一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng) 的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鏈霉菌（Str巧tomyces)在分類學(xué)上屬于原核生物界、放線菌目、鏈霉菌科，是一類 具有分枝絲狀體的好氧革蘭氏陽性細(xì)菌，是±壤中主要的微生物類群之一。鏈霉菌基因組 平均大小為8000化，約為大腸桿菌基因組的兩倍。同其它生物相比，其基因組最大特征之一 就是其DNA具有極高的G+Cmol%，可高達(dá)69~78%，是迄今為止已知的G+Cmol%含量最高的 生物類群之一。鏈霉菌是工業(yè)微生物中最具有商用價(jià)值的類群之一。人們已經(jīng)了解到自然 界中有近70%的抗生素是由鏈霉菌及其近緣放線菌產(chǎn)生的。自1928年AlexanderFleming 發(fā)現(xiàn)第一個(gè)抗生素一一青霉素W來，數(shù)W萬計(jì)的抗生素正源源不斷地被人們發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)造出 來并造福于人類。
[0003] 作為活性天然產(chǎn)物重要來源的陸生微生物隨著研究的不斷擴(kuò)展與深入，其生物多 樣性及相應(yīng)的結(jié)構(gòu)、活性多樣性已逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，但作為生物起源和覆蓋地球表面約 70%的海洋中所蘊(yùn)藏的微生物卻知之甚少。由于海洋微生物所處的海洋是一個(gè)十分獨(dú)特的 環(huán)境，具有高鹽、高堿、低溫的特點(diǎn)，導(dǎo)致了微生物類群的多樣性和微生物基因資源的多樣 性。目前已培養(yǎng)的微生物只占所有微生物的0. 1 %到1 %，因此豐富的海洋生物資源無疑是 天然藥物篩選的重要來源。據(jù)報(bào)道，美國國立腫瘤研究所每年篩選新的抗癌化合物中有5% 來自海洋生物，從海洋生物提取的化合物有10%具有抗癌活性。因此，基于海洋微生物的活 性天然產(chǎn)物生物合成途徑的探索和發(fā)現(xiàn)是新藥開發(fā)的重要補(bǔ)充和延伸。
[0004] 海洋微生物中的一個(gè)重要群體就是專屬性海洋放線菌。1991年化nical等發(fā)現(xiàn) 了第一個(gè)依賴海水生長的特殊放線菌家族并將其命名為"MR1"。2005年，結(jié)合全面的形 態(tài)學(xué)特征分析和基因組測(cè)序分析后，"MAR1"被鑒定為第一個(gè)專屬性海洋放線菌，并正式 更名為"Salinispora"。隨后，Demequina、Marinispora、Solwaraspora、Lamerjespora、 Serinicoccus、Salinibacterium、Aeromicrobium、Willamsia、MarinactinosporaW 及Sciscionella等放線菌屬相繼被分離鑒定為專屬性海洋放線菌。其中，海洋放線菌 SalinisporaarenlocolaCNS-205就是專屬性海洋放線菌Salinispora的代表性菌株。海 洋放線菌SalinisporaarenlocolaCNS-205分布廣泛，由于其生活環(huán)境的特殊性，該菌產(chǎn) 生多種活性多樣、結(jié)構(gòu)新穎次生代謝產(chǎn)物，成為了新藥開發(fā)研究的新資源。然而其生物合成 機(jī)制卻一直未被掲示。現(xiàn)有技術(shù)中尚未有關(guān)于海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法。 陽0化]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種海洋放線菌基因遺傳操作 系統(tǒng)的構(gòu)建方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中尚未有關(guān)于海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方 法的問題。 陽007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，包括步驟： A、 將已滅菌的SFMS培養(yǎng)基融化，溫度降至40~50°C，在SFMS培養(yǎng)基中加入適量的抗生 素，倒平板，將SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子懸液涂布平板，25~30°C培養(yǎng)4~5d; B、 將整合型質(zhì)粒通過化CI2法導(dǎo)入供體菌中，借助于供體菌上tra基因，所述整合型質(zhì) 粒W接合轉(zhuǎn)移方式從供體菌導(dǎo)入到步驟A得到的SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子 中進(jìn)行整合。
[0008] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述步驟A中，所述抗生 素為阿泊拉霉素。
[0009] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述步驟B中，所述整合 型質(zhì)粒為PSET152和PIB139。
[0010] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述步驟B中，所述供體 菌為PUZ8002。
[0011] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述步驟B中，供體菌與 受體菌SalinisporaarenlocolaCNS-205 抱子的比例為（15~1) :1。
[0012] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述步驟B中，供體菌與 受體菌SalinisporaarenlocolaCNS-205 抱子的比例為 8:1。
[0013] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述步驟B之后包括：W 整合型質(zhì)粒PSET152和PIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV為模板，設(shè)計(jì)引物CP1 和CP2W驗(yàn)證接合轉(zhuǎn)移子，提取SalinisporaarenlocolaCNS-205基因組DNA并進(jìn)行PCR 驗(yàn)證。
[0014] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述CP1為 5, -TTTATCACCACCGACTATTTGC-3' ；所述CP2 為 5' -TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3,。
[0015] 所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其中，所述PCR驗(yàn)證的條件反 應(yīng)程序?yàn)?8°(：1111111;981：3〇3,581：3〇3,721：3〇3,30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇111111。
