一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑的制作方法
【專利摘要】一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。該免疫佐劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30～80g、中藥黃酮20～50g、維生素6～10g、明膠4～6g和蔗糖40～70g。本發(fā)明的免疫佐劑具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.本發(fā)明所制備的免疫佐劑，具有耐熱效果，可提高疫苗運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等便利性。2.采用本發(fā)明免疫佐劑所制備的疫苗在免疫注射時(shí)可以減少應(yīng)激反應(yīng)，降低雞群疾病感染風(fēng)險(xiǎn)。3.采用本發(fā)明免疫佐劑制備疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的產(chǎn)生中和抗體。
【專利說明】一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著集約化養(yǎng)禽業(yè)的興起和國(guó)際貿(mào)易的增加，禽病流行日趨嚴(yán)重，造成家禽的高死亡率，嚴(yán)重制約著養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，造成世界養(yǎng)雞業(yè)嚴(yán)重的損失，危及經(jīng)濟(jì)發(fā)展、食品安全和社會(huì)穩(wěn)定。雞傳染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由傳染性法氏囊病毒(Infection bursal disease virus, IBDV)引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病，主要感染3-12周齡的青年雞，該病毒主要在法氏囊的淋巴細(xì)胞內(nèi)增殖，并且對(duì)其它免疫器官造成不同程度的損傷，最終導(dǎo)致雞的法氏囊萎縮而引起雞的免疫抑制。該病無明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生，常通過被污染的飼料、飲水、糞便、雞舍用具、人員衣服等途徑而傳播，潛伏期為1-5天，出現(xiàn)癥狀后第3天開始死亡，4-6天是死亡高峰期，以后逐漸停止死亡，發(fā)病率可達(dá)90%以上，死亡率不等，一般為10%-50%。本病在臨床上可以導(dǎo)致體重減輕、生長(zhǎng)緩慢和骨骼肌出血等癥狀，衛(wèi)生條件較差的情況下常伴發(fā)其他疾病，死亡率進(jìn)一步提高,雛雞個(gè)體小,抗病力差,一旦發(fā)生疫病,則傳染快,死亡率高,死亡率達(dá)80%以上，損失更大，給養(yǎng)雞業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]疫苗是由免疫原性較好的病原微生物經(jīng)繁殖和處理后制成的制品，接種動(dòng)物機(jī)體后，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，當(dāng)體內(nèi)的抗體滴度達(dá)到一定數(shù)值后，就可以抵抗這種病原微生物的侵襲、感染，起到預(yù)防這種疾病的作用。隨著我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的迅猛發(fā)展，對(duì)雞傳染性法氏囊病的防治越來越重要。
[0004]多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力。此外，中藥多糖對(duì)低等生物的生產(chǎn)和貯藏具有特殊的保護(hù)作用。中藥多糖富含羥基，可以和低等活性生物結(jié)合，構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)，在活性生物表面形成保護(hù)膜，實(shí)現(xiàn)對(duì)活性生物的保護(hù)作用。
[0005]維生素是機(jī)體代謝中必不可少的有機(jī)化合物。機(jī)體猶如一座極為復(fù)雜的化工廠，不斷地進(jìn)行著各種生化反應(yīng)。其反應(yīng)與酶的催化作用有密切關(guān)系。酶要產(chǎn)生活性，必須有輔酶參加。已知許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶的組成分子。因此，維生素是維持和調(diào)節(jié)機(jī)體正常代謝的重要物質(zhì)。維生素是動(dòng)物生長(zhǎng)過程中不可缺少的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，尤其在應(yīng)激發(fā)生的情況下維生素的作用更加明顯。適當(dāng)?shù)氖秤镁S生素可以降低動(dòng)物應(yīng)激，減少疾病發(fā)生率，提高動(dòng)物抗病能力。
