肌醇六磷酸酶的制作方法
【專利說明】肌醇六磯酸酶 陽OOU 序列表
[0002] 此申請通過USPTOEFS-W邸服務(wù)器電子提交，如在MPEP§ 502. 05中授權(quán)并提出， 并且此電子申請包括電子提交的序列表；此序列表的全部內(nèi)容在此通過引用并入此申請的 說明書。在電子提交的ASCIICtxt)文檔文件上確定序列表如下：
發(fā)明領(lǐng)域
[0004] 提供具有肌醇六憐酸酶活性的多膚和編碼肌醇六憐酸酶的多核巧酸序列。具體而 言，序列提供了具有高比活性、高熱穩(wěn)定性、高耐熱性的肌醇六憐酸酶增加水平的表達，和 肌醇六憐酸酶的各種工業(yè)用途。
【附圖說明】
[0005] 圖1 :W純化的蛋白在肌醇六憐酸（pH5. 5)上測定比活性扣/mg)。畢赤酵母表 達的肌醇六憐酸酶：SEQIDN0:8(由沈QIDN0:7編碼）、沈QIDN0:3(由沈QIDN0:2 編碼）和SEQIDN0:6(由SEQIDNO:5編碼），和假單胞菌表達的肌醇六憐酸酶：SEQID N0:3(由沈QIDN0:1編碼）和沈QIDN0:6(由沈QIDN0:4編碼）。
[0006] 圖2 :在IOOmM的巧樣酸鹽抑5. 5+10%的山梨醇-10%的化Cl中肌醇六憐酸酶 沈QIDN0:3(由沈QIDNO: 1編碼）的DSC色譜圖。
[0007] 圖3 :肌醇六憐酸酶在有和沒有10%的山梨醇-10%的化Cl的IOOmM巧樣酸鹽抑 5. 5 中的DSCTm值（°C)。沈QIDN0:3(由沈QIDN0:1 編碼）和沈QIDN0:6(由沈QID N0:4編碼）為假單胞菌表達的。SEQIDN0:3(由SEQIDN0:2編碼）、SEQIDN0:6(由 SEQIDN0:5編碼）和SEQIDN0:8(由SEQIDN0:7編碼）為畢赤酵母表達的。
[0008] 圖4 :在4mM的肌醇六憐酸上使用化itton-Robinson"通用"緩沖液，肌醇六憐酸 酶的抑曲線。沈QIDN0:3(由沈QIDN0:1編碼）和沈QIDN0:6(由沈QIDN0:4編 碼）為假單胞菌表達的。SEQIDN0:3(由SEQIDN0:2編碼）和SEQIDN0:6(由SEQID N0:5編碼）為畢赤酵母表達的。
[0009] 圖5 :受到SGF+胃蛋白酶處理的肌醇六憐酸酶的SDS-PAGE。沈QIDN0:3(由 SEQIDNO: 1編碼）和SEQIDN0:6(由SEQIDN0:4編碼）為假單胞菌表達的。SEQID N0:3(由沈QIDN0:2表達）、沈QIDN0:6(由沈QIDN0:5表達）和沈QIDN0:8(由沈Q IDNO:7表達）為畢赤酵母表達的。
[0010] 圖6 :經(jīng)過SGF處理的熱穩(wěn)定的肌醇六憐酸酶的活性。觀察到熱穩(wěn)定的肌醇六憐 酸酶活性最小或無損失。在加入肌醇六憐酸酶之前使用pH11的緩沖液預(yù)澤滅TO樣品。
[0011] 圖7 :肌醇六憐酸酶發(fā)酵（30L)的假單胞菌（P.f.)表達水平。
【具體實施方式】
[0012] 肌醇六憐酸酶是憐的單醋水解酶，其催化肌醇六憐酸（肌醇六憐酸鹽）水解為憐 和肌醇。根據(jù)國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟（IUBMB)命名委員會和BairocM.的"2000 年的ENZYME數(shù)據(jù)庫"，Nucleic Acids Res 28:304-305(2000)的介紹，肌醇六憐酸酶被分類 為酶學(xué)委員會巧C)編號EC 3. 1. 3. 8,并且還被稱為：1-肌醇六憐酸酶；肌醇六憐酸鹽3-憐 酸水解酶；肌醇六憐酸1-憐酸酶；肌醇六憐酸3-憐酸酶；或肌醇六憐酸6-憐酸酶。肌醇 六憐酸酶還被分類為EC 3. 1. 3. 26,其也被稱為：4-肌醇六憐酸酶；6-肌醇六憐酸酶（基于 比-編號系統(tǒng)而不是ID-編號命名）；或肌醇六憐酸6-憐酸酶。肌醇六憐酸酶還被分類為 EC3. 1.3. 72,其也被稱為5-肌醇六憐酸酶。肌醇六憐酸酶還被稱為組氨酸憐酸酶（HAP); 0-螺旋獎肌醇六憐酸酶；紫色酸性憐酸酶（PAP) ; W及蛋白酪氨酸憐酸酶（PTP)。肌醇六 憐酸酶的替代名稱對本領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知的。
