g/mL)， 倒平板，將SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株的抱子懸液涂布平板，28°C培養(yǎng)5d，根據(jù) SalinisporaarenlocolaCNS-205 菌株生長狀態(tài)評定SalinisporaarenlocolaCNS-205 菌株對抗生素的敏感性。
[0031] (2)、大腸桿菌與SalinisporaarenlocolaCNS-205 之間的接合轉(zhuǎn)移 將整合型質(zhì)粒PSET152和PIB139通過CaClz法導(dǎo)入供體菌PUZ8002中，借助于PUZ8002 上tra基因，上述兩種質(zhì)粒[^接合轉(zhuǎn)移方式從pUZ8002導(dǎo)入到Salinisporaarenlocola CNS-205抱子中，并進(jìn)行整合。
[0032] (3)、接合轉(zhuǎn)移子的驗(yàn)證 W整合型質(zhì)粒PSET152和PIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV為模板，設(shè)計(jì)引 物CP1和CP2W驗(yàn)證陽性接合轉(zhuǎn)移子。
[0033]CP1 :5, -TTTATCACCACCGACTATTTGC-3 ; CP2 :5' -TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。
[0034]提取SalinisporaarenlocolaCNS-205 基因組DNA并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。所用的 PCR條件反應(yīng)程序?yàn)?98°C1min;98°C30s，58°C30s，72°C3〇3,30個循環(huán)；72°(：延伸10 min。
[0035] (4)、質(zhì)粒pSET152 和pIB139 在SalinisporaarenlocolaCNS-205 接合轉(zhuǎn)移子中 的穩(wěn)定性 將接合轉(zhuǎn)移子接種于不含抗生素的SFMS平板上，待其抱子成熟(約15d)后，再次接種 于不含抗生素的SFMS平板上，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次后進(jìn)行分離純化，隨機(jī)挑選單菌落，轉(zhuǎn)接到含有 25μg/mL阿泊拉霉素的SFMS平板上，5d后根據(jù)單菌落能否生長來確定質(zhì)粒PSET152和 pIB139在接合子中的遺傳穩(wěn)定性。
[0036] 結(jié)果表明： (1)、SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株對抗生素的敏感性由表1可知，SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株在含有12.5yg/mL卡那霉素和阿泊拉霉素的培 養(yǎng)基上不能生長，表明SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株對卡那霉素和阿泊拉霉素非 常敏感；SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株在含有25μg/mL氯霉素的培養(yǎng)基上 不能生長，表明SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株對氯霉素比較敏感；Salinispora arenlocolaCNS-205菌株在含有硫鏈絲菌素100μg/mL的培養(yǎng)基上都能生長，說明 SalinisporaarenlocolaCNS-205對硫鏈絲菌素不敏感。鑒于本發(fā)明實(shí)施例中使用的接合 轉(zhuǎn)移整合型質(zhì)粒攜帶有阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV，因此W25μg/mL阿泊拉霉素篩 選接合轉(zhuǎn)移子。
[0037] 表1、SalinisporaarenlocolaCNS-205在四種不同濃度抗生素平板上的生長情 況，其中，大量生長（++);少量生長（+);不生長（-)。
W3引 （2)、通過兩親接合轉(zhuǎn)移法分別將整合型質(zhì)粒PSET152和PIB139從供體菌 pUZ8002導(dǎo)入到SalinisporaarenlocolaCNS-205的新鮮菌絲體和抱子中，結(jié)果表明：在SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株萌發(fā)抱子作為受體菌與含有整合型質(zhì)粒pSET152 和PIB139的PUZ8002菌株進(jìn)行的兩親接合轉(zhuǎn)移，能夠獲得阿泊拉霉素的抗性菌落；而在 SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株新鮮菌絲體作為受體菌與含有整合型質(zhì)粒pSET152 和PIB139的PUZ8002菌株進(jìn)行的兩親接合轉(zhuǎn)移，沒有得到阿泊拉霉素的抗性菌落。
[0039] (3)、為了確定接合轉(zhuǎn)移過程中受體菌（SalinisporaarenlocolaCNS-205抱 子）和供體菌（pUZ8002)接種最佳比例，不同比例的pUZ8002和Salinisporaarenlocola CNS-205抱子進(jìn)行混合涂布平板。結(jié)果見表2表明：當(dāng)大腸桿菌與Salinisporaarenlocola CNS-205抱子的比例達(dá)到8:1時，獲得的接合轉(zhuǎn)移子數(shù)最多。
[0040] 表2、基于鏈霉菌抱子的接合轉(zhuǎn)移平板統(tǒng)計(jì)
(4)、WCP1和CP2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，并W出發(fā)菌株Salinisporaarenlocola CNS-205基因組DM的擴(kuò)增結(jié)果作為陰性對照，整合型質(zhì)粒PSET152和PIB139的擴(kuò)增結(jié) 果作為陽性對照，擴(kuò)增的結(jié)果如圖1所示，所獲得的2株接合轉(zhuǎn)移子都可W擴(kuò)增出預(yù)測 的882bp條帶，分別回收2株接合轉(zhuǎn)移子擴(kuò)增條帶，TA克隆后送測序，測序結(jié)果也證實(shí) 了 2株皆為陽性克隆子。圖1來自PIB139和PSET152接合轉(zhuǎn)移子的PCR驗(yàn)證，圖1中， 1:1化ladder;2:整合型質(zhì)粒pIB139;3:整合型質(zhì)粒pSET152;4:野生型Salinispora arenlocolaCNS-205 ;5 :含有PIB139的接合轉(zhuǎn)移子；6 :含有PSET152的接合轉(zhuǎn)移子。1: 1 kbladder; 2:pIB139plasmid; 3:pSET152plasmid; 4:wild-type; 5:wild-type/ pIB139; 6:wild-type/p沈T152。