[0006]黃酮類化合物是自然界中存在的多元酚類物質(zhì)，也是自然界藥用植物中的主要活性成分之一。它是指具有15個(gè)碳原子并以C6-C3-C6的方式構(gòu)成的三環(huán)天然有機(jī)物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇中產(chǎn)生的二級(jí)代謝產(chǎn)物，現(xiàn)在已分離鑒定的有4000多種。它廣泛存在于果蔬、中草藥中，無毒副作用，它具有顯著的清除機(jī)體內(nèi)自由基、抗老化、抗突變、調(diào)血脂降血壓等藥理保健功能，是一類極具開發(fā)前景的天然有機(jī)抗氧化劑，這些抗氧化活性物質(zhì)可以減少和清除機(jī)體內(nèi)自由基，具有預(yù)防疾病的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑的技術(shù)方案，該免疫佐劑能夠大幅度提高了機(jī)體的免疫力，刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的中和抗體，提高了機(jī)體預(yù)防疾病的能力。 [0008]所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于該免疫佐劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~80g、中藥黃酮20~50g、維生素6~10g、明膠4~6g和蔗糖40~70g，所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:穿心蓮、懷牛膝、茯苓、板藍(lán)根、甘草、蕁麻、問荊和黃芪。
[0009]所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于該免疫佐劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖40~60g、中藥黃酮30~40g、維生素6~8g、明膠
4.5~5.5g和鹿糖50~60g。
[0010]所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的維生素中含有維生素C 20~40%、維生素E 10~30%、維生素D3 5~15%、維生素BI 15~35%、維生素K 10~20%和維生素B2 5~20%。
[0011]所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的中藥組合物中含有穿心蓮10~30份、懷牛膝20~40份、茯苓10~20份、板藍(lán)根10~30份、甘草10~30份、蕁麻10~30份、問荊10~20份和黃芪10~30份。
[0012]所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的中藥組合物中含有穿心蓮15~25份、懷牛膝25~35份、茯苓12~18份、板藍(lán)根15~25份、甘草15~25份、蕁麻15~25份、問荊12~18份和黃芪15~25份。
[0013]所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得:
a、按所述重量份稱取穿心蓮、懷牛膝、茯苓、板藍(lán)根、甘草、蕁麻、問荊和黃芪，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清液進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥制得中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后經(jīng)冷凍真空干燥制成中藥黃酮。[0014]上述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，設(shè)計(jì)合理，與傳統(tǒng)的免疫佐劑相比其具有以下優(yōu)點(diǎn):
1.本發(fā)明所制備的免疫佐劑，具有耐熱效果，可提高疫苗運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等便利性。
[0015]2.采用本發(fā)明免疫佐劑所制備的疫苗在免疫注射時(shí)可以減少應(yīng)激反應(yīng)，降低雞群疾病感染風(fēng)險(xiǎn)。
[0016]3.采用本發(fā)明免疫佐劑制備疫苗，可以大大提高活疫苗的使用效果，快速的產(chǎn)生中和抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0017]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限止本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0018]實(shí)施例1:中藥多糖和中藥黃酮的制備
a、按穿心蓮20份、懷牛膝30份、茯苓20份、板藍(lán)根10份、甘草10份，蕁麻30份、問荊20份、黃芪30份稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到中藥多糖；
g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后，再經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌，然后經(jīng)冷凍真空干燥即得到中藥黃酮。
