一種免疫細胞庫的構(gòu)建方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及免疫細胞治療領域，尤其涉及一種免疫細胞庫的構(gòu)建方法。
【背景技術】
[0002] 免疫細胞是指與免疫細胞應答有關的所有細胞，主要包括T細胞、B細胞、自然殺傷 細胞(NK)、單核細胞等。近年來腫瘤和病毒的免疫治療技術已經(jīng)進入到臨床應用，T細胞和 NK細胞過繼免疫療法已列入我國三類醫(yī)療技術目錄，主要是通過自體的免疫細胞經(jīng)體外刺 激擴增培養(yǎng)，回輸?shù)交颊唧w內(nèi)提高免疫力。通過直接或間接方式殺傷腫瘤細胞或病毒浸染 的細胞，達到緩解或治療病癥的目的。同時通過規(guī)模擴增儲存，可實現(xiàn)與應用快速結(jié)合，提 升應用效果。
[0003] NK細胞(natural killer cell，自然殺傷細胞)是與T、B細胞并列的第三類群淋巴 細胞。NK細胞數(shù)量較少，在外周血、胎盤約占淋巴細胞總數(shù)的3-15%，在脾內(nèi)約有3%~4%。 NK細胞作用機理(英國帝國理工學院）：自然殺傷細胞表面有許多受體感應器，這些受體分 為"激活"和"抑制"兩種。當它在人體內(nèi)捕獲1個可疑細胞后，2種受體將傳回不同的信號，如 果是病變細胞，"激活"信號大大增強，免疫細胞的"殺手本能"將被激活，從而殺死病變細 胞;反之，如果捕獲的是一個健康細胞，"抑制"信號將占主導地位，該細胞將會被釋放。目 前，主要是腫瘤細胞、病毒感染細胞、較大的病原體(如真菌和寄生蟲）、同種異體移植的器 官、組織等。
[0004] NK細胞過繼免疫治療主要是取自患者自己或半相合供體，由于其不存在體細胞免 疫抗原，自體及異體應用高安全性得到了國內(nèi)外專家廣泛認可，國外NK細胞治療小兒白血 病已進入臨床III期實驗?？鼓[瘤、抗病毒藥物研發(fā)已進入IND階段。目前腫瘤治療患者年齡 不斷提前，患者免疫系統(tǒng)機能已經(jīng)遭受破壞，通過多種途徑規(guī)模制備自體或異體自然殺傷 細胞，長期存儲，不僅是我國三類醫(yī)療技術對NK細胞應用控制和預防醫(yī)療模式的快速結(jié)合， 也為NK細胞作為抗腫瘤藥物研究和細胞藥物制備和臨床應用準備了必備條件。所以通過NK 細胞存儲與不同供體資源結(jié)合，可逐步提升免疫細胞預防醫(yī)療應用水平，也能為患者臨床 應用提供創(chuàng)新方法，為免疫細胞藥物開發(fā)提供了新的方式，所以通過不同時期供體應用資 源的NK細胞擴增存儲，提升我國免疫細胞存儲應用能力，提升我國免疫細胞應用水平具有 非常大的意義。
[0005] 為了有效存儲和使用組織和供體資源，目前在世界范圍內(nèi)已經(jīng)有多種細胞庫和組 織庫建立，比如臍帶造血肝細胞庫、間充質(zhì)干細胞庫等細胞庫。所謂細胞庫是在_196°C液氮 中存儲細胞及搜集相關資料的場所。免疫細胞庫不僅可提高現(xiàn)有建庫資源的新應用，避免 資源浪費，也能為以新藥開發(fā)為需求的資源專屬體系提供技術和應用保障。
[0006] 目前，要凍存免疫細胞，通常是直接凍存單個核細胞。由于人單核細胞成分復雜， 既有免疫細胞也有非免疫細胞，是多種類型細胞組合，導致凍存后的單個核細胞復蘇后活 率不理想，不適合臨床應用。對于免疫細胞尤其是NK細胞的長期凍存及凍存治療控制并無 相關報道。
[0007] CN102758259A公開了一種人外周血免疫細胞庫的構(gòu)建方法，其采集人外周血，分 離自體血漿，分離外周血單個核細胞，由外周血單個核細胞分離單核細胞并凍存，由外周血 單個核細胞分離T淋巴細胞并凍存，由外周血單個核細胞分離B淋巴細胞并凍存，由外周血 單個核細胞分離NK細胞并凍存，編碼入庫。盡管該方法是采用將免疫細胞分離出并分別單 獨凍存，編碼入庫，然而，這些免疫細胞進行凍存后，其活性大大降低，當再次將這些免疫細 胞進行復蘇時，細胞的存活率大大下降，無法實現(xiàn)長期儲存和即時應用，更不能作為種子細 胞循環(huán)擴增使用。
[0008] 因此，尋找一種能夠長期儲存、并且保持免疫細胞復蘇后高存活率即時應用，同時 可以以庫存細胞為種子高效擴增循環(huán)應用的細胞庫構(gòu)建方法是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種免疫細胞庫的構(gòu)建方法，特別是一種利用人外周血、胎盤組織 血、胎盤組織以及臍帶血等供體資源制備的適合臨床應用免疫細胞庫的構(gòu)建方法。
[0010] 為達到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0011] 本發(fā)明提供了 一種免疫細胞庫的構(gòu)建方法，其包括：
[0012] (1)從供體資源分離單個核細胞;任選地，凍存單個核細胞；
[0013] ⑵擴增培養(yǎng)，獲得免疫細胞；
[0014] (3)將免疫細胞凍存，編碼入庫。
