一種27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合pcr擴增熒光檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，該系統(tǒng)可以 用于玉米、大豆、水稻和油菜轉(zhuǎn)基因成分或品系鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將人工分離并修飾過的基因?qū)肷矬w基因組中，引起生物體的 可遺傳的性狀修飾，得到轉(zhuǎn)基因生物體（geneticallymodifiedorganism,GM0)。轉(zhuǎn)基因 作物具有其抗蟲、抗病、高產(chǎn)等特性，被認為可引導第二次綠色革命。
[0003] 迄今全球有至少28個國家在種植轉(zhuǎn)基因作物，種植面積已超過1. 7億公頃，2012 年轉(zhuǎn)基因種子的銷售額達到了 150億美元。各個國家和地區(qū)對轉(zhuǎn)基因作物及其深加工產(chǎn)品 中的轉(zhuǎn)基因成分都有嚴格的檢測標準和要求，轉(zhuǎn)基因檢測的市場巨大。快速、準確、靈敏的 檢測方法將成為主流，特別對于目前的新品種不斷流入市場，一些未知信息的樣本檢測，往 往需要多個試劑盒才能完成，不僅浪費了時間，還浪費了寶貴的樣本。因此，本項目針對目 前市場上轉(zhuǎn)基因檢測試劑盒檢測指標單一、假陰性率較高的現(xiàn)狀，特別是對于未知信息的 樣本，力求開發(fā)出一種多指標的檢測手段，極大的提升檢出率，保證人們的食品知情權(quán)。
[0004] 目前檢測轉(zhuǎn)基因成分主要有基于外源蛋白的檢測和基于外源插入DNA的檢測兩 大類。基于外源蛋白的檢測主要有ELISA法與試紙條法，由外源蛋白制備得到相應(yīng)單抗或 多抗，以此檢測產(chǎn)品中是否含有該特異性蛋白。與DNA為基礎(chǔ)的檢測方法相比較，該方法處 理簡單，具有快速、簡便等特點，但準確性與靈敏度不夠?；谕庠床迦隓NA的檢測方法有 PCR技術(shù)與基因芯片技術(shù)，目前PCR技術(shù)是最主要的轉(zhuǎn)基因檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是：提供一種通過復(fù)合擴增27個轉(zhuǎn)基因位點的系統(tǒng)，快速、準確地 檢測植物基因組中插入的外源片段，鑒定轉(zhuǎn)基因品系；利用聚合酶鏈式反應(yīng)在一個體系中 同時擴增多個轉(zhuǎn)基因位點，提出一種27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒。
[0006] 技術(shù)方案：
[0007] -種27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，包括有用于擴增如下27 個轉(zhuǎn)基因位點的引物：N0S、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CrylAb、NPTII、GA21、 Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176、Btll、TT51、Ms8、Lectin、Mon89788、 pe3-p印case、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2 及CV127。
[0008] 所述引物序列及其在擴增體系中的濃度優(yōu)選如下：
[0009] 表1用于擴增各轉(zhuǎn)基因位點的引物序列及其在擴增體系中濃度
[0010]
【主權(quán)項】
1. 一種27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特征在于，包括有用于 擴增如下27個轉(zhuǎn)基因片斷的引物：NOS、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CrylAb、 NPTII、GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176、Btll、TT51、Ms8、 Lectin、Mon89788、pe3_pepcase、Rf3、Sps、Rt73、GTS-40-3-2及CV127。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特 征在于，所述的引物序列是：NOS，SEQ ID NO. 1?2 ;BAR，SEQ ID NO. 3?4 ;Pat，SEQ ID NO. 5 ?6 ;CaMV35S, SEQ ID NO. 7 ?8 ;FMV35S, SEQ ID NO. 9 ?10 ;CP4-EPSPS, SEQ ID Nail?12;CryIAb，SEQIDN0.13?14;NPTII，SEQIDNai5?16;GA21，SEQIDNai7? 18 ;Zein，SEQ ID NO. 19 ?20 ;MIR604, SEQ ID NO. 21 ?22 ;Mon88017, SEQ ID NO. 23? 