法，包括步驟：
[00巧]培養(yǎng)本發(fā)明第Η方面所提供的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)pts蛋白和ispA蛋白，并獲得 含廣蕾香醇的發(fā)酵產(chǎn)物；和
[0056] 從所述發(fā)酵產(chǎn)物中分離和/或純化所述的廣蕾香醇。
[0057] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種編碼廣蕾香醇合成酶的核巧酸序列，所述的核 巧酸序列編碼SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，而且所述核巧酸序列的的編碼區(qū)與SEQ ID NO: 3所示核巧酸序列有95% W上相同性。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，該核巧酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0059] 在本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明第一方面所提供的基因組合、本發(fā)明第二方 面所提供的構(gòu)建物、或本發(fā)明第Η方面所提供的宿主細(xì)胞的用途，用于在植物體外合成廣 蕾香醇和/或其衍生物。
[0060] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一賞述。
【附圖說(shuō)明】
[0061]圖1顯示了倍半聰廣蕾香醇的結(jié)構(gòu)式。
[0062] 圖2顯示了質(zhì)粒PJF63構(gòu)建示意圖。
[0063] 圖3顯示了質(zhì)粒PJF678圖譜。
[0064]圖4顯示了質(zhì)粒PJF680圖譜。
[006引圖5顯示了工程菌株化21 0E3)pJF7O7的GC檢測(cè)圖譜。
[0066] 圖6顯示了工程菌株化2UDE3)pJF707產(chǎn)廣蕾香醇的質(zhì)譜圖。
[0067] 圖7顯示了構(gòu)建后各菌株的廣蕾香醇的產(chǎn)量（mg/L)。
【具體實(shí)施方式】
[006引廣蕾香醇由聰類化合物的通用前體焦磯酸異戊帰醋（IP巧和二甲帰丙基焦磯酸 (DMAP巧經(jīng)法尼基焦磯酸合酶和廣蕾香醇合成酶兩步反應(yīng)合成。發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的 研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)