專利名稱：一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法
技術領域：
本發(fā)明屬于黃芩的人工培育技術領域，涉及一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法。
背景技術：
黃芩(Scutellariabaicalensis Georgi.)為唇形科(Labiatae)植物，是一種常用的中藥。其性寒、味苦，歸肺、心、肝、膽、大腸經(jīng)，具有抗菌消炎、清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。黃芩為多年生草本植物，喜溫和氣候，耐寒冷、干旱，主要分布于河北、遼寧、陜西、山東、內(nèi)蒙古等地，主要成分是黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等。隨著國際上對黃芩研究的深入，黃芩的主要成分黃芩苷在清除氧自由基、減輕組織的缺血再灌注損傷、調(diào)節(jié)免疫以及抗腫瘤和HIV等多方面均有較好作用。隨著新藥不斷開發(fā)，黃芩苷用量迅速增加， 近年來，藥材產(chǎn)地環(huán)境污染和農(nóng)藥噴施，都給黃芩資源的可持續(xù)發(fā)展帶來嚴重危機。自1997年Ackermarm首先用發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化高等植物以來，迄今已有100多種植物建立了培養(yǎng)系統(tǒng)。利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導植物產(chǎn)生毛狀根，并對毛狀根進行離體培養(yǎng)，生產(chǎn)有用的次生代謝產(chǎn)物，是使該植物可持續(xù)發(fā)展的有效途徑之一。毛狀根生長迅速，分支多無向地性，激素自養(yǎng)，生理生化、遺傳特征穩(wěn)定，次生代謝產(chǎn)物含量高，處于器官化水平，基本上保持了正常根的生化功能，且比細胞培養(yǎng)容易放大，該方法特別適合根用植物。因此通過大量培養(yǎng)毛狀根替代野生資源，對保護環(huán)境與中藥的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，能夠快速、高誘發(fā)率的誘發(fā)毛狀根，解決黃芩資源短缺的問題。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)1)將無菌的黃芩外植體接種于預培養(yǎng)基上，25 黑暗條件下預培養(yǎng)2 3d ；所述的預培養(yǎng)基為含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA禾口 0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS固體培養(yǎng)基；2)在預培養(yǎng)的黃芩外植體上劃痕，加入活化的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其終濃度為200 600 μ g/mL，感染10 30min ；吸棄剩余的菌液后，將黃芩外植體轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上，25 黑暗培養(yǎng)2 3d，再轉(zhuǎn)移到含抗菌素的MS固體培養(yǎng)基上，25 黑暗培養(yǎng)，誘發(fā)毛狀根；3)待經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的黃芩外植體上長出的毛狀根達到2 3cm時，在無菌條件下切下毛狀根，將其轉(zhuǎn)移到含抗菌素的MS固體培養(yǎng)基上，25 黑暗培養(yǎng)，直至發(fā)根農(nóng)桿菌生長被抑制，然后切取毛狀根；4)將切取的毛狀根接種于MS固體培養(yǎng)基上，25 避光培養(yǎng)，每30天繼代培養(yǎng)一次；5)選取MS固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)2次以上、生長旺盛的毛狀根，切取根尖部分，接種到MS液體培養(yǎng)基上，100 200r/min振蕩、25 避光培養(yǎng)，篩選生長迅速、能穩(wěn)定產(chǎn)生黃芩苷的黃芩毛狀根株系；6)選取MS液體培養(yǎng)基中生長旺盛的黃芩毛狀根株系，切取根尖部分，接種到優(yōu)化培養(yǎng)基上，100 200r/min振蕩、25 避光培養(yǎng)，培養(yǎng)到32 38d補加培養(yǎng)液，培養(yǎng)至 60 80天收獲毛狀根；所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物誘導子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物誘導子和 0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值為4. 0 7. 