一種結(jié)縷草的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種結(jié)縷草的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞后，植物基因工程得到迅速發(fā)展。將外源DNA導(dǎo)入植物成功與否與植物種類(lèi)與基因?qū)爰夹g(shù)等有關(guān)系。結(jié)縷草的遺傳轉(zhuǎn)化方法可分為原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和不依賴(lài)于原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。
[0003]由于原生質(zhì)體培養(yǎng)操作復(fù)雜，且常常難以再生植株，該途徑后來(lái)逐漸被人們放棄。不依賴(lài)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化法主要有基因槍轉(zhuǎn)化法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。
[0004]然而，目前對(duì)于結(jié)縷草的轉(zhuǎn)化，仍存在操作復(fù)雜、需進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題。如利用懸浮細(xì)胞作為受體時(shí)，需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間和專(zhuān)業(yè)的培養(yǎng)，且轉(zhuǎn)化率并不盡人意；利用胚性愈傷組織作為外植體時(shí)，需要長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)和對(duì)愈傷組織的選別工作，整個(gè)轉(zhuǎn)基因過(guò)程長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月以上。
[0005]結(jié)縷草雖然因其具有耐踐踏和耐干旱等優(yōu)點(diǎn)，但也有不耐溫、不耐寒等缺點(diǎn)，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)良品種的選育工作是本領(lǐng)域的研究重點(diǎn)之一，而上述結(jié)縷草轉(zhuǎn)基因工作所面臨的問(wèn)題極大的限制了本領(lǐng)域工作的深入開(kāi)展。
[0006]因此，亟需尋找一種操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化率高且耗時(shí)較短的結(jié)縷草的轉(zhuǎn)基因方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種高效對(duì)結(jié)縷草進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法，該方法不僅操作簡(jiǎn)便、轉(zhuǎn)化率高，更重要的是所需時(shí)間非常短，該方法包括如下步驟:
O從結(jié)縷草成熟種子中剪切出成熟胚，將胚置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-7天；
2)對(duì)含有外源質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行活化，利用液體愈傷繼代培養(yǎng)基對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行懸浮，得到農(nóng)桿菌懸浮液；
3)將步驟I)培養(yǎng)所得植物組織置于步驟2)所準(zhǔn)備的農(nóng)桿菌懸浮液中，真空干燥器處理30分鐘后，緩慢振蕩培養(yǎng)I小時(shí)；
4)取出植物組織，置于含有乙酰丁香酮的固體愈傷繼代培養(yǎng)基中避光共培養(yǎng)至少3天；所述乙酰丁香酮的濃度為20mg L 1O
[0008]發(fā)明人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)結(jié)縷草的成熟胚進(jìn)行3-7天的預(yù)培養(yǎng)后，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)結(jié)縷草進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，可以獲得較好的轉(zhuǎn)化效率。如本發(fā)明的實(shí)施例所示，利用GUS活性檢測(cè)法對(duì)轉(zhuǎn)化效率時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅需對(duì)結(jié)縷草成熟胚預(yù)培養(yǎng)3天，便可成功的利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化。整個(gè)轉(zhuǎn)基因過(guò)程總共僅需不足10天，相較于現(xiàn)有技術(shù)長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月的轉(zhuǎn)基因過(guò)程而言，大幅提高了研究效率，極大促進(jìn)了結(jié)縷草優(yōu)良品種選育工作的開(kāi)展。