[0016] 有益效果：本發(fā)明通過接合轉(zhuǎn)移方式將整合型質(zhì)粒從供體菌導(dǎo)入到受體菌 SalinisporaarenlocolaCNS-205 抱子中進(jìn)行整合，實(shí)現(xiàn)了向Salinisporaarenlocola CNS-205導(dǎo)入外源DM片段的可能性。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中PIB139和PSET152接合轉(zhuǎn)移子的PCR驗(yàn)證的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]本發(fā)明提供一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，為使本發(fā)明的目的、 技術(shù)方案及效果更加清楚、明確，W下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的 具體實(shí)施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0019] 本發(fā)明提供一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其包括步驟： A、將已滅菌的SFMS培養(yǎng)基融化，溫度降至40~50°C，在SFMS培養(yǎng)基中加入適量的抗生 素，倒平板，將SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子懸液涂布平板，25~3(TC培養(yǎng)4~5d; B、將整合型質(zhì)粒通過CaCls法導(dǎo)入供體菌中，借助于供體菌上tra基因，所述整合型質(zhì) 粒1^接合轉(zhuǎn)移方式從供體菌導(dǎo)入到SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子中，并進(jìn)行整 厶 η〇
[0020] 通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明成功地將位點(diǎn)特異性整合型質(zhì)粒整合到Salinispora arenlocolaCNS-205抱子中，為后續(xù)SalinisporaarenlocolaCNS-205染色體上各基因的 功能研究和生物合成基因的改造奠定了基礎(chǔ)。
[0021] 所述步驟A中，所述抗生素為阿泊拉霉素。
[0022] 所述步驟B中，所述整合型質(zhì)粒為pSET152和pIB139。質(zhì)粒是一種閉合環(huán)狀雙鏈 DNA，它不屬于基因組DNA，游離于染色體DNA之外。在鏈霉菌遺傳操作中人們常將其作為 載體來介導(dǎo)外源DNA向宿主細(xì)胞導(dǎo)入。載體可依據(jù)其是否能整合到鏈霉菌染色體DNA上的 特點(diǎn)分為整合型載體和非整合型載體，例如，整合型載體為整合型質(zhì)粒PIB139和PSET152。 而非整合型載體又可依據(jù)其是否含有鏈霉菌復(fù)制子分為自殺型載體和游離型載體，例如游 離型載體PYH7。
[0023] 將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方式主要有：巧轉(zhuǎn)移、接合轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)化和顯微注射 等。本發(fā)明所述步驟B中，選用接合轉(zhuǎn)移的方式將外源整合型質(zhì)粒導(dǎo)入到Salinispora arenlocolaCNS-205抱子中，運(yùn)是由于接合轉(zhuǎn)移因具有導(dǎo)入效率較高、高度跨種屬差異、價(jià) 格低廉、操作方便等優(yōu)勢(shì)。
[0024] 所述步驟B中，所述供體菌為PUZ8002。
[00巧]所述步驟B中，接合轉(zhuǎn)移的供體菌(大腸桿菌)與受體菌Salinisporaarenlocola CNS-205抱子的比例為（15~1) :1。優(yōu)選地，所述步驟B中，接合轉(zhuǎn)移的供體菌(大腸桿菌） 與受體菌SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子的比例為8:1。運(yùn)是由于在接合轉(zhuǎn)移過 程中，含有外源載體的供體菌和受體菌（SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子)在同一個(gè) 平板上生長時(shí)，兩者之間存在不可避免的相互競爭。由于受體菌Salinisporaarenlocola CNS-205抱子的生長速度比供體菌的生長速度緩慢，過量的供體菌會(huì)使鏈Salinispora arenlocolaCNS-205抱子的生長受到抑制，導(dǎo)致接合轉(zhuǎn)移率降低。接合轉(zhuǎn)移的所述供體菌 與所述SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子的比例為8:1時(shí)，接合轉(zhuǎn)移率達(dá)到最高。 [00%] 下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。 實(shí)施例
[0027]實(shí)驗(yàn)材料 基因克隆受體E.coliDH10B、接合轉(zhuǎn)移供體菌E.coliET12567(pUZ8002)、整合型質(zhì)粒PSET152和PIB139 (均攜帶阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV，接合轉(zhuǎn)移位點(diǎn)or口）。 W測(cè)試劑 硫鏈絲菌素和阿泊拉霉素購自美國Sigma公司；氯霉素、氨節(jié)青霉素、卡那霉素、硫鏈 絲菌素、Lambda/Hint限制性內(nèi)切酶、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自大連寶生物 工程有限公司；其他常用試劑均購于上海國藥集團(tuán). 培養(yǎng)基和抗生素 SalinisporaarenlocolaCNS-205的平板培養(yǎng)基為SFMS，培養(yǎng)細(xì)菌的為LB培養(yǎng)基、抱 子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)基為2ΧΥΤ、接合轉(zhuǎn)移使用的是SFMS培養(yǎng)基。 陽029]LB中抗生素濃度為：阿泊拉霉素25μg/mL，氯霉素25μg/mL，卡那霉素25μg/血， 氨節(jié)青霉素100μg/mL;接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基中抗生素濃度為阿泊拉霉素25μg/mU糞晚酬酸 25μg/mLo
[0030] (1)、抗生素敏感性實(shí)驗(yàn) 將已滅菌的SFMS培養(yǎng)基融化，溫度降至45°C，加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的抗生素(卡那霉素 0~100μg/mL;氯霉素0~100μg/mL;阿泊拉霉素0~100μg/mL;硫鏈絲菌素0~100μ