[0041] (5)、為了檢測整合型質(zhì)粒pIB139 和p沈T152 在Salinisporaarenlocola CNS-205菌株中的穩(wěn)定性，隨機(jī)挑取驗(yàn)證正確的200個接合轉(zhuǎn)移子，發(fā)現(xiàn)它們在添加有阿泊 拉霉素和無抗生素的SFMS培養(yǎng)基平板上都能生長，沒有發(fā)現(xiàn)阿泊拉霉素抗性消失的菌落。 結(jié)果表明整合型質(zhì)粒PIB139和PSET152在SalinisporaarenlocolaCNS-205菌株中可穩(wěn) 定存在。
[0042]由上述實(shí)施例1可知，通過對SalinisporaarenlocolaCNS-205抗生素敏感性和 基于SalinisporaarenlocolaCNS-205抱子和菌絲體接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的測定，成功地將位點(diǎn) 特異性整合型質(zhì)粒pIB139和pSET152整合到SalinisporaarenlocolaCNS-205染色體中， 在分子水平證明所獲得的接合轉(zhuǎn)移子的正確性，運(yùn)說明建立的海洋放線菌基因遺傳操作系 統(tǒng)是有效可行的，為后續(xù)SalinisporaarenlocolaCNS-205染色體上各基因的功能研究和 生物合成基因的改造奠定了基礎(chǔ)。
[0043] 綜上所述，本發(fā)明提供的一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，通過 建立SalinisporaarenlocolaCNS-205的基因轉(zhuǎn)移體系，通過接合轉(zhuǎn)移向Salinispora arenlocolaCNS-205 導(dǎo)入外源DNA片段。 W44] 應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的應(yīng)用不限于上述的舉例，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可 W根據(jù)上述說明加W改進(jìn)或變換，所有運(yùn)些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保 護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括步驟： A、 將已滅菌的SFMS培養(yǎng)基融化，溫度降至40~50°C，在SFMS培養(yǎng)基中加入適量的抗生 素，倒平板，將SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子懸液涂布平板，25~30°C培養(yǎng)4~5d; B、 將整合型質(zhì)粒通過CaCV法導(dǎo)入供體菌中，借助于供體菌上tra基因，所述整合型質(zhì) 粒以接合轉(zhuǎn)移方式從供體菌導(dǎo)入到步驟A得到的SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子 中進(jìn)行整合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述步驟A中，所述抗生素為阿泊拉霉素。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述步驟B中，所述整合型質(zhì)粒為pSET152和pIB139。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述步驟B中，所述供體菌為pUZ8002。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述步驟B中，供體菌與受體菌SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子的比例為（15~1):1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述步驟B中，供體菌與受體菌SalinisporaarenlocolaCNS-205孢子的比例為8:1。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述步驟B之后包括：以整合型質(zhì)粒pSET152和pIB139上的阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV 為模板，設(shè)計(jì)引物CP1和CP2以驗(yàn)證接合轉(zhuǎn)移子，提取SalinisporaarenlocolaCNS-205 基因組DNA并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述CP1 為 5' -TTTATCACCACCGACTATTTGC-3' ；所述CP2 為 5' -TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所 述卩0?驗(yàn)證的條件反應(yīng)程序?yàn)?8°(：11^11;981€3〇8,581€3〇8,721€3〇8,30個循環(huán)； 72°C延伸 10min。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種海洋放線菌基因遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其包括步驟：將已滅菌的SFMS培養(yǎng)基融化，溫度降至40~50℃，在SFMS培養(yǎng)基中加入適量的抗生素，倒平板，將Salinispora？arenlocola？CNS-205孢子懸液涂布平板，25~30℃培養(yǎng)4~5d；將整合型質(zhì)粒通過CaCl2法導(dǎo)入接合轉(zhuǎn)移供體菌中，借助于供體菌上tra基因，所述整合型質(zhì)粒以接合轉(zhuǎn)移方式從供體菌導(dǎo)入到步驟A得到的Salinispora？arenlocola？CNS-205孢子中進(jìn)行整合。通過上述技術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)了向Salinispora？arenlocola？CNS-205導(dǎo)入外源DNA片段的可能性。
【IPC分類】C12N15/76
【公開號】CN105255936
【申請?zhí)枴緾N201510663567
【發(fā)明人】馬艷玲, 陳婉容, 刑福煒, 李銳
【申請人】佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年10月15日