0 ；所述的碳源為葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源為硝酸銨或水解乳蛋白；生物誘導子為黑曲霉、米曲霉或蜜環(huán)菌誘導子；非生物誘導子為Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素為NAA或 6-BA。所述的毛狀根液體基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或采用以下配方包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH為5. 8 6. 0 ；所述的大量元素為KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；微量元素為KI :0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；鐵鹽為Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；有機成分為肌醇100mg/L、甘氨酸Jmg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L 和煙酸0. 5mg/L。所述的切取的根尖部分是按照5 8g/L的接種量接種到選育培養(yǎng)基中。所述的黃芩外植體的獲得為將無菌的黃芩種子萌發(fā)后接種于含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA和0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS瓊脂培養(yǎng)基上，在25 培養(yǎng)，生長成苗，切取苗的莖段作為外植體。所述的發(fā)根農(nóng)桿菌的活化為將發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液均勻涂布于YEB瓊脂培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)，長出單菌落后，挑取單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中，25°C、110r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)2d ；然后再取菌體懸浮液轉(zhuǎn)接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，25°C、110r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)；YEB液體培養(yǎng)重復 2 3次，待農(nóng)桿菌0D600為0. 4 0. 5時，用于感染黃芩外植體。所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌A4、發(fā)根農(nóng)桿菌A49615或發(fā)根農(nóng)桿菌1. 2556。所述的抗菌素為氨芐西林鈉，其濃度為180 500mg/kg。所述的篩選的黃芩毛狀根株系，為黃芩苷含量可達毛狀根干重4. 85%以上的株系。一種用于黃芩毛狀根培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基，是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加 10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物誘導子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物誘導子和0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值為4. 0 7. 0 ；所述的碳源為葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源為硝酸銨或水解乳蛋白；生物誘導子為黑曲霉、米曲霉或蜜環(huán)菌誘導子；非生物誘導子為Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素為NAA或 6-BA。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益的技術效果1、本發(fā)明公開的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導黃芩屬黃芩得到毛狀根，誘導率可達10 40%，在經(jīng)過固體、液體培養(yǎng)基的選育培養(yǎng)，所得黃芩毛狀根呈黃色毛發(fā)狀，能穩(wěn)定合成黃芩苷，對其ITS測序，鑒定該毛狀根為黃芩屬黃芩毛狀根。更進一步，本發(fā)明將黃芩屬黃芩毛狀根在優(yōu)化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其生長迅速，在 30 35天其生物量能增值23 35倍，并且只需在黑暗條件下培養(yǎng)，低能耗，低成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。