一種用于檢測(cè)PRRSV歐洲株的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬繁殖與呼吸綜合征技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸 綜合征歐洲株病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，本發(fā)明還包括該試劑盒的使用方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬繁殖與呼吸綜合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS) 自二十世紀(jì)八十年代末期開始流行，1992年國際獸醫(yī)局正式命名，主要感染豬，尤其是母 豬，該病嚴(yán)重影響其生殖功能，臨床主要特征為流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱胎，呼吸困難，仔 豬死亡率高、感染豬出現(xiàn)免疫抑制等現(xiàn)象，因在發(fā)病過程中出現(xiàn)短暫性的兩耳皮膚紫紺，故 又稱為藍(lán)耳病。
[0003] 最早關(guān)于PRRSV起源的假說是PeterG.W、經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研究后提出的，他認(rèn)為 PRRSV可能起源于LDV(鼠乳酸脫氫酶病毒），LDV通過口服或傷口途徑野家鼠傳播至歐亞 野豬，在野豬體內(nèi)逐漸生存下來并進(jìn)行繁殖變成適應(yīng)性宿主。隨著美國引進(jìn)野豬最先將病 毒傳播至北卡羅來納州并生存下來，從此病毒就在歐洲和北美進(jìn)行各自獨(dú)立的變異、進(jìn)化。 經(jīng)過約70年變異、進(jìn)化，并從野豬群傳到了家豬群，也形成了目前的美洲型和歐洲型。與所 有的RNA病毒一樣，PRRSV具有高度的變異性，易形成一個(gè)異源的種群，因其基因序列及抗 原性的差異，目前PRRSV被分為歐洲株和美洲株。
[0004] 目前，國內(nèi)外就PRRSV的檢測(cè)方法而言，已有復(fù)合式RT-PCR方法，普通RT-PCR方 法，熒光定量RT-PCR方法，但是上述方法都是通用型的，只能檢測(cè)是否PRRSV感染，無法區(qū) 分哪種毒株感染引起，國內(nèi)也沒有針對(duì)歐洲株的檢測(cè)方法，國外檢測(cè)試劑檢測(cè)一份樣品的 價(jià)格往往是幾十元甚至上百元人民幣，成本過高使業(yè)主無法接受。所以導(dǎo)致接種疫苗存在 很大盲目性，進(jìn)而導(dǎo)致人們預(yù)防和監(jiān)測(cè)PRRS的難度加大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服目前國內(nèi)市面缺乏用于檢測(cè)歐洲株P(guān)RRSV的技 術(shù)手段的難題，提供一種能夠快速、敏感、準(zhǔn)確以及低成本的用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征 病毒歐洲株的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，本發(fā)明還提供該試劑盒的使用方法，本試 劑盒及使用方法還適用于檢測(cè)低微含量的豬繁殖與呼吸綜合征歐洲株病毒。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案：
[0007] -種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征歐洲株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR試劑 盒，包括OneSt印RT-PCRbuffer、酶混合物、陽性對(duì)照、無RNA酶水、序列SEQIDNO: 1和 SEQIDN0:2的引物及SEQIDN0:3的探針引物的混合物。
[0008] 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDNO:2引物混合物的包括：
[0009] SEQIDN0:1 :上游引物AGGAAGAACCGAGCTAGTGACAAT;
[0010]SEQIDNO: 2:下游引物CATAAGGCGCTGGCTGATAGACC。
[0011] 探針引物序列為：
[0012] SEQ ID N0:3 :GCCGGCCTGAAGCAACTGGTGG。
[0013] 所述探針引物的5'端標(biāo)記物為FAM報(bào)告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記物為TAMRA淬滅熒光 基團(tuán)。
[0014] SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延長(zhǎng)的序列：
[0015]SEQIDN0:4(273bp)：
[0017] 所述陰性對(duì)照為無RNA/DNA酶水。
[0018] 所述陽性對(duì)照為含有PRRSV歐洲株基因序列的陽性質(zhì)粒pGM-273,其構(gòu)建方式如 下：
[0019] a.PRRSV歐洲株基因組RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit說明書進(jìn)行操作。 以提取的病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作為引物 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性50s，52°C退火40s，72°C延伸50s，共30個(gè)循 環(huán)；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產(chǎn)物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0020] b.PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[0021] PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板 上，37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒（小量）提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列 測(cè)定正確的質(zhì)粒命名pGM-273,應(yīng)用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為 367ng/ul，計(jì)算出其拷貝數(shù)為1. 17X10n(C〇pies/Ul，拷貝數(shù)/微升），本發(fā)明的試劑盒利用 1. 17xl06(C〇pies/ul)濃度的質(zhì)粒作為陽性對(duì)照以及利用其倍比稀釋后制作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022] 本發(fā)明還提供了所述試劑盒用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征歐洲株病毒時(shí)的使用 方法，包括以下步驟：
[0023]a.使用本檢測(cè)試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件如下：42°C反轉(zhuǎn)錄5min;94°C預(yù) 變性 2min;94°C20s，退火溫度 52°C30s，72°C20s，40 個(gè)循環(huán)；
[0024]b.結(jié)果分析
[0025] 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果判定，判定標(biāo)準(zhǔn)為：在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性； Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù)檢測(cè)；再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值多35為陰 性；也可以依擴(kuò)增得到的Ct值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0026] 上述使用本試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系如下：
