專(zhuān)利名稱(chēng)：一種染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及染色題步移文庫(kù)的構(gòu)建方 法，本發(fā)明還涉及用于構(gòu)建文庫(kù)的接頭分子設(shè)計(jì)方法。
背景技術(shù)：
目前，構(gòu)建染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建都是利用能產(chǎn)生平末端的DNA內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn)行酶切，然后酶切產(chǎn)物直接與接頭進(jìn)行連接 而成。但是能產(chǎn)生平末端的DNA內(nèi)切酶相對(duì)于能產(chǎn)生粘性末端的 DNA內(nèi)切酶來(lái)說(shuō)，種類(lèi)較少，而且價(jià)格普遍較高，大大限制了構(gòu)建 染色體步移文庫(kù)的種類(lèi)、增加了文庫(kù)構(gòu)建的成本。另外，構(gòu)建染色體 步移文庫(kù)所需要的接頭，在設(shè)計(jì)上難以保證染色體步移PCR朝著預(yù) 計(jì)的方向進(jìn)行或者容易出現(xiàn)非特異性條帶，嚴(yán)重降低了染色體步移 PCR的擴(kuò)增效率和PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。發(fā)明內(nèi)容針對(duì)上述不足，本發(fā)明提供了一種染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建方法及 其接頭分子設(shè)計(jì)。利用本方法可以選擇任何DNA內(nèi)切酶對(duì)基因組進(jìn) 行酶切，包括能產(chǎn)生平末端的DNA內(nèi)切酶、平末端DNA內(nèi)切酶與 粘性末端DNA內(nèi)切酶的組合以及不同粘性末端DNA內(nèi)切酶的組合 等，酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)處理可直接與接頭連接，大大增加了構(gòu)建文庫(kù)的種 類(lèi)、降低了構(gòu)建文庫(kù)的成本；利用DNA合成的原理，通過(guò)對(duì)接頭末 端核苷酸的分子設(shè)計(jì)則使染色體步移PCR按照預(yù)期的方向進(jìn)行，能 有效提高染色體步移PCR的擴(kuò)增效率和PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是釆用粘性末端內(nèi)切酶對(duì)基 因組DNA進(jìn)行消化，然后，通過(guò)單鏈核酸外切酶將突出的單鏈消化， 從而將粘性末端轉(zhuǎn)化成平末端。然后可按照常規(guī)的方法構(gòu)建文庫(kù)。然而，本發(fā)明方法并不僅局限于使用粘性末端內(nèi)切酶消化基因組DNA, 可以將平末端DNA內(nèi)切酶與粘性末端DNA內(nèi)切酶相組合，并按照 上述方法構(gòu)建文庫(kù)。因此，本發(fā)明的方案是至少使用一種粘性末端限 制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA，并用單鏈外切酶將突出的單鏈消化， 并構(gòu)建文庫(kù)。在染色體步移構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，對(duì)基因組DNA的酶切，如果選用的 是產(chǎn)生粘性末端的內(nèi)切酶，可利用具有單鏈DNA外切酶功能的酶制 劑對(duì)其進(jìn)行消化，使其產(chǎn)生平末端的基因組DNA片段。5'突出端的 酶切產(chǎn)物釆用具有5，-3'單鏈DNA外切酶進(jìn)行消化，如枯草芽孢桿菌 核酸外切酶、核酸外切酶VII(五xo/0、粗糙脈孢菌核酸外切酶等。 3'突出端的酶切產(chǎn)物采用具有3'-5'單鏈DNA外切酶進(jìn)行消化，如核 酸外切酶I (E.co//) DNA聚合I (Aco//)核酸外切酶III (Eco//) 及pfUDNA聚合酶等。