[0019]實(shí)施例2:中藥多糖和中藥黃酮的制備
將實(shí)施例1的步驟a的中藥組合物改為穿心蓮10份、懷牛膝20份、茯苓15份、板藍(lán)根25份、甘草25份、蕁麻10份、問荊15份和黃芪25份，其它步驟條件均與實(shí)施例1相同。
[0020]實(shí)施例3:
將實(shí)施例1的步驟a的中藥組合物改為穿心蓮30份、懷牛膝40份、茯苓10份、板藍(lán)根30份、甘草30份、蕁麻20份、問荊10份和黃芪15份，其它步驟條件均與實(shí)施例1相同。
[0021]實(shí)施例4:一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑的制備
在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖80g、中藥黃酮50g、維生素8g(維生素C 1.8g、維生素E lg、維生素D3 l g、維生素BI 2g、維生素K 1.2g、維生素B2 lg)、明膠5g和蔗糖50g,即得到雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片用免疫佐劑。其中中藥多糖和中藥黃酮由實(shí)施例I制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉1~1.2g,磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0022]實(shí)施例5:—種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑的制備
在每1000ml磷酸緩沖液中加入中藥多糖30g、中藥黃酮20g、維生素6g(維生素C 1.2g、維生素E 1.8g、維生素D3 0.9g、維生素BI 1.2g、維生素K 0.6g、維生素B2 0.3g)、明膠4g和蔗糖40g，即得到豬繁殖與呼吸綜合征復(fù)合活疫苗用免疫佐劑。其中中藥多糖和中藥黃酮由實(shí)施例1制得。磷酸緩沖液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0.5g，磷酸氫二鈉I~
1.2g，磷酸二氫鉀0.05~0.5g，氯化鈣0.05~0.2g，含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，經(jīng)116°C，高壓滅菌30分鐘得到。
[0023]實(shí)施例6:泡騰材料的制備
a、酸性材料的制備
按重量份分別稱取檸檬酸15份、乳糖10份、EDTA 15份、亮藍(lán)指示劑0.5份，將上述成分充分混合，40~65°C烘干后過8~12目篩，制得酸性顆粒備用；
b、堿性材料的制備
按重量份分別稱取碳酸氫鈉15份、乳糖10份、亮藍(lán)指示劑1份，將上述成分充分混合，40~65°C烘干后過8~12目篩，制得堿性顆粒備用；
C、將上述堿性材料與酸性材料按1:1混合均勻，并加入0.5~I重量份的左旋咪唑，經(jīng)Co-60輻射滅菌制得泡騰材料。
[0024]實(shí)施例7:免疫佐劑的使用方法
1.雞傳染性法氏囊病毒懸液制備
(I)生廣用毒種制備:
將已長(zhǎng)成單層的DF-1細(xì)胞，棄去細(xì)胞生長(zhǎng)液，按細(xì)胞生長(zhǎng)液1%量接種病毒，37°C吸附I小時(shí)，加入細(xì)胞維持液，置37°C繼續(xù)培養(yǎng)，40小時(shí)后開始觀察，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，置_20°C保存。
[0025](2)制苗材料的選擇:選擇生長(zhǎng)良好的DF-1單層細(xì)胞。
[0026](3)制苗用細(xì)胞毒液的繁殖:
將已長(zhǎng)成良好單層的DF-1細(xì)胞，棄去生長(zhǎng)液，用pH值7.2-7.6的DMF12維持液將生產(chǎn)用毒種稀釋3-4倍,按生長(zhǎng)液量的1%接種稀釋后的病毒,37°C吸附I小時(shí)，加細(xì)胞維持液，置37°C繼續(xù)旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。接毒后，每天觀察細(xì)胞病變情況，病變細(xì)胞達(dá)80%時(shí)，即可收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，置-20°C以下凍結(jié)保存。
[0027]2.凍干制劑制備
將無菌檢驗(yàn)和病毒含量檢測(cè)合格的細(xì)胞毒液，混合于同一滅菌容器內(nèi)，按1:1 (v:v)t匕例加入實(shí)施例4或5中制備的免疫佐劑，充分混勻后定量分裝，冷凍真空干燥制成雞傳染性法氏囊病凍干制劑。
[0028]3.泡騰片制備
將按上述制備的雞傳染性法氏囊病凍干制劑與實(shí)施例6得到的泡騰材料按按重量比2:1~3混合均勻后，用壓片機(jī)壓制成片劑，定量分裝。
[0029]上述的細(xì)胞生長(zhǎng)液含90%DMEM/F12、10%胎牛血清、90~110U/ml抗菌素，pH
7.2~7.3,DO 30~60% ;細(xì)胞維持液含98%DMEM/F12、2%胎牛血清、90~100U/ml抗菌素，pH 7.2 ~7.3、DO 30 ~50%。[0030]試驗(yàn)例I本發(fā)明雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑的應(yīng)用 I材料