[0013] 肌醇六憐酸酶是可在動物飼料顆粒中具有作為補充物功效的酶的實例。肌醇六憐 酸酶使肌醇六憐酸降解為肌醇核和一個或多個游離的憐酸鹽分子。肌醇六憐酸由肌醇核組 成，六個憐酸鹽基團共價結(jié)合至該肌醇核。肌醇六憐酸是植物材料諸如大豆種子的成分，其 用于產(chǎn)生用于動物的飼料顆粒，諸如非反當(dāng)動物，例如家禽、肉雞、鳥類、雞、蛋雞、火雞、鴨、 碟和飛禽（fowl);反當(dāng)動物，例如母牛、家畜、馬和羊；家豬（pig)、豬（swine)、小豬、生長豬 和母豬；寵物包括但不限于：貓、狗、曬齒動物和兔子；魚包括但不限于大馬哈魚、娃魚、羅 非魚、餘魚和經(jīng)魚；W及甲殼類動物包括但不限于河郵和明郵。因為運些動物不能消化肌醇 六憐酸，所W肌醇六憐酸具有許多有害的影響。它馨合二價陽離子，諸如巧和儀，并且它的 憐酸鹽對于被飼養(yǎng)的動物是生物學(xué)上不可利用的形式，導(dǎo)致需要用運些營養(yǎng)物補充動物飲 食，盡管它們在原料中是豐富的。而且，因為運些營養(yǎng)物經(jīng)過動物而未經(jīng)消化，所W它們對 于能夠降解肌醇六憐酸的食物鏈更加向下的分解者是可W利用的，例如，導(dǎo)致與動物流出 物接觸的地表水中的藻類水華。
[0014] 非反當(dāng)動物，諸如雞、家豬和魚，不能夠從食物中獲取快速生長所需的充足的憐， 由于它們不能自然地產(chǎn)生從食物中發(fā)現(xiàn)的肌醇六憐酸釋放憐所必需的肌醇六憐酸酶。因為 大部分的憐W肌醇六憐酸的憐酸基團（肌醇六憐酸鹽）的形式存在，所W僅少量來自基于 植物的食品和種子的憐被利用。因此，為了增加它們的生長，存在為動物提供憐的需要。
[0015] 一種方案是向動物飼料添加無機憐補充物；然而，使用無機憐補充物導(dǎo)致由動物 排泄并進入環(huán)境的憐酸鹽的量增加，運導(dǎo)致水源的污染。
[0016] 另一種方案是為動物提供肌醇六憐酸酶補充物或添加肌醇六憐酸酶至動物飼 料。商業(yè)上可得到的肌醇六憐酸酶產(chǎn)品的實例包括但不限于：PHYZYME值upont、Danisco、 Genencor) !QUANTUM和FINA沈（AB Vista、AB Enzymes) ;NATUP冊S度ASF) ;R0N0ZYME值SM); Biofeed肌醇六憐酸酶（Novo Nordisk) ;Allzyme肌醇六憐酸酶（Alltech); OPTIP冊S巧nz;yvia、Phytex、Cornell) ;Rov油io(Adisseo) ;PHYT0UT(US Waters)。運些肌 醇六憐酸酶產(chǎn)品中的每個至少在生產(chǎn)水平、生產(chǎn)時間、高溫穩(wěn)定性、低抑穩(wěn)定性、比活性和 劑量要求中具有限制。因此，對于肌醇六憐酸酶存在需要，例如，在較少時間內(nèi)W較高產(chǎn)率 生產(chǎn)的肌醇六憐酸酶、在高溫下保持更多活性的肌醇六憐酸酶、在低抑下保持更多活性的 肌醇六憐酸酶或具有較高比活性的肌醇六憐酸酶，較高比活性的肌醇六憐酸酶使得使用者 能夠減少劑量水平并減少為動物飼料生產(chǎn)和提供肌醇六憐酸酶的成本。
[0017] 肌醇六憐酸酶是由核酸序列編碼的蛋白質(zhì)。核酸序列或DNA被克隆進入宿主有 機體，其能夠表達或生產(chǎn)肌醇六憐酸酶。本領(lǐng)域中存在可用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的多種已知的蛋 白質(zhì)表達系統(tǒng)。蛋白質(zhì)表達系統(tǒng)的實例包括有機體諸如：細菌、酵母菌、霉菌、哺乳類、植物 或昆蟲。各種因素影響表達系統(tǒng)的選擇，諸如被表達的蛋白的類型和生產(chǎn)的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的 量。Demain, (2009)"ProductionofRecombinantproteinsbyMicrobesandhigher organisms",BiotechnologyAdvances,第27卷，第297-306頁公開了多種蛋白表達系統(tǒng)的 各種優(yōu)點和缺點。
[0018] 商業(yè)上肌醇六憐酸酶從多種宿主有機體細胞外生產(chǎn)，宿主有機體包括但不限于： 黑曲霉、米曲霉、繩狀青霉、肌醇六憐酸酶油菜（甘藍型油菜）、畢赤酵母和粟酒裂殖酵母， 參見Pariza,"Determiningthesafetyofenzymesusedinanimalfeed",Regulatory ToxicologyandPharmacology56 (2010)332-：M2。
