一種用于檢測(cè)PRRSV缺失變異株的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒技術(shù)領(lǐng)域，具體說(shuō)是一種用于檢測(cè)豬繁 殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，本發(fā)明還包括該試 劑盒的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 自二十世紀(jì)八十年代末期開始流行，1992年國(guó)際獸醫(yī)局正式命名，主要感染豬，尤其是母 豬，該病嚴(yán)重影響其生殖功能。研究人員從流行毒株缺失變異和豬繁殖與呼吸綜合征發(fā)生 時(shí)間順序以及出現(xiàn)頻率推測(cè)，所有高致病性豬藍(lán)耳病均來(lái)源于CH-la。流行病學(xué)資料也表明 所有HP-PRRSV中國(guó)分離毒株均具有相同的來(lái)源。高志強(qiáng)等和王旭榮等進(jìn)行流行病學(xué)分析 時(shí)發(fā)現(xiàn)，Nsp2序列各毒株間差異也不盡相同，HB-2(sh)/2002與VR-2332、BJ-4、CH-la同源 性為78. 3%~88. 9% ;Jiangxi-3與BJ-4、CH-la、HB-lJXAl、Henan-l同源性分別為77%、 88%、94. 7%、98. 5%、98.4%。田克恭等總結(jié)了區(qū)別于傳統(tǒng)毒株的高致病性流行毒株的特 點(diǎn)為：Nsp2基因第481位缺失"L"氨基酸，533~561位連續(xù)缺失29個(gè)氨基酸?；谏鲜?原因，有必要建立針對(duì)缺失變異毒株的病原檢測(cè)方法。本發(fā)明針對(duì)缺失變異毒株基因特點(diǎn) 設(shè)計(jì)、建立了Taqman Real-time RT-PCR(探針?lè)▽?shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)）檢測(cè)方 法，優(yōu)化并組裝成試劑盒。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外就PRRSV的檢測(cè)方法而言，已有復(fù)合式RT-PCR方法，普通RT-PCR方 法，熒光定量RT-PCR方法，但是上述方法都是通用型的，只能檢測(cè)是否PRRSV感染，無(wú)法區(qū) 分哪種毒株感染引起，國(guó)內(nèi)也沒(méi)有針對(duì)缺失變異株的檢測(cè)方法，國(guó)外檢測(cè)試劑檢測(cè)一份樣 品的價(jià)格往往是幾十元甚至上百元人民幣，成本過(guò)高使業(yè)主無(wú)法接受。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服目前生產(chǎn)實(shí)踐中沒(méi)有針對(duì)缺失變異株P(guān)RRSV的 檢測(cè)方法的不足，提供一種用于能夠快速、敏感、準(zhǔn)確以及低成本地檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合 征病毒缺失變異株的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒。本發(fā)明還提供該試劑盒的使用方 法，本試劑盒及使用方法還適用于檢測(cè)低微含量的豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒。
[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案：
[0006] -種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR 試劑盒，所述試劑盒包含OneStepRT-PCRbuffer、酶混合物、陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)RNA酶水、序列 SEQIDN0:1和SEQIDN0:2的引物及SEQIDN0:3的探針引物的混合物。
[0007] 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:2引物混合物的包括：
[0008] SEQIDN0:1 :上游引物AGCACCGCGTAGAACTGTGACAA
[0009] SEQIDN0:2 :下游引物CAAGGCCCGCCAGAGTCG
[0010] 探針引物序列為：
[0011] SEQIDN0:3：AACGCTGACGCACCAGGATGAGCC
[0012] 所述探針引物的5'端標(biāo)記物為FAM報(bào)告熒光基團(tuán)、3'端標(biāo)記物為TAMRA淬滅熒光 基團(tuán)。
[0013] SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延長(zhǎng)的序列：
[0014] SEQIDN0:4(286bp)：
[0016] 所述陰性對(duì)照為無(wú)RNA酶水。
[0017] 所述陽(yáng)性對(duì)照為含有PRRSV缺失變異株基因序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-286,其構(gòu)建方 式如下：
[0018]a.PRRSV缺失變異株基因組RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit說(shuō)明書進(jìn)行操 作。以提取的病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以SEQIDNO: 1及SEQIDNO: 2作為 引物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性50s，54°C退火40s，72°C延伸50s，共30 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產(chǎn)物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0019] b.PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[0020] PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板 上，37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒（小量）提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列測(cè)定 正確的質(zhì)粒命名PGM-286,應(yīng)用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為358ng/ ul，計(jì)算出其拷貝數(shù)為1. 13xlOn(copies/ul)，本發(fā)明的試劑盒利用1. 13xl07(copies/ul) 濃度的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照以及10倍梯度比稀釋后作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021] 本發(fā)明還提供了所述試劑盒用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒的使 用方法，包括以下步驟：
[0022] 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，反應(yīng)體系如下：
[0023]a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；
[0024]b.弓丨物濃度均為lOpmol/μ1的三條引物混合液3份，其中286bp上游引物1份， 286bp下游引物1份，探針引物1份；
[0025] c.酶混合物1份；
[0026]d.無(wú)RNA/DNA酶水 5. 5 份；
[0027]e.提取樣品的RNA模板3份；
[0028]f.陽(yáng)性對(duì)照pGM-286陽(yáng)性質(zhì)粒3份；
[0029]g.陰性對(duì)照無(wú)DNA酶水3份。
[0030] 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，擴(kuò)增條件如下：
[0031] 42°(：反轉(zhuǎn)錄5!1^11;94°(：預(yù)變性21^11;94 1€2〇8，退火溫度541€3〇8,721€2〇8,40個(gè) 循環(huán)。