[0015] 本發(fā)明在構(gòu)建免疫細胞庫的過程中，不僅對單個核細胞進行了凍存，最重要的是 對分離得到的單個核細胞或凍存后的單個核細胞進行了擴增培養(yǎng)，采用該步驟后，使得免 疫細胞的擴增倍數(shù)達到10000倍以上，保持了免疫細胞的高活性，當采用該免疫細胞用于凍 存復蘇時，復蘇后的免疫細胞存活率達到85%以上，存儲時間可達15-20年。
[0016] 本發(fā)明中，步驟（1)所述供體資源為臍帶血、外周血、胎盤組織血或胎盤組織中的 任意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選但不限于此。
[0017]優(yōu)選地，所述分離包括:采用臍帶血、外周血或胎盤組織血分離自體血漿，分離得 到單個核細胞，或者采用胎盤組織分離單個核細胞。
[0018] 優(yōu)選地，所述臍帶血、外周血或胎盤組織血分離自體血漿包括:將采集的臍帶血、 外周血或胎盤組織血離心，取上清液滅活，獲得用于凍存和培養(yǎng)用自體血漿，其具體步驟 為:將采集的臍帶血、外周血或胎盤組織血放入50mL離心管，以600-900G離心力離心10-20 分鐘，取上清液40-56°C滅活30-40分鐘，獲得可用于凍存和培養(yǎng)用血漿，可于-20°C存儲或4 °C暫存。
[0019] 本發(fā)明中，所述臍帶血、外周血或胎盤組織血分離單個核細胞的具體步驟為:將采 集的臍帶血、外周血或胎盤組織血離心，將去除自體血漿后的沉淀物按體積量用生理鹽水 或PBS稀釋0.5-1倍，混勻后，加入到與淋巴細胞分離液中，400-900G離心15-60分鐘，離心 后，取中間層細胞即得到單個核細胞。
[0020] 優(yōu)選地，所述胎盤組織分離單個核細胞包括:胎盤組織搗碎后，經(jīng)酶消化，過濾，加 入淋巴細胞分離液，離心后，取中間層細胞即得到胎盤組織單個核細胞，其具體步驟為:胎 盤組織搗碎后，絞碎處理組織直徑小于0 . lcm，經(jīng)0.125-0.25M胰蛋白酶37°C，消化25-6〇min，再經(jīng)過濾，加入2:1-1:1淋巴細胞分離液上，400-600g離心15-60分鐘，離心后，取中 間層細胞即得到胎盤組織單個核細胞。
[0021]本發(fā)明中，步驟（1)所述凍存單個核細胞包括:將單個核細胞與凍存液混合并液氮 保存。
[0022] 優(yōu)選地，所述單個核細胞的密度為0.1-1.5X108/mL，例如可以是：0.1 X108/mL、 0 · 3 X 108/mL、0 · 5 X 108/mL、0 · 8 X 108/mL、1 X 108/mL、1 · 1 X 108/mL、1 · 2 X 108/mL、1 · 3 X 108/ mL、1 · 4 X 108/mL、1 · 5 X 108/mL，優(yōu)選為1 X 108/mL。
[0023] 優(yōu)選地，所述凍存液按體積百分含量包括：10-90 %的胎牛血清或自體血漿；ΙΟ-ΘΟ% 的基礎培養(yǎng)基； 進一步優(yōu)選地 ，所述基礎培養(yǎng)基為 RPMI-1640 或淋巴細胞無血清培養(yǎng) 基，其中凍存液各組分的體積百分含量之和為100%，所述胎牛血清或自體血漿的含量可以 是 ：10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，所述基礎培養(yǎng)基的含量可以是： 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%〇
[0024] 本發(fā)明中，步驟(2)所述擴增培養(yǎng)包括:將單個核細胞進行接種并加入培養(yǎng)液進行 培養(yǎng)。
[0025] 優(yōu)選地，所述單個核細胞的密度為0.5-2.5 X 106/mL，例如可以是0.5 X 106/mL、0.8 X 106/mL、1 X 106/mL、1 · 2 X 106/mL、1 · 5 X 106/mL、1 · 8 X 106/mL、2 X 106/mL、2 · 5 X 106/mL，優(yōu) 選為2X106/mL。
[0026]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液按體積百分含量包括：1 % -15 %的自體血清或胎牛血清;85-99 %的淋巴細胞無血清培養(yǎng)液或RPMI-1640培養(yǎng)液;200-500U/mL的重組人IL-2，各組分含 量之和為100%。
[0027] 優(yōu)選地，所述免疫細胞為T細胞、NK細胞或NKT細胞中的任意一種或至少兩種的組 合。
[0028]本發(fā)明中，步驟(3)所述免疫細胞凍存包括:將免疫細胞與凍存液混合。
[0029]優(yōu)選地，所述凍存液按體積百分含量包括:5-10 %的二甲基亞砜；10-90 %的自體 血清或胎牛血清;0-5%的人血白蛋白和5-75%的基礎培養(yǎng)液，各組分含量之和為100%。
[0030] 優(yōu)選地，所述基礎培養(yǎng)液為淋巴細胞無血清培養(yǎng)液或RPMI-1640培養(yǎng)液。
[0031] 優(yōu)選地，所述免疫細胞的密度為2-10X107個/mL，例如可以是2X10 7個/mL、3X107 個/mL、4X 107個/mL、5 X 107個/mL、6X 107個/mL、7 X 107個/mL、8X 107