[0019] 肌醇六憐酸酶的工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)需要W低成本在少量時間內(nèi)產(chǎn)生高水平的酶的表 達系統(tǒng)。因此，對提供滿足或超出工業(yè)規(guī)模制造肌醇六憐酸酶的生產(chǎn)需求的基因存在需要。
[0020] 本發(fā)明的一個實施方式是提供編碼在革蘭氏陰性細菌表達系統(tǒng)中W高水平生產(chǎn) 的肌醇六憐酸酶的基因。另一個實施方式是提供編碼經(jīng)由細胞內(nèi)表達W高水平生產(chǎn)的肌醇 六憐酸酶的基因。另一個實施方式是在革蘭氏陰性細菌表達系統(tǒng)中經(jīng)由細胞內(nèi)表達生產(chǎn)肌 醇六憐酸酶，其中宿主有機體是假單胞菌。另一個實施方式是在巧光假單胞菌中生產(chǎn)肌醇 六憐酸酶。表達系統(tǒng)可W為本領(lǐng)域已知的任何巧光假單胞菌表達系統(tǒng)，例如，從Dow Global Technologies Inc.商業(yè)上可得的巧光假單胞菌表達系統(tǒng)，菌株DC454(美國專利公開申請 號20050130160和美國專利公開申請?zhí)?0050186666)。將編碼肌醇六憐酸酶或多膚的核酸 序列插入pMYC載體值OW Global Technologies Inc.，美國專利公開申請20050130160)或 pD0W1169載體值OW Global Technologies Inc.，美國專利公開申請?zhí)?0080058262)的任 何一個中，然后通過電穿孔將其引入巧光假單胞菌宿主。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道可用作本 發(fā)明的實施方式的可選載體。
[0021] 在另一個實施方式中，編碼肌醇六憐酸酶的DNA可被引入例如任意數(shù)目的革蘭氏 陰性細菌系統(tǒng)的質(zhì)粒上或被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化為例如任意數(shù)目的革蘭氏陰性細菌系統(tǒng)的基因組， 革蘭氏陰性細菌系統(tǒng)諸如大腸桿菌、假單胞菌種類諸如巧光、惡臭假單胞菌、銅綠假單胞 菌、雷爾氏種類（Ralstoniaspecies)或柄細菌種類。類似地，肌醇六憐酸酶可被引入任 意數(shù)目的革蘭氏陽性細菌表達系統(tǒng)，諸如，桿菌種類諸如枯草芽抱桿菌、巨大芽抱桿菌，或 短桿菌乳球菌種類諸如乳酸乳球菌、乳酸桿菌種類，或鏈霉菌種類諸如變鉛青鏈霉菌。其它 革蘭氏陰性、革蘭氏陽性或非相關(guān)的真菌的或古細菌的表達系統(tǒng)可被用于表達肌醇六憐酸 酶。
[0022] 在另一個實施方式中，編碼肌醇六憐酸酶的DNA可被引入質(zhì)粒W指導(dǎo)其表達。 包含編碼肌醇六憐酸酶的DNA的質(zhì)?？砂ǎ鏟犯、pET和pASK家族的大腸桿菌表 達載體；PCN51LT8、RSF1010、PWZ112T和pMYC家族的假單胞菌表達載體；pBAX、pHTOl和 抑IS1525家族的桿菌表達載體；PIJ6021和PIJ2460家族的鏈霉菌表達載體；和PNZ9530和 PNZ8148家族的乳酸菌表達載體，例如。運些實例是為了說明性目的，并不代表在其中可表 達SEQIDNO: 1的多核巧酸序列的完整的載體組。
[0023] 在另一個實施方式中，可W至少 7. 0g/l、8. 0g/l、9. 0g/l、10. 0g/l、11.0g/l、 12. 0g/L、13. 0g/L、14. 0g/L、15. 0g/L、16. 0g/L、17. 0g/L、18. 0g/L、19. 0g/L、20.Og/L、 21. 0g/L、22. 0g/L、23. 0g/L、24. 0g/L、25. 0g/L、26. 0g/L、27. 0g/L、28.0g/L、29.Og/L、 30. 0g/L、31. 0g/L、32. 0g/L、33. 0g/L、：M. 0g/L、35. 0g/L、36. 0g/L、37. 0g/L、38.Og/L、 39.Og/l、或至少40.Og/L或大于40.Og/L的水平通過細胞內(nèi)表達生產(chǎn)編碼肌醇六憐酸酶的 分離的、重組的或合成的核酸序列。
[0024] 在另一個實施方式中，肌醇六憐酸酶的發(fā)酵生產(chǎn)時間為小于150小時、145小時、 140小時、135小時、130小時、125小時、120小時、115小時、110小時、105小時、100小時、95 小時、90小時、85小時、80小時、75小時、70小