一種中溫堿性脂酶及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，設(shè)及一種具有新基因序列的中溫堿性醋酶、其制備方 法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 醋酶，是指對于醋鍵的形成與水解起到催化作用的一類酶，廣泛存在于植物、動(dòng)物 和微生物里。醋酶在催化過程中可W與很多底物發(fā)生合成或水解的反應(yīng)，在該反應(yīng)過程中 并不需要其它輔助因子參與反應(yīng)的進(jìn)行，催化反應(yīng)能夠在有機(jī)相的反應(yīng)環(huán)境中保持較高的 反應(yīng)穩(wěn)定性，除此之外，醋酶發(fā)生的催化反應(yīng)具有極強(qiáng)的區(qū)域?qū)Ｒ恍院土Ⅲw特異性，具備工 業(yè)用酶所要求的優(yōu)點(diǎn)。因此醋酶在工業(yè)諸多領(lǐng)域中被廣泛使用，也在全球范圍酶制劑市場 中占有很大的比例。研究并開發(fā)出具有優(yōu)良性能的新型醋酶不僅有利于降低相應(yīng)的工業(yè) 生產(chǎn)成本，也對提高食品安全，降低油脂等化工業(yè)污染能耗，減少環(huán)境污染及維持可持續(xù)發(fā) 展，提高藥物制劑的使用安全性等方面，都具有重要意義。
[0003] 海洋環(huán)境具有極高的多樣性，寒流、熱液噴口、深海平原、海溝、海山、海底火山、深 海嫁骸等連同不同的壓力、鹽度、溫度、營養(yǎng)組成和光照條件為海洋微生物的多樣性創(chuàng)造了 條件。然而，目前僅有0. 1 %左右的海洋微生物能夠被分離純培養(yǎng)利用。針對海洋微生物分 離純培養(yǎng)方面的問題，利用宏基因組技術(shù)開發(fā)新型功能基因W及具有特殊用途的酶蛋白， 在當(dāng)今開發(fā)利用新型工業(yè)用酶方面有著非常廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種新的醋酶基因est424。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種由所述醋酶基因est424編碼的重組醋酶 est424〇
[0006] 本發(fā)明的第Ξ個(gè)目的是提供一種所述醋酶est424的制備方法。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：
[000引醋酶基因est424的序列如下：
[0009]
[0010]
[0011] 所述醋酶基因est424編碼的醋酶est424的氨基酸序列如下：
[0012]
[0013] 所述可溶性醋酶est424的制備方法包括W下步驟：
[0014] 1)克隆醋酶基因est424;
[0015] 2)將醋酶基因est424插入表達(dá)載體，構(gòu)建攜帶所述醋酶基因est424的重組表達(dá) 載體；
[0016] 3)將重組表達(dá)載體與伴侶蛋白質(zhì)粒地巧7共轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌化21 (DE3)細(xì) 胞中；
[0017] 4)選取轉(zhuǎn)化后大腸桿菌化21 0E3)中的陽性克隆于培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0018] 5)離屯、后收集發(fā)酵后的大腸桿菌化21 (DE3)細(xì)胞，并重懸于裂解緩沖液中進(jìn)行裂 解；
[0019] 6)將步驟5)中裂解的懸液離屯、，收集上清液，用儀離子馨合樹脂進(jìn)行親和純化， 再使用脫鹽柱脫鹽，即得所述可溶性醋酶est424。
[0020] 在步驟2)中，所述表達(dá)載體為祀T28。
[0021] 在步驟4)中所述培養(yǎng)基為含有100μg/mL卡那霉素和20μg/mL氯霉素的LB培 養(yǎng)基，所述發(fā)酵條件為：溫度37 °C，搖床培養(yǎng)至ODe。。為0. 4-0. 6,加入異丙基硫代-β-D-半 乳糖巧（IPTG)至終濃度為0. 5111111〇1/1，在16°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)。
[002引 在步驟6)中，所述離屯、為12000g，離屯、30min，4°C。
[0023] -種中溫堿性脂酶基因的應(yīng)用，所述中溫堿性脂酶基因在催化醋類及衍生物底物 的水解反應(yīng)中的應(yīng)用。
[0024]該醋酶最適反應(yīng)溫度為35°C，最適反應(yīng)抑值為8. 0,酶活單位為171. 0抓/mg。
[00巧]一種重組表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含有如SEQIDNO. 1所示核巧酸序列的功能片 段。
[0026] -種重組細(xì)胞，該宿主菌包含有SEQIDNO. 2的中溫堿性脂酶基因編碼的蛋白。
[0027] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：
[0028] 1)本發(fā)明從南海深海沉積物宏基因組文庫中得到一個(gè)新的醋酶的DNA序列，其通 過基因工程技術(shù)對其功能進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)將重組表達(dá)載體與伴侶蛋白質(zhì)粒地巧7共轉(zhuǎn)化大 腸桿菌化21 (DE3)細(xì)胞，可獲得高效可溶表達(dá)，經(jīng)蛋白純化及SDS-PAGE電泳，得到一條單一 的蛋白條帶，分子量為35kDa。
