抗雞傳染性法氏囊病毒的scFv抗體在治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病制劑中的應(yīng)用
【專利說(shuō)明】抗雞傳染性法氏囊病毒的scFv抗體在治療或預(yù)防雞傳染性法 氏囊病制劑中的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及抗雞傳染性法氏囊病毒的SCFv抗體在治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病 制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 雞傳染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD)是由雞傳染性法氏囊病病 毒（Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，IBDV 主要侵害3-12周齡的雛雞和青年雞，損傷雞的中樞免疫器官一一法氏囊。具有傳播速度快、 傳染性強(qiáng)、感染率及死亡率均高的特點(diǎn)。該病目前在全球范圍內(nèi)均有分布，是養(yǎng)禽業(yè)最重要 疾病之一，并且因免疫失敗而造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。
[0004] IBDV可在雛雞法氏囊中的淋巴細(xì)胞，尤其是B淋巴細(xì)胞中迅速繁殖，導(dǎo)致免疫抑 制，從而可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其它病原體的易感性并且降低對(duì)其它疫苗的反應(yīng)性?？贵w藥物目前 是有效的治療藥物，高免血清和卵黃抗體在發(fā)病早期均可起到良好的效果，但是由于工業(yè) 化生產(chǎn)可控性差和存在水平傳播疾病等原因而受到限制。本發(fā)明利用抗原-抗體共表達(dá)的 細(xì)菌展示技術(shù)篩選獲得了具有較高中和活性抗IBDV的scFv抗體?？贵w藥物抗病毒的中和活 性與治療效果成正比，中和活性越高，其治療效果越好。本發(fā)明提供的scFv抗體的中和活性 顯著提高，將具有更好的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供抗雞傳染性法氏囊病毒的scFv抗體在治療或預(yù)防雞傳染性 法氏囊病制劑中的應(yīng)用。該scFv抗體的中和活性比已授專利權(quán)的scFv-LTH抗體(專利"scFv 抗體、其編碼基因及其在制備治療或預(yù)防雞傳染性法氏囊病制劑中的應(yīng)用"中的scFv抗體 在此專利中命名為scFv-LTH抗體）高60倍以上，在預(yù)防及治療IBD將具有更好的效果。該 scFv抗體與scFv-LTH抗體的核苷酸的同源性為88.66%，氨基酸的同源性為79.67%，說(shuō)明兩 株scFv是完全不同的兩種抗體。
[0006] 本發(fā)明提供了 一種單鏈抗體，命名為scFv-GXC抗體，包括由重鏈可變區(qū)、輕鏈可變 區(qū)以及它們之間的連接區(qū)組成； 所述重鏈可變區(qū)為如下(a)或(b): (a)由序列表中序列1自N末端第1-123位氨基酸殘基 組成的蛋白質(zhì)；（b)將(a)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相 同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)； 所述輕鏈可變區(qū)為如下(c)或(d): (c)由序列表中序列1自N末端第139-244位氨基酸殘 基組成的蛋白質(zhì)；（d)將(c)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有 相同活性的由其衍生的蛋白質(zhì)。
[0007] 所述單鏈抗體具體可為如下(e)或(f):(e)由序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)；（f)將 (e)經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同活性的由其衍生的 蛋白質(zhì)。
[0008] 編碼所述單鏈抗體的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0009] 所述基因中，編碼所述重鏈可變區(qū)的DNA分子為如下（1)或(2)或（3):(1)序列表的 序列2自5'末端第1-369位核苷酸所示的DNA分子;（2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜 交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（3)與（1)限定的DNA序列至少具有90%以上同源 性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0010] 所述基因中，編碼所述輕鏈可變區(qū)的DNA分子為如下(4)或(5)或(6): (4)序列表的 序列2自5'末端第415-732位核苷酸所示的DNA分子；（5)在嚴(yán)格條件下與(4)限定的DNA序列 雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（6)與（4)限定的DNA序列至少具有90%以上同 源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0011] 所述基因具體可為如下(7)或(8)或(9)或（10): (7)序列表的序列2自5'末端第1-732位核苷酸所示的DNA分子；（8)序列表的序列2所示的DNA分子；（9)在嚴(yán)格條件下與（7)或 (8)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子；（10)與（7)或(8)限定的DNA 序列至少具有90%以上同源性且編碼具有相同活性的蛋白的DNA分子。
[0012] 上述嚴(yán)格條件可為在6 XSSC，0.5% SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用2X SSC、 0.1%505和1\55(：、0.1%505各洗膜一次。
[0013] 含有以上任一所述基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍。