此外，為防止非特異條帶的出現(xiàn)、控制染色體步移PCR的方向， 本發(fā)明還提供了一種接頭序列，其是由一條由50個(gè)堿基左右(如 40-60bp，優(yōu)選50bp)的長(zhǎng)鏈和一條10個(gè)堿基左右(如8-15bp，優(yōu) 選10bp)的短鏈退火形成，其中短鏈序列與長(zhǎng)鏈的3'端序列完全互 補(bǔ)，使接頭端的PCR引物只能以基因特異引物擴(kuò)增的條帶為模板， 提高PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性；為防止接頭短鏈以長(zhǎng)鏈為模板合成長(zhǎng) 鏈的互補(bǔ)連，需要對(duì)短鏈3，端最后一個(gè)堿基進(jìn)行分子設(shè)計(jì)，使其核 糖中的第三個(gè)碳原子上的羥基進(jìn)行脫氧或者轉(zhuǎn)換為一個(gè)甲基或者磷 酸化，以阻止DNA聚合酶以接頭短鏈為引物進(jìn)行延伸。應(yīng)用本發(fā)明方法，可任意選擇DNA內(nèi)切酶構(gòu)建染色體步移文庫(kù)， 擴(kuò)大了文庫(kù)的種類(lèi)，使獲得染色體步移實(shí)驗(yàn)結(jié)果的效率大大提高，同 時(shí)降低了文庫(kù)構(gòu)建的成本；對(duì)接頭進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)，可保證染色體步 移PCR只能以基因特異引物擴(kuò)增的條帶為模板，有效抑制非特異條 帶的出現(xiàn)。


圖1是常用的平末端DNA內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA酶切結(jié)果的示 意圖；圖2是5'端突出DNA內(nèi)切酶酶切結(jié)果示意圖；圖3是3'端突出DNA內(nèi)切酶酶切結(jié)果示意圖；圖4是平末端和3'端突出DNA內(nèi)切酶酶切結(jié)果示意圖；圖5是平末端和5'端突出DNA內(nèi)切酶酶切結(jié)果示意圖；圖6是圖2、 3、 4、 5實(shí)驗(yàn)結(jié)果被相應(yīng)的具有單鏈DNA外切酶消平后的結(jié)果示意圖；圖7是3'末端堿基甲基化的接頭分子序列圖，其中CH3N表示任意核苷酸(CH3A、 CH3T、 CH3G、 CH3C)中，核糖的第三個(gè)碳原子上的羥基轉(zhuǎn)換為甲基；圖8是3'末端堿基雙脫氧化的接頭分子序列圖，其中ddN表示任意的雙脫氧核糖核苷酸UdA、 ddT、 ddG、 ddC);圖9是3'末端堿基磷酸化的接頭分子序列圖，其中H2P03N表示任意的磷酸化脫氧核糖核苷酸(H2P03A、 H2P03T、 H2P03G、 H2P03C )。 圖10 12為腺嘌呤甲基化、雙脫氧化和磷酸化結(jié)構(gòu)式； 圖13-15為鳥(niǎo)嘌呤甲基化、雙脫氧化和磷酸化結(jié)構(gòu)式； 圖16 18為胞嘧啶甲基化、雙脫氧化和磷酸化結(jié)構(gòu)式； 圖19~21為胸腺嗜甲基化、雙脫氧化和磷酸化結(jié)構(gòu)式； 圖22為實(shí)施例1染色體步移反應(yīng)中的起始PCR結(jié)果，其中，1 8泳道依次為五coR I 、 //z"(iin、 5am//1 、力a I 、 I 、 I 、戶(hù)vwll 、^/ fl I 8種內(nèi)切酶構(gòu)建的染色體步移文庫(kù)下游PCR結(jié)果，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖23為實(shí)施例1染色體步移反應(yīng)中的二次PCR結(jié)果，其中，1~8 泳道依次為上述8種起始PCR反應(yīng)液按1: 50比例稀釋后做為模板 的二次PCR結(jié)果，M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限 制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條 件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。利用任意DNA內(nèi)切酶對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物可能 是如圖1、 2、 3、 4、 5所示的5種結(jié)果。酶切產(chǎn)物1 (如圖1)可直 接與接頭進(jìn)行連接；酶切產(chǎn)物2和5(如圖2、 5)需要利用具有5，-3， 單鏈DNA外切酶功能的酶制劑，如枯草芽孢桿菌核酸外切酶、核酸 外切酶VII(￡.co/0、粗糙脈孢菌核酸外切酶，對(duì)5'突出端進(jìn)行消平； 酶切產(chǎn)物3、 4(如圖3、 4)需要利用具有3，-5，單鏈DNA外切酶功 能的酶制劑，如核酸外切酶1(五.co//)、 DNA聚合I (Eco//)、核酸 外切酶III 及pfUDNA聚合酶等，對(duì)3'突出端消平。