24 ;Mon863，SEQ ID NO. 25 ?26 ;TC1507，SEQ ID NO. 27 ?28 ;NK603，SEQ ID NO. 29 ?30 ; BT176，SEQIDN0.31?32;Btll，SEQIDN0.33?34;TT51，SEQIDN0.35?36;Ms8，SEQ 10勵.37?38;1^(：衍11，5￡0 10勵.39?40以〇1189788,5￡0 10勵.41?42卬63-口印〇&86， SEQ ID NO. 43 ?44 ;Rf3, SEQ ID NO. 45 ?46 ;Sps，SEQ ID NO. 47 ?48 ;Rt73, SEQ ID NO. 49 ?50 ;GTS-40-3-2 SEQ ID NO. 51 ?52 ;CV127, SEQ ID NO. 53?54。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其 特征在于，所述引物在擴增體系中的終濃度為：SEQ ID NO. 1?2 :0. 06剛；SEQ ID NO. 3?4 :0? 2剛；SEQ ID NO. 5?6 :0? 24剛；SEQ ID NO. 7?8 :0? 096剛；SEQ ID NO. 9?10: 0.2剛；SEQ ID NO. 11?12:0. 3剛；SEQ ID NO. 13?14:0. 064剛；SEQ ID NO. 15?16: 0? 06剛；SEQ ID NO. 17?18 :0? 24剛；SEQ ID NO. 19?20 :0? 24剛；SEQ ID NO. 21?22: 0? 064剛；SEQ ID NO. 23?24 :0? 18剛；SEQ ID NO. 25?26 :0? 22剛；SEQ ID NO. 27?28: 0? 18剛；SEQ ID NO. 29?30 :0? 18剛；SEQ ID NO. 31?32 :0? 033剛；SEQ ID NO. 33 ?34 : 0? 2剛；SEQ ID NO. 35 ?36 :0? 15剛；SEQ ID NO. 37 ?38 :0? 05剛；SEQ ID NO. 39 ?40 : 0? 3剛；SEQ ID NO. 41 ?42 :0? 24剛；SEQ ID NO. 43 ?44 :0? 25剛；SEQ ID NO. 45 ?46 : 0? 26剛；SEQ ID NO. 47 ?48 :0? 24剛；SEQ ID NO. 49 ?50 :0? 07剛；SEQ ID NO. 51 ?52 : 0? 2剛；SEQ ID NO. 53 ?54 :0? 3剛。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特征 在于，所述的用于擴增27個轉(zhuǎn)基因片斷的引物中，至少有一條引物的5'端被標記。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特征 在于，所述引物5'端被熒光標記。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特征 在于，所述引物分為三組進行熒光標記，N0S、BAR、Pat、CaMV35S、FMV35S、CP4-EPSPS、CryIAb 和 NPTII 為第一組；GA21、Zein、MIR604、Mon88017、Mon863、TC1507、NK603、BT176 和 Btll 為第二組；1"151、]\^8、1^(^111、]\1〇1189788、？63-?印。&86、1^3、5?8、財73、6丁5-40-3-2和（^127 為第三組。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特征 在于，每組引物使用6-FAM、HEX、TAMRA中任一種進行標記，且各組之間的標記色均不相同； 內(nèi)標選用橙色突光標記，標記物為SIZ。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特征 在于，所述試劑盒的組成為：PCR緩沖液、MgCl 2、dNTPs和BSA，Taq酶，27對引物混合物及超 純水。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，其特征 在于，所述試劑盒的PCR擴增體系pH值為8. 0?9. 0,鎂離子濃度為1. 5?3. 5mM，4種dNTP 的終濃度各為200?300剛，BSA在所述PCR擴增體系中的終濃度為0. 1?lmg/mL，Taq酶 的用量為〇. 1?〇. 4U/ML。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種27個植物轉(zhuǎn)基因位點復(fù)合PCR擴增熒光檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，熱啟動快速Taq酶，27對引物混合物及超純水。本發(fā)明只需對植物基因組DNA樣本進行約80min的核酸擴增，即可檢測是否存在試劑盒包含的轉(zhuǎn)基因位點，適用于玉米、大豆、水稻和油菜轉(zhuǎn)基因成分或品系鑒定，是一種快速、簡便、經(jīng)濟、高效的轉(zhuǎn)基因成分檢測試劑盒。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104593504
【申請?zhí)枴緾N201510033935
【發(fā)明人】張明哲, 張曉峰, 陳曦, 陳笑梅, 鄭衛(wèi)國, 齊麗媛, 王艷芳, 葛海鵬, 郭育林
【申請人】無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司, 浙江省檢驗檢疫科學技術(shù)研究院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2015年1月22日