[0029] 2)本發(fā)明中醋酶的酶學(xué)性質(zhì)如下：
[0030] 最適反應(yīng)溫度為35。最適反應(yīng)抑值為8. 0,該醋酶是一個(gè)中溫堿性醋酶，其酶活 單位為171. 03U/mg。它在20°C下穩(wěn)定，F(xiàn)e2+和Mn2+可W有效提高酶的活性，1%的Tween80 和20也可W提高醋酶的活性。
【附圖說明】
[0031] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化后的醋酶est424SDS-PAGE電泳結(jié)果。
[003引圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的在抑值為8. 0的條件下，溫度對醋酶活性的影響圖。 [003引圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的在溫度為35°C的條件下，抑對醋酶est424活性的影 響圖。
[0034] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的陽離子對醋酶活性的影響圖。
[0035] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的有機(jī)溶劑對醋酶活性的影響。
[0036] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例提供的去垢劑對醋酶活性的影響圖。
[0037] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例提供的醋酶est424的熱穩(wěn)定性圖。
[0038] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例提供的醋酶est424的抑穩(wěn)定性圖。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 所述醋酶est424的制備方法包括W下步驟：
[00川 1、PCR擴(kuò)增醋酶基因片段
[0042](1)從元基因組中擴(kuò)增醋酶基因
[0043] 根據(jù)NCBI中已公布的不可培養(yǎng)微生物中深海醋酶基因的序列，用軟件Primer5 在基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對引物：
[0044]Lipo-F: 5，-GGAATTCCATATGGCCAGCCAGCCAGCACCTTC-3，
[0045]Lipo-R: 5，-CCCAAGCTTTTAGGCTGCCTGCCGCCTCCGGGA-3'
[0046] 在正向引物中有一個(gè)NdeI限制性酶切位點(diǎn)，反向引物中有一個(gè)化ndIII限制性 酶切位點(diǎn)。
[0047] 利用所設(shè)計(jì)的引物，對南海深海沉積物的樣品進(jìn)行了擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系 (20μL) ：2XGCBuffer, 10μL； 7^,6. 4μL；Lip〇-F(20μΜ),1μL；Lip〇-R(20μΜ),1μL； 模板DNA，1μL;Taq酶（2.抓/μL)，0. 2μL。PCR反應(yīng)程序：94°C預(yù)變性5min，之后是35個(gè) 循環(huán)，94°C變性50s，63°C退火50s，72°C延伸Imin;最后72°C延伸lOmin。最終在一個(gè)樣品 中發(fā)現(xiàn)了可能的條帶。
[004引 似瓊脂糖凝膠電泳片段回收
[0049] 用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根，北京）回收目的片段。
[0050] 做片段連接
[005。 將目的片段與PMD18-T載體燈aKaRa，大連）在16°C進(jìn)行連接16h，得到連接了目 的片段的質(zhì)粒pMD18-Lipo。
[0052] (4)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
[005引用連接了目的片段的質(zhì)粒pMD18-Lipo轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top-10感受態(tài)細(xì)胞，用加了 卡那霉素（終濃度為100μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。
[0054] 妨菌液PCR檢測
[0055] 挑取單克隆入加有氨節(jié)青霉素（終濃度為100μg/mL)的1血液 體LB培養(yǎng)基中37 °C，20化pm振蕩培養(yǎng)6h，取1μL做模板，使用載體通用引物 M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)和RV-M(GAGCGGATAACAATTTCACACAGG)進(jìn)行菌液PCR 檢測。取檢測的陽性克隆進(jìn)行測序。
[0056] (6)檢測質(zhì)粒的提取
[0057] 將陽性克隆的甘油種接種于裝有5mL的液體LB培養(yǎng)基（液體LB培養(yǎng)基中含卡那 霉素終濃度為lOOyg/mL)的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。用質(zhì)粒小提試劑盒（天根，北京） 提取質(zhì)粒，即為pMD18-Lipo。
