本發(fā)明屬于植物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種分離自藍(lán)花黃芩的新型克羅烷型二萜類化合物及其在制備抗hiv藥物中的用途。

背景技術(shù)：

唇形科(lamiaceae)黃芩屬(scutellaria)植物廣泛分布于熱帶和亞熱帶山脈地區(qū)，遍及歐洲、北美和東亞，約有360多個物種。在我國明確記載的有102種，50個變種，多為藥用。其中2010年版《中國藥典》收錄2種：黃芩(scutellariabaicalensis)和半枝蓮(scutellariabarbata)，黃芩主治濕溫、暑濕，胸悶嘔惡，濕熱痞滿，瀉痢，黃疸，肺熱咳嗽，高熱煩咳，血熱吐衄，癰腫瘡毒和胎動不安?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩屬植物具有抗氧化、抗腫瘤、保肝，抗炎、抗驚厥、抗菌、抗病毒等作用。萜類和酚類化合物是黃芩屬植物的主要化學(xué)成分，其中二萜類具有很好的抑制ebv病毒裂解復(fù)制，抗腫瘤，抗拒食和對脂多糖誘導(dǎo)的一氧化氮生成起抑制作用等活性。

藍(lán)花黃芩(scutellariaformosanan.e.brown)為番唇形科(lamiacea)黃芩屬多年生草本植物，根莖近木質(zhì)，具纖維狀須根。該植物產(chǎn)自廣東，江西，福建，云南等地。目前關(guān)于藍(lán)花黃芩的化學(xué)成分及藥理活性的研究僅限于揮發(fā)油成分鑒定及其粗提物活性研究，結(jié)果表明藍(lán)花黃芩粗提物具有一定的抗腫瘤和抗hiv-1活性。據(jù)本屬植物相關(guān)報道，這些活性可能與二萜類成分有關(guān)。從藍(lán)花黃芩分離得到的新克羅烷型二萜類化合物未見報道，也未見該類化合物在抗hiv-1報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種新克羅烷型二萜類化合物、其立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽，其特征在于所述新克羅烷型二萜類化合物具有式i所示的結(jié)構(gòu)：

其中r1選自ac、bz，r2選自oh、oac或obz，r3選自h、oac或obz。

本發(fā)明提供另一優(yōu)選實施方案，式i化合物優(yōu)選如下化合物ii-viii：

本發(fā)明的另一實施方案提供一種同時制備化合物ii-viii的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)將陰干的藍(lán)花黃芩全草粉碎，用乙醇溶液加熱50-60℃提取2-4次，每次提取1-3h，合并提取液，減壓濃縮得粗提物；

(2)將步驟(1)得到的粗提物用適量的水稀釋制成懸浮液后，依次用等體積的石油醚萃取3-5次，合并石油醚相，減壓濃縮得浸膏；

(3)將步驟(2)得到的浸膏，先經(jīng)減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每個梯度收集兩個柱體積，根據(jù)極性大小分成10個組分，其中梯度100:0～90:10洗脫得到的為組分1，梯度90:10～80:20洗脫得到的為組分2，梯度80:20～70:30洗脫得到的為組分3，梯度70:30～60:40洗脫得到的為組分4，梯度60:40～50:50洗脫得到的為組分5，梯度50:50～40:60洗脫得到的為組分6，梯度40:60～30:70洗脫得到的為組分7，梯度30:70～20:80洗脫得到的為組分8，梯度20:80～10:90洗脫得到的為組分9，梯度10:90～0:100洗脫得到的為組分10，其中組分4先經(jīng)正相硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶劑，洗脫2-5個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為chcl3:meoh＝1:1的混合溶劑，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝55:45，依次得到化合物ii、iv、vi，組分5先經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為meoh，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝75:25，依次得到化合物iii、viii，組分6經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為mecn:h2o＝75:25，依次得到化合物vii、v。

上述制備方法，步驟(1)中所述乙醇溶液為體積分?jǐn)?shù)為75-95％的乙醇溶液，其用量為每千克藍(lán)花黃芩全草(干重)用2-3l乙醇溶液。步驟(2)中水的用量，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)粗提物的量，合理選擇水的用量，優(yōu)選每100克粗提物加水200-300ml，每次萃取石油醚的體積用量與水的體積相同。