[0032] 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)為：
[0033] 在NTC沒(méi)有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽(yáng)性；Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù) 檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值〈35為陽(yáng)性，Ct值多35為陰性。也可以依擴(kuò)增得到的Ct值 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0034] 本發(fā)明彌補(bǔ)了PRRSV缺失變異株檢測(cè)上的薄弱環(huán)節(jié)，與普通RT-PCR方法相比，本 發(fā)明省時(shí)、省力，成本較低，并且比普通PCR的靈敏度高，對(duì)模板濃度要求較低，可用于檢測(cè) 低微含量的藍(lán)耳病病毒；無(wú)需電泳就可直觀的反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果，避免了溴化乙錠對(duì)人體健康 的危害；本發(fā)明在檢測(cè)過(guò)程中將反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過(guò)程在一步反應(yīng)中完成，使得檢測(cè)時(shí)間 由原來(lái)的4-5小時(shí)縮短到現(xiàn)在的1-2小時(shí)，從而有利于快速檢測(cè)。同時(shí)本發(fā)明使用了探針 法，只有探針引物特異的結(jié)合到擴(kuò)增的靶序列上時(shí)才會(huì)產(chǎn)生有效的結(jié)果，因此具有高度特 異，敏感和簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。使該方法與普通PCR方法相比具有更高的準(zhǔn)確性，有助于PRRSV 缺失變異株的防控和隱性帶毒動(dòng)物的剔除，避免造成大范圍的傳染。所述熒光定量方法可 以看到整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程、擴(kuò)增效率、溶解溫度，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品直接得到標(biāo)準(zhǔn)曲 線，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)，對(duì)樣品中 病毒含量進(jìn)行精確定量。本發(fā)明試劑盒及其使用方法適用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單 位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場(chǎng)等，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1為本發(fā)明制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036] 圖2為本發(fā)明樣本檢測(cè)圖。
[0037]圖1中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。縱坐標(biāo)代表CT值。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)敘述
[0039] 實(shí)施例1
[0040]1、引物的設(shè)計(jì)和制備
[0041] 參照GenBank(基因庫(kù)）查找PRRSV變異株毒株十株，經(jīng)序列比對(duì)尋找變異株特定 區(qū)域中的保守區(qū)段，選取該片段并設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，一條探針引物，序列如下：
[0042] 擴(kuò)增引物序列為：
[0043]SEQ ID N0:1 :上游引物AGCACCGCGTAGAACTGTGACAA
[0044] SEQ ID N0:2 :下游引物CAAGGCCCGCCAGAGTCG
[0045] 探針引物序列為：
[0046] SEQ ID NO:3 ：AACGCTGACGCACCAGGATGAGCC
[0047] 上述引物由大連寶生物工程有限公司合成并進(jìn)行標(biāo)記。
[0048] 陽(yáng)性對(duì)照：本發(fā)明試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所構(gòu)建并 保存。
[0049]2、制作陽(yáng)性對(duì)照及其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0050] 陽(yáng)性對(duì)照為含有PRRSV缺失變異株基因序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-286,其構(gòu)建方式如 下：
[0051] a. PRRSV缺失變異株基因組RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit說(shuō)明書進(jìn)行操 作。以提取的病毒RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作為 引物擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性50s，54°C退火40s，72°C延伸50s，共30 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產(chǎn)物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0052] b. PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[0053]PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板 上，37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒（小量）提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列測(cè)定 正確的質(zhì)粒命名PGM-286,應(yīng)用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為358ng/ ul，并計(jì)算出拷貝數(shù)為1. 13X10n(C〇pies/Ul)，將其10倍倍比稀釋后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作程 序制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，依標(biāo)準(zhǔn)曲線將1. 13xl07(copies/ul)濃度的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。
[0054] 3、制備用于檢測(cè)10頭份的試劑盒
[0055] 本試劑盒由以下組分組成：
[0056]a.OneStepRT-PCRbuffer：125μ1；
[0057] b.引物濃度均為lOpmol/ μ 1的三條引物混合液30 μ 1，其中286bp上游引物 10yl，286bp下游引物10μ1，探針引物10μ1 ;
[0058]c.酶混合物10 μ 1 ;
[0059]d.無(wú)RNA/DNA酶水100 μ 1 ;
[0060]e.陽(yáng)性對(duì)照pGM-286陽(yáng)性質(zhì)粒30 μ 1。
[0061] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒
[0062](1) PCR總體系為25 μ 1。分別將本發(fā)明試劑盒中One St印RT-PCR buffer : 12. 5 μ 1、三條引物共3 μ 1、酶混合物1 μ 1、無(wú)RNA/DNA酶水5. 5 μ 1、提取樣品的RNA模板 3 μ 1、陽(yáng)性對(duì)照pGM-286陽(yáng)性質(zhì)粒3 μ 1、陰性對(duì)照無(wú)DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml擴(kuò)增管中。
[0063] (2)分別向上述擴(kuò)增管中加入陽(yáng)性對(duì)照3μ1、從具有高熱癥狀的流行豬