[0058] 2、醋酶基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[00則（1)質(zhì)粒的酶切
[0060] 跟據(jù)凝膠成像結(jié)果判斷提取質(zhì)粒的濃度，并進(jìn)行質(zhì)粒的雙酶切，將上述獲得 pMD18-Lipo和祀T28質(zhì)粒分別用NdeI和化ndIII進(jìn)行雙酶切（37°C，過夜）。
[0061] 然后對pMD18-Lipo質(zhì)粒酶切的小片段和祀T28質(zhì)粒酶切的大片段進(jìn)行切膠，并 用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（天根，北京）進(jìn)行回收，pH8.0的水洗脫的產(chǎn)物保存 于-2(TC。
[0062] (2)酶切片段與質(zhì)粒的連接
[0063] 根據(jù)電泳結(jié)果判斷DNA的含量，將上述所得的酶切產(chǎn)物膠回收后的小片段和大片 段用T4DNA連接酶（TaKaRa，大連）進(jìn)行連接。進(jìn)行連接的小片段的含量為大片段的3-10 倍。連接體系在恒溫連接儀上16Γ恒溫連接過夜。
[0064] 將所得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)菌株細(xì)胞化21 0E3)，進(jìn)行重組表達(dá)，用加 有卡那霉素（終濃度為50μg/mL)的固體培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選。平板培養(yǎng)過夜后從長 有菌落的平板上挑取數(shù)個(gè)單克隆于裝有ImL的液體LB(含卡那霉素終濃度為100μg/血） 的EP管中進(jìn)行篩選，然后用搖床劇烈搖動(dòng)化左右，待EP管中液體出現(xiàn)渾濁，用載體祀T28 的通用引物T7/T7Ter進(jìn)行PCR檢測。挑選其中的陽性單克隆，接種于5mL液體LB培養(yǎng)基 (含卡那霉素終濃度為lOOyg/mL)中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，即為祀T28-Lipo,電 泳檢測，并測序進(jìn)行驗(yàn)證，即得SEQIDNo. 1中所示堿基序列。同時(shí)，將陽性克隆進(jìn)行保種， 保種使用的是終濃度為20%的甘油，置于-80°C保存。
[0065] 3、醋酶基因與伴侶蛋白質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化與可溶性醋酶的誘導(dǎo)表達(dá)
[0066] (1)醋酶基因重組質(zhì)粒的制備
[0067] 將有重組質(zhì)粒祀T28-Lipo的ToplO甘油種接種于裝有5mL液體LB培養(yǎng)基（含 卡那霉素終濃度為lOOyg/mL)的試管中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。提取醋酶基因重組質(zhì)粒 祀T28-Lipo并進(jìn)行電泳檢測。
[006引 似伴侶蛋白質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)化
[0069] 將伴侶蛋白質(zhì)粒地巧7與上述獲得醋酶基因重組質(zhì)粒祀T28-Lipo共轉(zhuǎn)化感受態(tài) 大腸桿菌化21 (DE3)細(xì)胞，用加入卡那霉素（終濃度100μg/mL)和氯霉素（終濃度20μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，培養(yǎng)過夜。
[0070] (3)共轉(zhuǎn)化菌株的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
[007。從長有菌落的平板上挑取數(shù)個(gè)單克隆于裝有ImL的液體LB的EP管中，再向液體 LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素（終濃度100 μ g/mL)、氯霉素（終濃度20 μ g/mL)進(jìn)行篩選，然后 用搖床劇烈搖動(dòng)化左右，待EP管中液體出現(xiàn)渾濁將得到的陽性克隆菌株地巧7-Lipo，分別 保種存放于-80°C并接種于5mL試管液體LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)基含卡那霉素終濃度為100 μ g/ mU氯霉素終濃度為20 μ g/mL)中，37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。
[0072] 之后進(jìn)行地巧7-Lipo(地巧7,祀T28-Lipo)的共表達(dá)：在50血液體LB培養(yǎng)基 中，加入氯霉素終濃度為20μg/mL，卡那霉素終濃度為50μg/mL，L-Ar油inose終濃度為 0. 5mg/mU然后按1 %比例接種菌株地巧7-Lipo(包含質(zhì)粒地巧7和祀T28-Lipo)，37°C振 蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至ODe。。為0. 4-0. 6時(shí)，于16°C放置30分鐘。把50mL培養(yǎng)液平分為兩份，每瓶 約25mU分別在其中一瓶中加入IPTG，使其終濃度為0. 5mmol/L，然