消平產(chǎn)物可直接與接頭進(jìn)行連接也可以對(duì)消平后的DNA片段進(jìn)行回收，然 后利用DNA連接酶與接頭連接。連接所采用的接頭要具備圖7和圖8所示的分子特征由一條 50個(gè)左右堿基的長(zhǎng)鏈和一條IO個(gè)堿基左右的短鏈組成，短鏈中除3， 端最后一個(gè)堿基外，其它序列要與長(zhǎng)鏈的3'端序列完全互補(bǔ)，短鏈3， 末端最后一個(gè)堿基中的第三個(gè)碳原子被甲基化替換或脫氧或磷酸化。實(shí)施例l染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建本例以輻射松為基因組DNA，構(gòu)建以擴(kuò)展蛋白基因(expansin gene，登陸號(hào)EU301698,本發(fā)明人利用此方法獲得的基因)為目的基 因的Eco及I 、 /^"c in、 5am//1 、 I 、 5Vw I 、 I 、尸v" II 、 /f/ a I 8 種內(nèi)切酶的染色體步移文庫(kù)。 基因組DNA提取(CTAB法)1)稱(chēng)取2g植物幼嫩新鮮材料，置于預(yù)冷的研缽中，加入1/10 植物材料體積的PVPP，倒入液氮，快速將植物材料研磨成細(xì)粉末。2 )在液氮未完全揮發(fā)之前，用小匙將細(xì)粉末裝入2ml離心管中，加入600W預(yù)熱至65'C的2xCTAB提取液，再加入1 %的|3-巰基乙 醇，蓋緊蓋反復(fù)顛倒混勻，置65X:的水浴中保溫20min,期間不時(shí)搖 動(dòng)。3) 取出離心管，冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(24: 1)，輕輕反復(fù)顛倒離心管混勾。室溫下，10000r/min,離心10min。4) 仔細(xì)吸取上清液，轉(zhuǎn)入一新離心管中，加入等體積的氯仿/異 戊醇(24: 1),充分混勻后，室溫下10000r/min,離心10min，再抽 提一次。5) 取上清液轉(zhuǎn)入另一新離心管中，加入等體積的CTAB沉淀緩 沖液，輕輕混勻，室溫下沉淀30min,時(shí)間越長(zhǎng)DNA沉淀越好。6) 10000r/min,離心10min，棄掉上清液。加入100^1 TE緩沖液，溶液沉淀。7) 加入2倍體積的無(wú)水乙醇(-2(TC預(yù)冷)，混勻，-20。C條件下 放置15min或更長(zhǎng)時(shí)間。10000r/min，離心10min，棄掉上清液。8) 加入70%的乙醇400|il,混勾，放置5min。 10000r/min，離 心10min，棄掉上清液。沉淀自然吹干。9) 加入50pl的無(wú)菌水或TE溶液，溶解沉淀，-20°。冰箱中貯存基因組DNA酶切以Eco及l(fā)DNA內(nèi)切酶為例，其它內(nèi)切酶步驟相同，對(duì)胡枝子基因組DNA進(jìn)程酶切，酶切體系如下ddH20 57plbuffer(H) 10plDNA 25jul￡coi I 8jil 共lOOjil溶液混合后，輕輕震蕩，低速離心，將溶液37'C過(guò)夜，回收酶切 粘性末端消平其中&wl 、 、 PvmII、 //pal4中內(nèi)切酶產(chǎn)物可直接產(chǎn)生平末 端，無(wú)需消平。而五coRl 、 i7/"dl1、 Bam/H 、 vKal4中內(nèi)切酶酶切 產(chǎn)物，產(chǎn)生3'突出的粘性末端DNA片段，構(gòu)建染色體步移文庫(kù)時(shí)需要 對(duì)粘性末端進(jìn)行消平，pfii DNA聚合酶具有3'-5，外切酶活性。以 五co/UDNA內(nèi)切酶產(chǎn)物為例，其它內(nèi)切酶產(chǎn)物的消平步驟相同，反應(yīng)體系如下pfU 10xbuffer 1^1 dNTP lpl pfu(2.5U/|ul)酶切DNA(^6ng/nl) 8ml 共ll|il混勾溶液，72"C水洛30分鐘，4'C過(guò)夜。 接頭連接釆用的長(zhǎng)鏈和斷鏈的序列分別為長(zhǎng)鏈5'-ACCGGTTATC ACATGGAGGC GAATTCGAGC TCGGATCCGC CCGGGCTAAG-3 ， 短鏈3，-(CH3C)GCCCGATTC-5，其中短鏈末端胞嘧嚏堿基甲基化。以上序列合成后，分別稀釋至20(amol/L,等量混合，在PCR儀中 形成雙鏈DNA。反應(yīng)條件，94"C預(yù)熱1分鐘，6(TC退火30秒。