據(jù)文獻報道的黃芩道地藥材(產(chǎn)地河北承德)最高含量15. 89 士 1.52%，從單位時間黃芩苷生成量來看，經(jīng)選育培養(yǎng)的毛狀根系是藥材黃芩的19 23倍。2、利用本發(fā)明培育的黃芩毛狀根，遺傳性狀穩(wěn)定，產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物能力強，可以有效合成黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等藥用成分，其中黃芩苷含量可達毛狀根干重的4. 85 11. 85%，并且與黃芩藥材有相同的糖苷鍵水解酶系。其中含量較高者比2005 版藥典規(guī)定“藥用黃芩含黃芩苷(C21H18O11)不得少于9.0%”有顯著的提高。3、利用本發(fā)明培育的黃芩毛狀根，可經(jīng)人工調(diào)節(jié)控制其生長和次生產(chǎn)物的合成， 生產(chǎn)所需產(chǎn)物；其生產(chǎn)方式避免了地理、季節(jié)和氣候條件的限制也不受病蟲害的影響。通過毛狀根培養(yǎng)技術解決黃芩資源短缺問題，為中藥黃芩有效成分來源開辟出一條有效途徑。


圖1是感染黃芩外植體后誘導的毛狀根。圖2是液體培養(yǎng)選育的黃芩毛狀根。圖3是優(yōu)化培養(yǎng)基上培養(yǎng)的黃芩毛狀根。圖4是黃芩毛狀根ITS的擴增條帶示意圖。圖5是黃芩毛狀根的ITS在NCBI上基因序列比對結(jié)果示意圖。圖6是毛狀根液體培養(yǎng)生長曲線示意圖。
具體實施例方式本發(fā)明公開一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，利用發(fā)根農(nóng)桿菌菌液侵染黃芩外植體，誘導黃芩外植體形成毛狀根，黃芩毛狀根在MS固體培養(yǎng)基上呈黃色毛發(fā)狀，能穩(wěn)定合成黃芩苷，對其ITS測序，鑒定該毛狀根為黃芩屬黃芩毛狀根。然后在選育培養(yǎng)基中進一步選育，優(yōu)化培養(yǎng)條件，以選育提高毛狀根中藥用有效成分黃芩苷的含量的株系。下面結(jié)合具體的選育方法和黃芩苷的含量鑒定對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。實施例1一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，包括以下步驟1)黃芩外植體的獲得與預培養(yǎng)將無菌的黃芩種子萌發(fā)后接種于預培養(yǎng)基在25 培養(yǎng)，生長成苗，切取苗的莖段作為外植體?；蛘?，直接取黃芩苗消毒得，然后切取苗的莖段作為外植體。將獲取的無菌的黃芩外植體接種于預培養(yǎng)基上，25 ^°C、黑暗條件下預培養(yǎng)2 3d ；所述的預培養(yǎng)基為含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA禾口 0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS固體培養(yǎng)基(具體可以采用ILMS培養(yǎng)基添加有30g蔗糖和5g瓊脂)。2)發(fā)根農(nóng)桿菌的活化及轉(zhuǎn)染外植體具體選用發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes) A4、A49615 或 1. 2556 之一作為轉(zhuǎn)染的發(fā)根農(nóng)桿菌。發(fā)根農(nóng)桿菌的活化取發(fā)根農(nóng)桿菌菌液稀釋10-6倍，取0. 2mL均勻涂布于YEB 瓊脂培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)，長出單菌落后，挑取單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中，搖床上25°C、 llOr/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)2天；再取0. 2mL菌體懸浮液轉(zhuǎn)接到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中， 25°C、110r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)，重復該步驟2 3次活化農(nóng)桿菌，待農(nóng)桿菌0D_為
0.4 0. 5時用于接種感染黃芩及外植體。在預培養(yǎng)的黃芩外植體上劃痕，加入活化的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并于菌液中添加酚類物質(zhì)乙酰丁香酮，使其終濃度為200 600 μ g/ mL，感染10 30min ；取出用無菌濾紙吸干多余的菌液后，轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上，25