本發(fā)明色譜分離中所有涉及洗脫劑或流動相比例均為體積比。

本發(fā)明的另一實施方案提供一種抗hiv藥物，其特征在于該藥物以式i化合物、其立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。該藥物還可包括其他抗病毒藥物。該藥物還可包括藥用輔料，例如藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

本發(fā)明的另一實施方案提供一種抗hiv藥物，其特征在于該藥物以化合物ii-viii、其立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽作為有效成分。該藥物還可包括其他抗病毒藥物。該藥物還可包括藥用輔料，例如藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。

本發(fā)明的另一實施方案提供式i化合物、其立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗hiv藥物中的用途。尤其是在制備抗hiv-1藥物中的用途。

本發(fā)明的另一實施方案提供化合物ii-viii、其立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、前藥或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備抗hiv藥物中的用途。尤其是在制備抗hiv-1藥物中的用途。

本發(fā)明中術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指非毒性的無機或有機酸和/或堿的加成鹽，可參見“saltselectionforbasicdrugs”,int.j.pharm.(1986),33,201–217。

具體實施方式

為了便于對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，下面提供的實施例對其做了更詳細(xì)的說明。但是這些實施例僅供更好的理解發(fā)明而并非用來限定本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┰瓌t，本發(fā)明的實施方式不限于以下內(nèi)容。

實施例1：克羅烷型二萜類化合物ii-viii的制備

(1)將陰干的藍(lán)花黃芩全草(2.0kg)粉碎，用75％的乙醇溶液(6l)加熱50-60℃提取4次，每次提取1h，合并提取液，減壓濃縮得粗提物(約300g)；

(2)將步驟(1)得到的粗提物用適量的水(600ml)稀釋制成懸浮液后，依次用等體積的石油醚(600ml)萃取5次，合并石油醚相，減壓濃縮得浸膏(約21g)；

(3)將步驟(2)得到的浸膏，先經(jīng)減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每個梯度收集兩個柱體積，根據(jù)極性大小分成10個組分，其中梯度100:0～90:10洗脫得到的為組分1，梯度90:10～80:20洗脫得到的為組分2，梯度80:20～70:30洗脫得到的為組分3，梯度70:30～60:40洗脫得到的為組分4，梯度60:40～50:50洗脫得到的為組分5，梯度50:50～40:60洗脫得到的為組分6，梯度40:60～30:70洗脫得到的為組分7，梯度30:70～20:80洗脫得到的為組分8，梯度20:80～10:90洗脫得到的為組分9，梯度10:90～0:100洗脫得到的為組分10，其中組分4先經(jīng)正相硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶劑，洗脫2-5個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為chcl3:meoh＝1:1的混合溶劑，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝55:45，依次得到化合物ii(20.0mg)、iv(2.8mg)、vi(10.0mg)，組分5先經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為meoh，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝75:25，依次得到化合物iii(18.9mg)、viii(2.5mg)，組分6經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為mecn:h2o＝75:25，依次得到化合物vii(3.0mg)、v(2.7mg)。

化合物ii-viii結(jié)構(gòu)如下：

結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)如下：

化合物ii：(1r,4r,5s,6,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6-二乙酰氧基-12-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環(huán)氧-新克羅烷-15,16-內(nèi)酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經(jīng)hresi(+)ms(m/z593.2366[m+na]⁺，理論值593.2357)確定其分子式為c31h38o10；根據(jù)¹h，¹³c及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoida，其¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表1.[400mhz(¹h)，100mhz(¹³c)，溶劑：cdcl3]。

化合物iii：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6-二乙酰氧基-7,12-二苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環(huán)氧-新克羅烷-15,16-內(nèi)酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經(jīng)hresi(+)ms(m/z713.3372[m+na]⁺，理論值713.3374)確定其分子式為c38h42o12；根據(jù)¹h，¹³c及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoide，其¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表2.[400mhz(¹h)，100mhz(¹³c)，溶劑：cdcl3]。

化合物iv：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6,7-三乙酰氧基-12-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環(huán)氧-新克羅烷-15,16-內(nèi)酯為無定形粉末，易溶于氯仿。經(jīng)hresi(+)ms(m/z651.2428[m+na]⁺，理論值651.2412)確定其分子式為c33h40o12；根據(jù)¹h，¹³c及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidf，其¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表2.[400mhz(¹h)，100mhz(¹³c)，溶劑：cdcl3]。