然后與 上述8種消平的DNA片段連接，構(gòu)建8個(gè)染色體步移文庫(kù)。單個(gè)連接 體系如下-.DNA消平液 4^1 接頭 1.9^x1 10x連接酶Buffer T4DNA連接酶 0.5pl 共8|al反應(yīng)條件，16t:水洛過(guò)夜，70'C5分鐘停止連接反應(yīng)，加入72(ilTE 混勻溶液，離心備用。 染色體步移反應(yīng)染色體步移PCR中的起始PCR是以API ( SEQ ID NO: 2 )和 GSP1 ( SEQ ID NO: 3)為引物，以構(gòu)建的染色體步移文庫(kù)為模板， 反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液稀釋50倍并作為二次PCR的模板并以AP2 (SEQ ID NO: 4 )和GSP2 ( SEQ ID NO: 5)為引物進(jìn)行PCR。染 色體步移PCR條件94。C變性lminl個(gè)循環(huán)，94。C變性30sec， 68°C 復(fù)性30sec, 72。C延伸2.5min，啟始PCR為39個(gè)循環(huán)，二次PCR為 25個(gè)循環(huán)，72。C延伸10min, 4。C結(jié)東反應(yīng)。將二次PCR結(jié)果進(jìn)行回 收、測(cè)序、比對(duì)，確定是否目的片段。結(jié)果表明在起始PCR中， 每個(gè)文庫(kù)的擴(kuò)增結(jié)果都有條帶，但比較模糊；二次PCR中，所有文 庫(kù)的擴(kuò)增結(jié)果條帶比較清楚，其中第7泳道條帶最長(zhǎng)，選擇第7泳道 條帶切膠回收、連接T載體、測(cè)序后(測(cè)序結(jié)果如SEQIDNO: l所 示)在Gene Bank中BLAST,與其它樹(shù)種中的expansin基因有很高 的同源性，說(shuō)明染色體步移成功，如果還不是基因的完整序列，可以 獲得的基因序列為模板重新設(shè)計(jì)步移引物，利用相同的文庫(kù)進(jìn)行另一 輪的染色體步移，選擇最長(zhǎng)擴(kuò)增片段測(cè)序、分析，直到獲得基因的全 長(zhǎng)，在Gene Bank中登錄。染色體步移的結(jié)果如圖。綜上所述，釆用本染色體步移文庫(kù)構(gòu)建方法具有如下優(yōu)點(diǎn)1、 可選擇的用于構(gòu)建文庫(kù)的內(nèi)切酶的范圍大大增加，提高了染 色體步移PCR擴(kuò)增效率；2、 由于可選擇的內(nèi)切酶的范圍增加，可釆用普通的內(nèi)切酶構(gòu)建 文庫(kù)，成本大大降低；3、 接頭序列是一條由40-60個(gè)堿基左右的長(zhǎng)鏈和一條8-15個(gè)堿 基左右的短鏈退火形成，其中短鏈序列與長(zhǎng)鏈的3，端序列完全互補(bǔ)， 使接頭端的PCR引物只能以基因特異引物擴(kuò)增的條帶為模板，能夠 大大提高PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。200810100936.6說(shuō)明書(shū)第8/ll頁(yè)序列表<110>北京林業(yè)大學(xué)<120> —種染色體步移文庫(kù)的構(gòu)建方法<130〉<160> 5〈170〉 Patentln version 3. 3〈210> 1 〈211〉 2526 〈212〉 DNA<213> 輻射松(Pinus radiata) 〈400〉 1tctg犯tagt gggcggctga tt犯cgg犯c taaatttctg cttttctttt gctattttaa 60 tgattttatt ttcgagggag geiggaaaccc taacccatgg tccatgctgt tggaattatc 120 aggcggacgg atagatgggg atctgttatc gagetaagcaeL gaaELacaaaeL gatttttaaa 180t肌3gtt肪3 ggt犯犯3犯犯t犯3犯t3 33gggggg3g 3Ctg犯ggCC Cg33g3g3tg 240ctgct卿tg acggtggccg ggtgggggtg gtttcgttcg Uattgttcg ttgagtgtga 300acgtggtgtt gcgcatttag tggttgatgt gatgttttga cggtgacttc acgtggg犯c 細(xì)gtcgcgaggg gccttgaaga gt犯gga犯g gattttgttt taactttgtt tattaaccga 