黑暗培養(yǎng)2 3d，再轉(zhuǎn)移到含抗菌素芐西林鈉180 500mg/kg的MS固體培養(yǎng)基上， 25 黑暗培養(yǎng)。3)除菌待經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的黃芩外植體上長出的毛狀根達到2 3cm時，在無菌條件下切下毛狀根，將其轉(zhuǎn)移到含180 500mg/kg氨芐西林鈉的MS固體培養(yǎng)基上，25 28 V 黑暗培養(yǎng)，直至發(fā)根農(nóng)桿菌生長被抑制(從未見發(fā)根農(nóng)桿菌生長，延長培養(yǎng)時間到5天，至仍不能生長為止)，然后切取毛狀根。4)毛狀根固體培養(yǎng)將切取的毛狀根接種于MS固體培養(yǎng)基上，25 避光培養(yǎng)，每30天繼代培養(yǎng)一次。MS固體培養(yǎng)基上的黃芩外植體上長出的毛狀根的結(jié)果圖如圖1所示。5)毛狀根液體培養(yǎng)及選育選取生長旺盛、分枝多、長3 5cm的毛狀根，切取根尖部分，接種到MS液體培養(yǎng)養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)速為110r/min振蕩、25 觀V避光培養(yǎng)，篩選在選育培養(yǎng)基中生長迅速、遺傳穩(wěn)定、能穩(wěn)定產(chǎn)生黃芩苷的黃芩毛狀根株系。MS液體培養(yǎng)基上的黃芩外植體上長出的毛狀根的結(jié)果圖如圖2所示。6)毛狀根的優(yōu)化培養(yǎng)選取MS液體繼代培養(yǎng)2次以上、生長旺盛、能穩(wěn)定產(chǎn)生黃芩苷的毛狀根根株系，切取根尖部分，按照5 8g/L的接種量，接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中，搖床上100 200r/min振蕩， 25 避光培養(yǎng)；培養(yǎng)到32 38天補加濃縮5倍的毛狀根液體基本培養(yǎng)液(相當于未濃縮100ml)，毛狀根全培養(yǎng)基，培養(yǎng)期延長至60 80天；優(yōu)化培養(yǎng)基上的黃芩外植體上長出的毛狀根的結(jié)果圖如圖3所示，可見毛狀根生長旺盛，布滿整個培養(yǎng)瓶。所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加10 60g/L的碳源、0. 3
1.0g/L的氮源、20 100mg/L的生物誘導子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物誘導子和 0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值為4. 0 7. 0 ；所述的碳源為葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源為硝酸銨或水解乳蛋白；生物誘導子為黑曲霉、米曲霉或蜜環(huán)菌誘導子；非生物誘導子為Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素為NAA或 6-BA。所述的毛狀根液體培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或采用以下配方包含大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，pH為5. 8 6. 0 ；所述的大量元素為KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；微量元素為KI :0. 83mg/L、H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ；鐵鹽為Na2 · EDTA 18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；有機成分為肌醇100mg/L、甘氨酸Jmg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇 0. 5mg/L 和煙酸0. 5mg/L。實施例2毛狀根的優(yōu)化培養(yǎng)與實施例1的篩選方法相同，不同的是優(yōu)化培養(yǎng)基的添加成分的不同。所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加40g/L的葡萄糖、0. 5g/L的水解乳蛋白、50mg/L的黑曲霉誘導子、1. Ommol/L的Ca2+和0. 25mg/L的NAA, pH值為7. 0。實施例3毛狀根的優(yōu)化培養(yǎng)與實施例1的篩選方法相同，不同的是優(yōu)化培養(yǎng)基的添加成分的不同。所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加20g/L的蔗糖、0. 45g/L的硝酸銨、40mg/L的米曲霉誘導子、1. Ommol/L的Mg2+和0. 25mg/L的6-BA，pH值為4. 0。實施例4毛狀根的優(yōu)化培養(yǎng)與實施例1的篩選方法相同，不同的是優(yōu)化培養(yǎng)基的添加成分的不同。