[0014] 基于所述單鏈抗體的其它形式的抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述其它形式的 抗體可為Fab形式的抗體、I gG形式的抗體等。
[0015] 本發(fā)明還保護(hù)所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體在制備產(chǎn)品中的應(yīng)用;所述產(chǎn) 品的功能為如下（I)、（ Π )或（ΙΠ )或(IV) : (I)檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒;（Π )輔助鑒定雞 傳染性法氏囊病病毒；（ΙΠ )預(yù)防和/或治療雞傳染性法氏囊?。唬↖V)預(yù)防和/或治療由雞傳 染性法氏囊病病毒誘發(fā)的疾病。
[0016] 含有所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體的產(chǎn)品也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；所述 產(chǎn)品的功能為如下（I)、（ Π )或（ΙΠ )或(IV) : (I)檢測(cè)雞傳染性法氏囊病病毒；（Π )輔助鑒定 雞傳染性法氏囊病病毒；（HO預(yù)防和/或治療雞傳染性法氏囊??；（IV)預(yù)防和/或治療由雞 傳染性法氏囊病病毒誘發(fā)的疾病。
[0017] 本發(fā)明還保護(hù)所述單鏈抗體或所述其它形式的抗體在輔助鑒定雞傳染性法氏囊 病病毒中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為非疾病診斷方法。
[0018] 本發(fā)明提供了 一種單鏈抗體（即ScFv-GXC抗體），SCFv-GXC抗體具有與VP2蛋白及 多種IBDV毒株特異性結(jié)合的能力，可阻斷IBDV對(duì)雞胚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生CPE且其中和活性比 已授專利權(quán)的scFv-LTH抗體高60倍以上。免疫血清和卵黃抗體在使用過(guò)程中存在制備繁 瑣、生產(chǎn)成本高、效果不穩(wěn)定、工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量難以控制及引發(fā)水平傳播疾病等弊端。本發(fā) 明提供的scFv-GXC抗體可以克服上述弊端，具有特異性強(qiáng)、治療效果更好，工業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量 可控，避免了卵黃抗體引起的水平傳播疾病等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0019 ] 圖1為s CF V-GXC抗體溶液的SDS-PAGE圖譜。
[0020] 圖2為ScFv-GXC抗體溶液的SEC-HPLC圖譜。
[00211圖3為ELISA檢測(cè)scFv-GXC抗體對(duì)VP2蛋白的特異性和親和力的結(jié)果。
[0022]圖4為ELISA檢測(cè)scFv-GXC抗體對(duì)不同IBDV病毒的特異性和親和力的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平 均值。
[0024] pET_27b( + )載體：購(gòu)自Novagen公司，Cat. No. 69337-3。大腸桿菌Rosetta:購(gòu)自 Novagen公司，Cat. No. 71403-4 AFl細(xì)胞(雞成纖維細(xì)胞）：購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué) 研究院細(xì)胞資源中心，Cat. N〇.3131C000100040003(LSPF雛雞:購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。雞 新城疫滅活疫苗(La Sota株），購(gòu)買自哈獸研維科生物公司，編號(hào)080012008。
[0025]雞傳染性法氏囊病活疫苗(Gt株）：哈獸研維科生物公司，編號(hào)080012122。雞傳染 性法氏囊病中等毒力活疫苗(NF8株）：揚(yáng)州威克生物工程有限公司，編號(hào)101042056。雞傳染 性法氏囊病活疫苗（1-65株）：Shafit InterGumboro，編號(hào)S20651010A。雞傳染性法氏囊病 活疫苗(BJ836株）：上海海利生物藥品有限公司，編號(hào)090202026。雞傳染性法氏囊病活疫苗 (MB株）:ABIC，編號(hào)20621150B。雞傳染性法氏囊病活疫苗(B87株）：湖南省中岸生物藥業(yè)有 限公司，編號(hào)180022026。
[0026]質(zhì)粒pHisSUMO:參考文獻(xiàn)：姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山. 利用SUMO融合系統(tǒng)高效表達(dá)可溶性重組蛋白的研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008, 39(10): 57-62;李璐，尹成凱，李德山.高效表達(dá)可溶性重組蛋白表達(dá)載體--pHisSUMO.生物 技術(shù)，2009，19(3): 11-14·。
[0027]包被液(pH9.6):取Na2CO3 0.15g、NaHC03 0.293g，溶于水并用水定容至 100mL。
[0028] PBS緩沖液：取NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP〇4.12H2〇 3.58g、KH2P〇4 0.24g，溶于IL 水。
[0029] 實(shí)施例1、scFv-GXC抗體(單鏈抗體)及其編碼基因的發(fā)現(xiàn) 1、抗體庫(kù)的構(gòu)建 取MDV免疫后的雞脾臟，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank上的抗體序列，設(shè)計(jì)出 克隆抗體可變區(qū)的基因引物，以cDNA為模板，使用PCR的方法克隆抗體可變區(qū)。將VH與VL片 段分別插入到pTl inker載體的Linker的上游和下游，構(gòu)建出ScFv抗體庫(kù)。將ScFv抗體庫(kù)進(jìn) 行酶切并與細(xì)菌展示載體pBH)-Ab-VP2進(jìn)行連接，構(gòu)建抗IBDV抗原抗體共表達(dá)的細(xì)菌表面 展示文庫(kù)。VH 約 380bp、VL 約