[0027]a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；
[0028]b.弓丨物濃度均為lOpmol/μ1的三條引物混合液3份，其中273bp上游引物1份， 273bp下游引物1份，探針引物1份；
[0029]c.酶混合物1份；
[0030]d.無RNA/DNA酶水 5· 5 份；
[0031] e.提取樣品的RNA模板3份；
[0032] f.陽性對(duì)照pGM-273陽性質(zhì)粒3份；
[0033] g.陰性對(duì)照無DNA酶水3份。
[0034] 本發(fā)明針對(duì)歐洲型毒株基因特點(diǎn)設(shè)計(jì)了針對(duì)PRRSV歐洲株的檢測(cè)引物及探針，建 立了TaqmanReal-timeRT-PCR(探針法實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）檢測(cè)方法，優(yōu)化 并組裝成試劑盒，彌補(bǔ)了PRRSV歐洲株檢測(cè)技術(shù)上的欠缺。本發(fā)明的試劑盒在使用過程中 將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程在一步反應(yīng)中完成，省時(shí)、省力，成本較低，檢測(cè)時(shí)間由原來的4-5 小時(shí)縮短到現(xiàn)在的1-2小時(shí)，從而有利于快速檢測(cè)。同時(shí)本發(fā)明使用了探針法，使該方法與 普通PCR方法相比具有更高的準(zhǔn)確性，對(duì)模板濃度要求較低，可用于檢測(cè)低微含量的藍(lán)耳 病病毒；可以看到整個(gè)擴(kuò)增過程、擴(kuò)增效率、溶解溫度，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品直接 得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。因此，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始 拷貝數(shù)，進(jìn)行精確定量。本試劑盒具有高度特異，敏感和簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，有助于PRRSV歐洲株 的防控和隱性帶毒動(dòng)物的剔除，避免造成大范圍的傳染。另外，相比國外試劑盒，具有價(jià)格 優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明試劑盒及其使用方法適用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站及大中 小型養(yǎng)殖場(chǎng)等，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0035] 圖1.為本發(fā)明制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036] 圖2.為本發(fā)明樣本檢測(cè)圖。
[0037] 圖1中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)敘述
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 1、引物的設(shè)計(jì)和制備
[0041] 參照GenBank(基因庫）查找十株毒株，經(jīng)序列比對(duì)尋找每個(gè)序列上均保守的區(qū) ±或，選取保守區(qū)域并設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，一條探針引物，序列如下：
[0042] 擴(kuò)增引物序列為：
[0043] SEQIDN0:1 :上游引物AGGAAGAACCGAGCTAGTGACAAT
[0044] SEQIDN0:2 :下游引物CATAAGGCGCTGGCTGATAGACC
[0045] 探針引物序列為：
[0046] SEQIDNO:3：GCCGGCCTGAAGCAACTGGTGG
[0047] 上述引物由大連寶生物工程有限公司合成并進(jìn)行標(biāo)記。
[0048] 陽性對(duì)照：本發(fā)明試劑盒的陽性對(duì)照是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所構(gòu)建并 保存。
[0049] 2、制作陽性對(duì)照及其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0050] 陽性對(duì)照為含有PRRSV歐洲株基因序列的陽性質(zhì)粒pGM-273,其構(gòu)建方式如下：
[0051] a.PRRSV歐洲株基因組RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit說明書進(jìn)行操作。 以提取的病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作為引物 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性50s，52°C退火40s，72°C延伸50s，共30個(gè)循 環(huán)；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產(chǎn)物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0052] b. PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[0053]PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板 上，37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒（小量）提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列測(cè)定 正確的質(zhì)粒命名PGM-273,應(yīng)用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為367ng/ ul，并計(jì)算出拷貝數(shù)為1. 17xlOn (copies/ul，拷貝數(shù)/微升），將其10倍倍比稀釋后按照標(biāo) 準(zhǔn)曲線制作程序制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依標(biāo)準(zhǔn)曲線將1. 17xl06(copies/ul)濃度的質(zhì)粒作為陽性 對(duì)照。
[0054] 3、制備用于檢測(cè)10頭份的試劑盒
[0055] 本試劑盒由以下組分組成：
[0056]a.OneStepRT-PCRbuffer：125μ1；
[0057]b.引物濃度均為lOpmol/μΙ的三條引物混合液30μ1，其中273bp上游引物 10yl，273bp下游引物10μ1，探針引物10μ1;
[0058]c.酶混合物10 μ 1 ;
[0059]d.無RNA/DNA酶水100 μ 1 ;
[0060]e.陽性對(duì)照pGM-273陽性質(zhì)粒30μ1。
[0061] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征歐洲株病毒
[0062] (l)PCR總體系為25μ1。分別將本發(fā)明試劑盒中：0neSt印RT-PCRbuffer: 12. 5μ1、三條引物共3μ1、酶混合物1μ1、無RNA/DNA酶水5. 5μ1、提取樣品的RNA模板 3μ1、陽性對(duì)照pGM-273陽性質(zhì)粒3μ1、陰性對(duì)照無RNA/DNA酶水3μ1，加入到0. 2ml擴(kuò)增 管中。
[0063] (2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽性對(duì)照3μ1、從歐洲株弱毒疫苗免疫豬肺臟