所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加20g/L的果糖、0. 45g/L的水解乳蛋白、40mg/L的蜜環(huán)菌誘導子、1. Ommol/L的Co2+和0. 25mg/L的6_BA，pH值為6. 0。實施例5毛狀根的優(yōu)化培養(yǎng)與實施例1的篩選方法相同，不同的是優(yōu)化培養(yǎng)基的添加成分的不同。所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加60g/L的葡萄糖、1. Og/L的水解乳蛋白、20mg/L的米曲霉誘導子、0. 05mmol/L的Ca2+和0. 2mg/L的6_BA，pH值為6. 5。實施例6毛狀根的優(yōu)化培養(yǎng)與實施例1的篩選方法相同，不同的是優(yōu)化培養(yǎng)基的添加成分的不同。所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加50g/L的蔗糖、0. 4g/L的水解乳蛋白、30mg/L的黑曲霉誘導子、0. 005mmol/L的Mg2+和0. 5mg/L的6-BA，pH值為6. 5。對于培育的黃芩毛狀根進行如下檢測1、采用高效液相色譜法測定黃芩苷含量檢測方法采用藥典所規(guī)定的方法，多用色譜柱為化學鍵合型十八烷基柱(SCiClS色譜柱)，檢測器為PUMP K-100U K-1501，流動相為甲醇水磷酸=50 50 0.2，檢測波長為274nm，柱溫為室溫，流速為lmL/min。黃芩毛狀根在本發(fā)明建立的培養(yǎng)體系下培養(yǎng)30 35天其生物量能增值23 35 倍，干燥毛狀根中所測的黃芩苷含量可達毛狀根干重的4. 85 11. 85%。比2005版藥典規(guī)定“藥用黃芩含黃芩苷(C21H18O11)不得少于9.0%”有顯著的提高，據(jù)文獻報道的黃芩道地藥材(產(chǎn)地河北承德)最高含量15. 89士 1.52%，從單位時間黃芩苷生成量來看，經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)的毛狀根系是藥材黃芩的19 23倍。2、提取黃芩毛狀根DNA進行ITS測序毛狀根DNA的提取，方法如下1)取2g新鮮毛狀根，用蒸餾水洗滌，充分吸干，于液氮中迅速研磨成粉。2)將凍粉迅速轉(zhuǎn)入提取緩沖液2*TAB中，放入1. 5mL EP管中，盡快用細玻璃棒混勻，于65°C保溫30min，其間輕柔攪動2_3次。3)取出離心管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿/異戊醇(對/1)，輕緩顛倒混勻，靜置 IOmin04) 12000rpm 離心 5min。5)轉(zhuǎn)移上清液與另一離心管中，加入2. 5倍體積異丙醇，輕緩顛倒混勻，室溫放置 15min。6) IOOOOrpm 離心 30s，收集沉淀。7)用70%乙醇2mL洗滌沉淀2次，室溫下干燥lOmin。8)將沉淀溶于50 μ L TE緩沖液，_20°C冰箱中保存，備用。ITS序列擴增為ITS序列采用雙引物進行擴增，引物序列分別為上引物5-TAA CAA GGT TTC CGT AGG TGA-3，下引物5-GGC CGT TGG GTC TCA TCT T-3，引物有上海捷瑞生物技術有限公司合成，擴增5. 8S rDNA及其兩側(cè)的ITSl和ITS2基因片段。反應體系50 μ L :10*PCR反應緩沖液 5.0 μ L，dNTP (各 IOmM) 2. O μ L, Taq 酶 2U，引物(10 μ Μ)各 3. O μ L，模板 4. O μ L。反應程序:95V 5min，94°C 15s，55°C 30s, 72°C lmin，循環(huán) 30 次，72°C 5min，4°C lmin。擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色紫外下觀察。擴增的產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖4所示， ITS的擴增條帶大小為589bp。對黃芩毛狀根的ITS序列進行測序，其具體的ITS序列為
ggggggagattgtcgaactg tgaagcagac cacgaacacg tgtctaacgaccaatcgagg60
acaacggcgtgggggtgtgc cccccgtctg ggtcctcaca cccgcacggctggtgtgaga120
gcatcgtgtcgtgcgggcca acgaacccgg gcacggaatg cgccaaggaaaatcagaaga180
gatcgtccccctccgtgcgt cctgtccacg gagcacgcac ggggtgggtcaggcatttgt240
cgaatgtcataacgactctc ggcaacggat atctcaactc tcacatcgttgaagaacgta300
gtgaaatgtg atacttggtg tgaattacag aatcccgtga accatcgagtctttgaacgc360
aagtggcgcccgaagccatc gcgtctcccc ccctcacacc gcctcgagcg gtgccgtgtg420