420aggtggagaa肌tttagatt aggagagagt ttagattagt attaatcctg actattagga 4:80gatttaagtg aaccgagtta cgggaattga ttgtccttca tgtcctcgga cgtttaattt 540gttttcttta ttgggtgttt ttcggttttg caatccctat gtgggact3g gattgccggg 600taatttgatx ataattctaa ggttagtgtt tt犯tcggtc atggattcca cttattggga 660atcatcgtca tcaatgctga gttttttttg cataagtagt ggtcgatgtt cgccagtttc 720gccagtctca ttgtcgtatc ctatctccct ctgtgcattt tgctctgctc ccaggaagga 780tctcggttcc cttccctcag tactctgctc tgccttctga gattgtgtga gtagcaggag 840ggccacaagc caattctgtt ttaatgttgg tttggtttga tttggttcag ttcagtttgg 900tctagatctg tcttgtttct gtggatggg3 agcagaatat ttgcagca/tt tccctttgtt attcttga犯tgcgggttgt ttacccttga gggaatggga attccagtgc attttccgac tctggtgtat gggcgaatcc cgggtgttta aactttctac ggtgg肌gcg atgcctcggg atgtgtgtaa atggacattg cagtctatgg tgttgtttct gtggcgcagg gggtgcUgt ggagttc肌t ccgcagcatt gagcacagct tgctttgaga tcaaatgtgc gaatgaccca ttggtcactg gcaccaattt ctaccctccc tggtgcaatc cttgtcgccc ccatttgtga ttcttgaatt atttttggct tttgtaattg taaattttat ttgttagaac taatcactct 肌gatgaaga tscca犯ctt gga^t犯gatt tagtttgttg aagcagc犯t agatggaaaa agactcat3g tatatgtcac atacatcsgt ttgtaaagta tgtgcctggt aactccaaaa atgtgtatcc ccatacagtt catggtaata t城ggtaag ctag犯acca cctgtaagag gtttagggtt agccgcg犯a acccacggcc tggc鄉(xiāng)ttt gtagccaaga gtggttggag ggttgcgttg agccttcacg actgagttta t犯aacccag agtatggtta tgggtaatcc tttacaggta taggtataga tgtgttgtta acgtcataca agactggcgg ttgc犯tggt tcctttatat ggacatcaac atattcttttcggacaggca C3tcct3cat taatg犯cag 960atggtttgtt atgggggtat tcttc犯tgc 1020ctgactggtt ctttcttttt gcagaacgat 1080cgttttgttg ctgtttatcg ttagagcttg 1140tcagcctggg ccttggaatg aagcacatgc 1200caccatgggt tagtgaaatt agttactgcg 1260ggctccgttt ctagatctaa ctgagctttt 1320gggtatggca acctgtacag ccagggatat 1380ctgttcaaca gcgggct卿ctgtggagcc 1440gaatggtgtc acctgggtaa cccttcgatt 1500aactatgttt tgcctaatgg caatggtggt 1560attagtgtat gcttggtgaa atttattgtt 1620aaacatgttg agcttgatca acttaacatg 1680aacaattgtg aattaaagtt ggaaagattc 1740ttagaagaag ttgattgtgg cagtgtatat 1800acaagctaaa atattgtgtt