化合物v：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1-羥基-6-乙酰氧基-7,12-二苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環(huán)氧-新克羅烷-15,16-內(nèi)酯為無定形粉末，易溶于氯仿。經(jīng)hresi(+)ms(m/z671.2578[m+na]⁺，理論值671.2577)確定其分子式為c36h40o11；根據(jù)¹h，¹³c及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidm，其¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表3.[400mhz(¹h)，100mhz(¹³c)，溶劑：cdcl3]。

化合物vi：(1r,4r,5s,6s,8s,9r,10r,12s,13r)-6,12-二乙酰氧基-1-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環(huán)氧-新克羅烷-15,16-內(nèi)酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經(jīng)hresi(+)ms(m/z593.2358[m+na]⁺，理論值593.2357)確定其分子式為c31h38o10；根據(jù)¹h，¹³c及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidc，其¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表2.[400mhz(¹h)，100mhz(¹³c)，溶劑：cdcl3]。

化合物vii：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-6,7,12-三乙酰氧基-1-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環(huán)氧-新克羅烷-15,16-內(nèi)酯為無色晶狀物，易溶于氯仿。經(jīng)hresi(+)ms(m/z651.2428[m+na]⁺，理論值651.2412)確定其分子式為c33h40o12；根據(jù)¹h，¹³c及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidl，其¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表3.[400mhz(¹h)，100mhz(¹³c)，溶劑：cdcl3]。

化合物viii：(1r,4r,5s,6s,7r,8s,9r,10r,12s,13r)-1,6,12-三乙酰氧基-7-苯甲酰氧基-4,18；8,13-二環(huán)氧-新克羅烷-15,16-內(nèi)酯為無定形粉末，易溶于氯仿。經(jīng)hresi(+)ms(m/z651.2428[m+na]⁺，理論值651.2412)確定其分子式為c33h40o12；根據(jù)¹h，¹³c及二維核磁共振數(shù)據(jù)確定其結(jié)構(gòu)，骨架類型為克羅烷型，將其命名為scuteformoidh，其¹h和¹³cnmr數(shù)據(jù)歸屬見表3.[400mhz(¹h)，100mhz(¹³c)，溶劑：cdcl3]。

表1.化合物ii的¹h-nmr和¹³c-nmr數(shù)據(jù)[δ(ppm),j(hz)]

表2.化合物iii、iv、vi的¹h-nmr和¹³c-nmr數(shù)據(jù)[δ(ppm),j(hz)]

表3.化合物v、vii、viii的¹h-nmr和¹³c-nmr數(shù)據(jù)[δ(ppm),j(hz)]

實施例2

(1)將陰干的藍(lán)花黃芩全草(2.0kg)粉碎，用95％的乙醇溶液(4l)加熱50-60℃提取2次，每次提取3h，合并提取液，減壓濃縮得粗提物(約310g)；

(2)將步驟(1)得到的粗提物用適量的水(930ml)稀釋制成懸浮液后，依次用等體積的石油醚(930ml)萃取3次，合并石油醚相，減壓濃縮得浸膏(約22g)；

(3)將步驟(2)得到的浸膏，先經(jīng)減壓硅膠柱層析，采用石油醚-乙酸乙酯混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度分別為100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100，每個梯度收集兩個柱體積，根據(jù)極性大小分成10個組分，其中梯度100:0～90:10洗脫得到的為組分1，梯度90:10～80:20洗脫得到的為組分2，梯度80:20～70:30洗脫得到的為組分3，梯度70:30～60:40洗脫得到的為組分4，梯度60:40～50:50洗脫得到的為組分5，梯度50:50～40:60洗脫得到的為組分6，梯度40:60～30:70洗脫得到的為組分7，梯度30:70～20:80洗脫得到的為組分8，梯度20:80～10:90洗脫得到的為組分9，梯度10:90～0:100洗脫得到的為組分10，其中組分4先經(jīng)正相硅膠柱層析，洗脫劑為石油醚：乙酸乙酯＝15:1-5:1的混合溶劑，洗脫2-5個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為chcl3:meoh＝1:1的混合溶劑，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝55:45，依次得到化合物ii(20.2mg)、iv(2.6mg)、vi(11.0mg)，組分5先經(jīng)sephadexlh-20凝膠柱層析，洗脫劑為meoh，洗脫3-6個柱體積，減壓濃縮后再經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為meoh:h2o＝75:25，依次得到化合物iii(19.0mg)、viii(2.5mg)，組分6經(jīng)高效液相色譜hplc制備，色譜柱為watersc18，9.4×250mm，7μm，流速為2ml/min，流動相為mecn:h2o＝75:25，依次得到化合物vii(3.2mg)、v(2.9mg)。