[0009]在植物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域當(dāng)中，植物的種類(lèi)和轉(zhuǎn)基因方法對(duì)轉(zhuǎn)基因的成功與否和效率高低起著決定性的作用。然而，至目前為止，對(duì)何種植物適合何種轉(zhuǎn)基因方法，仍未形成共識(shí)。特別的，在轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，采取植物中的哪個(gè)部分作為外植體并進(jìn)行何種處理可以獲得高效的轉(zhuǎn)化效果，更是沒(méi)有定論。如《植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進(jìn)展存在問(wèn)題及突破方向》(董福雙，河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，15(3): 57-65)所記載，利用不同轉(zhuǎn)化方法對(duì)不同作物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，轉(zhuǎn)化率的差異十分巨大，轉(zhuǎn)化率可低至小于0.5%，且可重復(fù)性差。
[0010]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)，將預(yù)培養(yǎng)3天以上的成熟胚作為外植體時(shí)，不但可以成功對(duì)結(jié)縷草進(jìn)行轉(zhuǎn)化，更重要的時(shí)本發(fā)明大幅減少了整個(gè)轉(zhuǎn)基因過(guò)程所耗費(fèi)的時(shí)間。本領(lǐng)域人員可以理解的是，本發(fā)明極大的促進(jìn)了結(jié)縷草其它相關(guān)研究的開(kāi)展，尤其是促進(jìn)了結(jié)縷草優(yōu)良品種的選育工作。
[0011]本領(lǐng)域人員應(yīng)當(dāng)知曉，除大幅縮短轉(zhuǎn)基因所需時(shí)間外，本發(fā)明對(duì)本領(lǐng)域還具有如下貢獻(xiàn):本發(fā)明無(wú)需進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)且專(zhuān)業(yè)的細(xì)胞培養(yǎng)工作，提高了轉(zhuǎn)基因的可重復(fù)性；本發(fā)明無(wú)需對(duì)外植體進(jìn)行繁瑣的滅菌工作，而以胚性愈傷組織作為外植體時(shí)，繁瑣的滅菌工作是必須的。
[0012]優(yōu)選的，所述步驟I)的培養(yǎng)時(shí)間為7天。
[0013]優(yōu)選的，所述步驟4 )中，共培養(yǎng)時(shí)間為9天。
[0014]優(yōu)選的，步驟2)中農(nóng)桿菌的活化方法為:于200rpm、28°C下，對(duì)含有外源質(zhì)粒的農(nóng)桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有5g L1酵母提取物、1g L 1細(xì)菌蛋白胨、5g L 1氯化鈉、50mg L 1卡拉霉素，pH為7.0，培養(yǎng)至OD6im=0.3-0.6 ;利用MT4-S液體培養(yǎng)基對(duì)農(nóng)桿菌進(jìn)行重懸，調(diào)節(jié)懸浮液的OD6qq=0.5。
[0015]所述外源質(zhì)粒為含有植物抗性選擇基因如湛因和β -葡萄糖苷酸酶基因供S報(bào)告基因的PMDC99IG質(zhì)粒。本領(lǐng)域人員應(yīng)該理解，含有如?基因和濟(jì)《基因的pMDC99IG質(zhì)粒只是可以用于本發(fā)明轉(zhuǎn)基因操作的質(zhì)粒，并不是對(duì)本發(fā)明的適用范圍的限定。
[0016]優(yōu)選的，所述農(nóng)桿菌菌株為ΕΗΑ105。
[0017]所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的成分和其它成分，所述其它成分包括:30 g Lmg L 1 維生素 Bl、100 mg L 1C1-酮戊二酸、5 mg L1 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L-1S-芐氨基腺嘌呤，所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值為5.8，用2g L 1植物凝膠固化；所述液體愈傷繼代培養(yǎng)基包含MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的成分和其它成分，所述其它成分包括:30 g L mg L 1 維生素 B1、100 mg L 1C1-酮戊二酸、2 mg L1 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg 1^6-芐氨基腺嘌呤，所述液體愈傷繼代培養(yǎng)基的pH值為5.8 ;所述固體愈傷繼代培養(yǎng)基的PH值為5.8，用2g L 1植物凝膠固化。
[0018]優(yōu)選的，所述方法還包括在步驟I)前對(duì)結(jié)縷草種子進(jìn)行預(yù)處理，所述預(yù)處理步驟包括:
A)將種子在水中浸泡2天；
B)置于含1%活性氯的次氯酸鈉溶液中攪拌滅菌2小時(shí)，然后用無(wú)菌水反復(fù)清洗。
[0019]本發(fā)明的有益效果:
1)本發(fā)明轉(zhuǎn)基因操作過(guò)程耗時(shí)短，僅需不足10天；
2)本發(fā)明無(wú)需復(fù)雜的操作，易于實(shí)施。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為對(duì)結(jié)縷草種子成熟胚進(jìn)行不同時(shí)間的預(yù)培養(yǎng)后的狀態(tài)圖，圖中，0、1、2、3、4、5、6、7分別為未經(jīng)培養(yǎng)、培養(yǎng)I天，培養(yǎng)2天，培養(yǎng)3天，培養(yǎng)4天，培養(yǎng)5天，培養(yǎng)6天、培養(yǎng)7天后的狀態(tài)圖；
圖2為結(jié)縷草