gaaataaagc 1860aag犯3gtct agg3tgtttt gtagtggtcg 1920gttgtagatg tgttttcagc cttgtaagtc 1980taaaaactac tttgtatttg tEtgttttcat 2040tgaagtagga tagagattcc tcttggcatg 2100tagttgagtc gggtctgtgg agtgccttag 2160tgctctagtg taaaggctgt ggcccagagt 2220gccUggtgg catggttgag ggtgatccga 2280gata犯accc atgatgatat tagaggggga 2340taatggttga aagaacgatg tatgtgaagg 2400tagtacccat gcattccggt ggatggttgc 2460gttatgtttc aacacaacta gattttgcag 2520attgat 2526<210> 2〈211〉 25〈212〉 DNA <213>人工序列〈400> 2ggttatcaca tggaggcgaa ttcga 25〈210> 3<211〉 25<212> DNA <213>人工序列〈400〉 3atccttgtcg cccccatttg tgaat 25〈210> 4〈211〉 25〈212> DNA 〈213〉人工序列<400> 4gaattcgagc tcggatccgc ccggg 25<210> 5<211〉 25 〈212〉 DNA <213>人工序列<400> 5ttattgtttt cttgaattat ttttg
權(quán)利要求
1、一種構(gòu)建染色體步移文庫(kù)的方法，其特征在于，包括如下步驟采用至少一種粘性末端限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA或其片段，得到粘性末端DNA片段；用單鏈核酸外切酶處理粘性末端DNA片段，使其成為平末端DNA片段；與接頭分子連接，得到染色體步移文庫(kù)。
2、 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的接頭分子為 一長(zhǎng)鏈和一短鏈構(gòu)成的不完全雙鏈，其中短鏈與長(zhǎng)鏈的3'端完全互 補(bǔ)。
3、 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在所述短鏈3，末端 最后一個(gè)堿基中，核糖的第三個(gè)碳原子上的羥基被甲基替換或脫氧或 磷酸化。
4、 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述長(zhǎng)鏈為40-60 bp, 所述短鏈為8-15 bp。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的長(zhǎng)鏈為50bp, 所述短鏈為10bp。
6、 如權(quán)利要求1 5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的單 鏈核酸外切酶選自1) 5'-3，單鏈DNA外切酶枯草芽孢桿菌核酸外切酶、核酸外 切酶VII、粗糙脈孢菌核酸外切酶；2) 3，-5，單鏈DNA外切酶核酸外切酶I、 DNA聚合I、核酸 外切酶III及pfU DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種染色體步移文庫(kù)構(gòu)建方法，其包括采用至少一種粘性末端限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA，得到粘性末端DNA片段，用單鏈核酸外切酶處理粘性末端DNA片段，使其成為平末端DNA片段，與接頭分子連接，得到染色體步移文庫(kù)。本發(fā)明的方法大大增加了構(gòu)建文庫(kù)的種類(lèi)、降低了構(gòu)建文庫(kù)的成本，有效提高了染色體步移PCR的擴(kuò)增效率和染色體步移結(jié)果的準(zhǔn)確性。
文檔編號(hào)C40B50/06GK101230490SQ20081010093
公開(kāi)日2008年7月30日 申請(qǐng)日期2008年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月26日
發(fā)明者偉 李, 慧 李, 陳曉陽(yáng) 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)