gaggtggagattggcccccc gtgtggcccg gtgcatggcc gggccaaatg cgatccctcg480
gccatgcacgtcccgacaag tggtggttgt ttcctcaact cgcgtgctgt actgtgccaa540
ggcatcatccgttccataca gaatctaaag atgagacaca ccctgccaa589
ITS在NCBI上基因序列比對結(jié)果，如圖5所示，毛狀根的ITS與黃芩屬黃芩(登錄號AB557593. 1，)的ITS相似度高達90 %，說明該毛狀根來源于黃芩屬黃芩。將毛狀根的 ITS提交GenBank，獲得登錄號JF824665。3、黃芩毛狀根生長曲線測定測定挑選生長旺盛能穩(wěn)定產(chǎn)生黃芩苷的毛狀根根株系，稱取0. 35g新鮮毛狀根接種到 IOOmL優(yōu)化培養(yǎng)液中培養(yǎng)至30d，100 200r/min，25 下在暗培養(yǎng)。每5d取出黃芩毛狀根，經(jīng)布氏漏斗抽濾后，無水滴下時稱其鮮物質(zhì)量。以黃芩毛狀根生物量為縱坐標，生長天數(shù)為橫坐標繪制黃芩毛狀根生長曲線。其結(jié)果如圖6所示，可以看到毛狀根生長接近于對數(shù)生長曲線，從第15天起，其鮮重快速生長，至35天起生長進入平緩階段。
權利要求
1.一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，包括以下步驟1)將無菌的黃芩外植體接種于預培養(yǎng)基上，25 黑暗條件下預培養(yǎng)2 3d；所述的預培養(yǎng)基為含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA和0. 1 0. 35mg/kg NAA的MS固體培養(yǎng)基；2)在預培養(yǎng)的黃芩外植體上劃痕，加入活化的發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)的菌液，并添加乙酰丁香酮，使其終濃度為200 600 μ g/mL，感染10 30min ；將黃芩外植體轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上，25 黑暗培養(yǎng)2 3d，再轉(zhuǎn)移到含抗菌素的MS固體培養(yǎng)基上，25 黑暗培養(yǎng)，誘發(fā)毛狀根；3)待經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌感染的黃芩外植體上長出的毛狀根達到2 3cm時，在無菌條件下切下毛狀根，將其轉(zhuǎn)移到含抗菌素的MS固體培養(yǎng)基上，25 黑暗培養(yǎng)，直至發(fā)根農(nóng)桿菌生長被抑制，然后切取毛狀根；4)將切取的毛狀根接種于MS固體培養(yǎng)基上，25 避光培養(yǎng)，每30天繼代培養(yǎng)一次；5)選取MS固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)2次以上、生長旺盛的毛狀根，接種到MS液體培養(yǎng)基上，100 200r/min振蕩、25 避光培養(yǎng)，篩選生長迅速、能穩(wěn)定產(chǎn)生黃芩苷的黃芩毛狀根株系；6)選取MS液體培養(yǎng)基中生長旺盛的黃芩毛狀根株系，切取根尖部分，接種到優(yōu)化培養(yǎng)基上，100 200r/min振蕩、25 避光培養(yǎng)，培養(yǎng)到32 38d補加培養(yǎng)液，培養(yǎng)至60 80天收獲毛狀根；所述的優(yōu)化培養(yǎng)基是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物誘導子、5. 3Χ1(Γ5 3. Ommol/L的非生物誘導子和 0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值為4. 0 7. 0 ；所述的碳源為葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源為硝酸銨或水解乳蛋白；生物誘導子為黑曲霉、米曲霉或蜜環(huán)菌誘導子；非生物誘導子為Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素為NAA或6-BA。
2.如權利要求1所述的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，所述的毛狀根液體基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或采用以下配方包含大量元素、微量元素、 鐵鹽和有機成分，pH為5. 8 6. 0 ；所述的大量元素為 KNO3 :950mg/L、KH2PO4 :42. 5mg/L、MgSO4 · 7H20 :185mg/L 和 CaCl2 · 2H20 220mg/L ；微量元素為 KI :0. 83mg/L,H3BO3 :6. 2mg/L、MnSO4 · 4H20 :22. 3mg/L、ZnSO4 · 7H20 :8. 6mg/ L、Na2MoO4 · 2H20 :0. 25mg/L、CuSO4 · 5H20 :0. 025mg/L 和 CoCl2 :0. 025mg/L ； 鐵鹽為 Na2 · EDTA :18. 65mg/L 和 FeSO4 · 7Η2013· 9mg/L ；有機成分為肌醇100mg/L、甘氨酸dmg/L、鹽酸硫胺素0. lmg/L、鹽酸吡哆醇0. 5mg/ L 和煙酸:0. 5mg/L。