化合物ii-viii的結(jié)構(gòu)確證數(shù)據(jù)與實施例1一致。

實施例3：藥理活性實驗

實驗材料

細(xì)胞：人體t淋巴細(xì)胞c8166、mt-4,實驗病毒株hiv-1iiib。

細(xì)胞培養(yǎng)液：含10％胎牛血清(fbs)，rpmi-1640完全培養(yǎng)基，2mml-谷氨酰胺，10mmhepes，100,000iu/l青霉素，50μm2-巰基乙醇，100μg/ml鏈霉素。

試劑：hepes(n-2(2-hydroxyothyl)piperazine-n′-(2-ethanesufonicacid),mtt[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide]、谷氨酰胺(glutamine)、青霉素(penicillin)、硫酸鏈霉素(streptomycinsulfate)均購自sigma公司；rpmi-1640和胎牛血清(fbs)為invitrogen公司產(chǎn)品；2-巰基乙醇(2-me,2-mercaptoethanol)為bio-rad公司產(chǎn)品；ldh試劑盒(takara)，poly(a)×[dt]15(roche)，3h-dttp(perkinelmer)，microscint^tmps(perkinelmer)。

實驗方法

hiv-1感染性滴定

將hiv-1iiib貯存液在96孔板上作4倍稀釋，分10個梯度，每梯度6個重復(fù)孔，同時設(shè)置對照孔6孔。每孔加入c8166細(xì)胞50μl，每孔終體積為200μl。在37℃,5％co2培養(yǎng)。第3天補加新鮮rpmi-1640完全培養(yǎng)基100μl，第7天在倒置顯微鏡下觀察每孔中hiv-1iiib誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,cpe)，以每孔是否有合胞體(syncytium)的形成確定；按reed&muench方法計算病毒的tcid50(50％tissuecultureinfectiondose)。

細(xì)胞毒性實驗

將4×10⁵個/mlc8166懸液100μl與不同的待測藥物溶液混合，設(shè)置3個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的對照孔，以azt為陽性藥物對照。在37℃，5％co2的條件下培養(yǎng)3天，采用mtt比色法檢測細(xì)胞毒性。elx800酶標(biāo)儀測定od值，測定波長為570nm。計算得到cc50值(50％cytotoxicconcentration)，即對50％的正常t淋巴細(xì)胞系c8166產(chǎn)生毒性時的藥物濃度。

hiv-1致細(xì)胞病變(cpe)的抑制實驗

將8×10⁵個/ml正常人體t淋巴細(xì)胞系c8166移取50μl/孔接種到含有100μl/孔梯度倍比稀釋藥物的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后滴加50μl的hiv-1iiib稀釋上清液，1300tcid50/孔，每孔終體積為200μl，設(shè)置3個重復(fù)孔。同時設(shè)置不含藥物的正常細(xì)胞對照孔，以azt為陽性藥物對照。在37℃，5％co2的條件下培養(yǎng)3天，倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)合胞體的形成。ec50(50％effectiveconcentration)為抑制合胞體形成50％時的化合物濃度。

統(tǒng)計方法

根據(jù)實驗結(jié)果，采用origin7.5繪制折線圖，按reed&muench法計算出樣品抑制病毒的50％有效濃度(ec50)，50％抑制細(xì)胞生長濃度(cc50)及抗hiv-1活性的治療指數(shù)ti值(therapeuticindex)為：ti＝cc50/ec50.

(1)細(xì)胞生長存活率(％)＝實驗孔o(hù)d值/對照孔o(hù)d值×100

(2)hiv-1致細(xì)胞病變的抑制率(％)＝(1-實驗孔合胞體數(shù)/對照孔合胞體數(shù))×10

實驗結(jié)果

對hiv-1致細(xì)胞病變的抑制作用結(jié)果見下表4.。結(jié)果表明藍(lán)花黃芩石油醚部位的乙醇粗提物表現(xiàn)出較好的抗hiv-1活性，從石油醚部位分離的新克羅烷型二萜對hiv-1病毒有微弱的抑制作用。

表4.本發(fā)明化合物ii-viii及步驟(1)得到的粗提物的抗hiv-1活性

^bti＝cc50/ec50.

^c陽性對照藥物:3'-疊氮-3'-脫氧胸苷。