1.1雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片
由雞傳染性法氏囊病毒凍干制劑和雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑制得。
[0031]1.2試驗(yàn)用雞200日齡海蘭蛋種雞2000只；10日齡三黃肉雞2000只。
[0032]2 方法
2.1將2000只200日齡海蘭蛋種雞分為兩組，第一組1000只，作為實(shí)驗(yàn)組，在飼喂全價(jià)飼料(參考雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)NY/33-2004)的同時(shí)飼喂本發(fā)明所制備的雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片10片；第二組1000只，作為對(duì)照組，只飼喂全價(jià)飼料。試驗(yàn)實(shí)施期記錄各組產(chǎn)蛋率、受精率、死淘率、雞傳染性法氏囊抗體水平等指標(biāo)，觀察期為四周。
[0033]2.2將2000只10日齡三黃肉雞分為兩組，第一組1000只，作為實(shí)驗(yàn)組，在飼喂全價(jià)飼料(參考雞飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)NY/33-2004)的同時(shí)飼喂本發(fā)明所制備的雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片10片；第二組1000只，作為對(duì)照組，只飼喂全價(jià)飼料。試驗(yàn)實(shí)施期記錄各組平均日增重、死淘率和雞傳染性法氏囊抗體水平等指標(biāo)，觀察期為四周。
[0034]3 結(jié)果
3.1崩解時(shí)限結(jié)果
取I片泡騰片，置盛有200ml水的250ml燒杯中，水溫15_25°C，觀察并記錄完全溶解的時(shí)間，結(jié)果見表1。
[0035]表1崩解時(shí)限檢驗(yàn)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于該免疫佐劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖30~80g、中藥黃酮20~50g、維生素6~10g、明膠4~6g和蔗糖40~70g，所述的中藥多糖和中藥黃酮從以下中藥組合物中提取得到:穿心蓮、懷牛膝、茯苓、板藍(lán)根、甘草、蕁麻、問荊和黃芪。
2.如權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于該免疫佐劑每1000ml磷酸緩沖液中含有中藥多糖40~60g、中藥黃酮30~40g、維生素6~8g、明膠4.5~5.5g和鹿糖50~60g。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的維生素中含有維生素C 20~40%、維生素E 10~30%、維生素D3 5~15%、維生素BI 15~35%、維生素K 10~20%和維生素B2 5~20%。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的中藥組合物中含有穿心蓮10~30份、懷牛膝20~40份、茯苓10~20份、板藍(lán)根10~30份、甘草10~30份、蕁麻10~30份、問荊10~20份和黃芪10~30份。
5.如權(quán)利要求4所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的中藥組合物中含有穿心蓮15~25份、懷牛膝25~35份、茯苓12~18份、板藍(lán)根15~25份、甘草15~25份、蕁麻15~25份、問荊12~18份和黃芪15~25份。
6.如權(quán)利要求4所述的一種雞傳染性法氏囊病活疫苗泡騰片免疫佐劑，其特征在于所述的中藥多糖和中藥黃酮通過以下步驟制得: a、按所述重量份稱取穿心蓮、懷牛膝、茯苓、板藍(lán)根、甘草、蕁麻、問荊和黃芪，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，`室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖，上清即為粗制中藥黃酮； d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； e、將d中上清液進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥制得中藥多糖； g、將c中粗制中藥黃酮進(jìn)行減壓真空濃縮，濃縮物用次滅菌注射用水稀釋清洗，再次進(jìn)行減壓真空濃縮，如此三次后經(jīng)冷凍真空干燥制成中藥黃酮。
【文檔編號(hào)】A61K31/525GK103550286SQ201310579859
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】張秀文, 李陽(yáng), 閆艷麗, 劉雪, 王二先, 盛璐絲 申請(qǐng)人:浙江美保龍生物技術(shù)有限公司