3.如權利要求1所述的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，所述的切取的根尖部分是按照5 8g/L的接種量接種到優(yōu)化培養(yǎng)基中。
4.如權利要求1所述的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，所述的黃芩外植體的獲得為將無菌的黃芩種子萌發(fā)后接種于含有0. 15 1. Omg/kg 6-BA和0. 1 0. 35mg/kg NAA 的MS瓊脂培養(yǎng)基上，在25 培養(yǎng)，生長成苗，切取苗的莖段作為外植體。
5.如權利要求1所述的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，所述的發(fā)根農(nóng)桿菌的活化為將發(fā)根農(nóng)桿菌的菌液均勻涂布于YEB瓊脂培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)，長出單菌落后，挑取單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中，25°C、110r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)2d ；然后再取菌體懸浮液轉(zhuǎn)接種到Y(jié)EB液體培養(yǎng)基中，25°C、110r/min、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)；YEB液體培養(yǎng)重復2 3次，待農(nóng)桿菌0D600為0. 4 0. 5時，用于感染黃芩外植體。
6.如權利要求1所述的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，所述的發(fā)根農(nóng)桿菌為發(fā)根農(nóng)桿菌A4、發(fā)根農(nóng)桿菌A49615或發(fā)根農(nóng)桿菌1. 2556。
7.如權利要求1所述的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，所述的抗菌素為氨芐西林鈉，其濃度為180 500mg/kg。
8.如權利要求1所述的基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，其特征在于，所述的篩選的黃芩毛狀根株系，為黃芩苷含量可達毛狀根干重4. 85%以上的株系。
9.一種用于黃芩毛狀根培養(yǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基，其特征在于，是在毛狀根液體基本培養(yǎng)基上添加10 60g/L的碳源、0. 3 1. Og/L的氮源、20 100mg/L的生物誘導子、5. 3X 1(Γ5 3. Ommol/L的非生物誘導子和0. 2 0. 6mg/L的外源激素，pH值為4. 0 7. 0 ；所述的碳源為葡萄糖或蔗糖或果糖；氮源為硝酸銨或水解乳蛋白；生物誘導子為黑曲霉、米曲霉或蜜環(huán)菌誘導子；非生物誘導子為Ca2+、Mg2+或Co2+ ；外源激素為NAA或6-BA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于發(fā)根農(nóng)桿菌感染的誘發(fā)黃芩毛狀根的培育方法，利用發(fā)根農(nóng)桿菌菌液侵染黃芩外植體，誘導黃芩外植體形成毛狀根，黃芩毛狀根在MS固體培養(yǎng)基上呈黃色毛發(fā)狀，能穩(wěn)定合成黃芩苷，對其ITS測序，鑒定該毛狀根為黃芩屬黃芩毛狀根。然后在選育培養(yǎng)基中進一步選育，優(yōu)化培養(yǎng)條件，以選育提高毛狀根中藥用有效成分黃芩苷的含量的株系。通過發(fā)根農(nóng)桿菌誘導黃芩屬黃芩得到毛狀根，誘導率可達10～40％，所得黃芩毛狀根呈黃色毛發(fā)狀，能穩(wěn)定合成黃芩苷，本發(fā)明將黃芩屬黃芩毛狀根在優(yōu)化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其生長迅速，在30～35天其生物量能增值23～35倍，并且只需在黑暗條件下培養(yǎng)，低能耗，低成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N5/04GK102229945SQ20111013237
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月20日 優(yōu)先權日2011年5月20日
發(fā)明者李雅, 郭樂康, 錢衛(wèi)東, 陳秀清, 齊香君 申請人:陜西科技大學