一種用于檢測(cè)豬瘟病毒流行株的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及豬攝病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體說是一種用于檢測(cè)豬攝流行株病毒的 化qmanReal-timeRT-PCR試劑盒，本發(fā)明還包括該試劑盒的使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬攝（Classicalswinefever,CSFO是由豬攝病毒（Hogcholeralapinized virus,肥LV)或Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病，是 危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（01巧將其列入0IE名錄，我國(guó)將其 列為一類傳染病。近年來，我國(guó)豬攝的流行和發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了很大的變化，在臨床表現(xiàn)上趨 于非典型化，主要表現(xiàn)為隱性帶毒和慢性感染，成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一大隱患。石口株是 1945年在我國(guó)分離到的強(qiáng)毒流行株，也是我國(guó)攻毒用的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株，與兔化弱毒株同屬于 1. 1亞型，運(yùn)2株病毒的核巧酸和氨基酸具有很高的同源性。但是豬攝弱毒疫苗在中國(guó)的大 規(guī)模應(yīng)用使豬攝流行毒感染和疫苗接種的區(qū)分變得非常困難。另外，母源抗體干擾和免疫 程序錯(cuò)誤導(dǎo)致的免疫耐受也會(huì)引起CSF爆發(fā)。因此，急需建立一種可W準(zhǔn)確診斷豬攝流行 毒株感染與疫苗接種的敏感、特異、重復(fù)性好的檢測(cè)方法。
[0003] 目前，用于檢測(cè)豬攝病毒的方法有多種，如病毒的分離鑒定、免疫過氧化物酶單層 試驗(yàn)（IPMA)、間接免疫巧光試驗(yàn)（IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)巧LISA)和血清中和試驗(yàn)（SN)、 免疫膠體金技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR)、實(shí)時(shí)巧光定量PCR和基因探針等。巧 光定量PCR方法是近年來迅速發(fā)展起來的一種分子生物學(xué)方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、 重復(fù)性好、自動(dòng)化程序高、定量檢測(cè)微生物核酸拷貝數(shù)等優(yōu)點(diǎn)。但是上述方法都是通用型 的，只能檢測(cè)是否CSFV感染，無(wú)法區(qū)分檢測(cè)到的毒株是疫苗株，還是田間流行毒株感染引 起，另外，運(yùn)些方法都存在或操作復(fù)雜或敏感性低或漏檢、假陽(yáng)性等問題。導(dǎo)致接種疫苗存 在盲目性，進(jìn)而加大了預(yù)防和監(jiān)測(cè)CSFV的難度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服目前國(guó)內(nèi)市面缺乏用于準(zhǔn)確鑒別診斷豬攝流行 毒感染與疫苗接種的特異性檢測(cè)的技術(shù)手段的難題，提供一種能夠快速、敏感、準(zhǔn)確W及低 成本的用于檢測(cè)豬攝病毒流行株的化qmanReal-timeRT-PCR試劑盒，本發(fā)明還提供該試 劑盒的使用方法，本試劑盒及使用方法還適用于檢測(cè)低微含量的豬攝病毒流行株病毒。
[0005] 為解決上述問題，本發(fā)明采用了下述技術(shù)方案：
[0006] -種用于檢測(cè)豬攝流行株病毒的化qmanReal-timeRT-PCR試劑盒，所述試劑盒 包含化eStepRT-PCRbuffer、酶混合物、陽(yáng)性對(duì)照、無(wú)RNA酶水、序列沈QIDN0:1和沈Q IDNO:2的引物及沈QIDNO:3的探針引物的混合物。
[0007] 所述序列沈QIDNO: 1至沈QIDNO:2的引物混合物包括：
[0008] 沈QIDN0:1 :上游引物GGACCCTATTGTAGATAACACTAATTTTT
[0009]沈QIDN0:2 :下游引物TTACCTTAGTCCAACTGTGGACGT
[0010] 探針引物序列為：
[0011]沈QIDN0:3:ATTTATTTAGGTATTACTATTTATTTATTTATTTATTTATTGAATGAG
[0012] 所述探針引物的5'端標(biāo)記物為FAM報(bào)告巧光基團(tuán)、3'端標(biāo)記物為TAMRA澤滅巧光 基團(tuán)。
[001引SEQIDNO: 1至沈QIDNO:2的由5'端向3'端延長(zhǎng)的序列：
[0014]沈QIDN0:4(180bp):
[0015]ggaccctattgtagataacactaatttttatttatttaggtattactatttatttatttatttatttat tg曰曰tg曰gt曰曰g曰曰ctggt曰c曰曰曰ct曰cctc曰曰gtt曰cc曰c曰ct曰c曰etc曰ttttt曰曰c曰gc曰cttt曰gctgg曰曰gg曰曰曰曰ttcctg曰cgtcc曰c曰gttgg曰ct曰曰ggt曰曰ο
[0016] 所述陰性對(duì)照為無(wú)RNA酶水。
[0017] 所述陽(yáng)性對(duì)照為含有豬攝流行株基因序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-180,其構(gòu)建方式如 下：
[0018]a.豬攝流行株基因組RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit說明書進(jìn)行操作。 W提取的病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。WSEQIDN0:l及SEQIDN0:2作為引物 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性50s，51°C退火40s，72°C延伸50s，共30個(gè)循 環(huán)；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產(chǎn)物于lOg/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[0019]b.PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[0020] PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含lOOmg/L氨節(jié)青霉素的LB平板 上，37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒（小量）提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列 測(cè)定正確的質(zhì)粒命名pGM-180,應(yīng)用Nano化OP2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為 286ng/ul，計(jì)算出其拷貝數(shù)為9. 2xl〇i°(copies/ul，拷貝數(shù)/微升），本發(fā)明的試劑盒利用 9. 2xl〇e(copies/ul)濃度的質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照W及利用其倍比稀釋后制作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021] 本發(fā)明還提供了所述試劑盒的使用方法，包括W下步驟：
[0022] 實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR，擴(kuò)增條件如下：
[0023] 42°(：反轉(zhuǎn)錄5111111;94°(：預(yù)變性2111111;941：2〇3，退火溫度511：3〇3,721：2〇3,40個(gè) 循環(huán)。
[0024] 根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，判定標(biāo)準(zhǔn)為：
[00巧]在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值<35判為陽(yáng)性；Ct值介于35-40為可疑，需重復(fù) 檢測(cè)。再次測(cè)定時(shí)該樣品Ct值<35為陽(yáng)性，Ct值>35為陰性。也可W依擴(kuò)增得到的Ct值 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
[0026] 使用所述試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)巧光定量RT-PCR，反應(yīng)體系如下：
[0027]a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；
[002引b.引物濃度為1化mol/μ1的Ξ條引物混合液3份，其中180bp上游引物1份， 180bp下游引物1份，探針引物1份；
[002引 C.酶混合物1份；
[0030]d.無(wú)RNA/DNA酶水 5. 5 份；
[0031]e.提取樣品的RNA模板3份；
[003引f.陽(yáng)性對(duì)照pGM-180陽(yáng)性質(zhì)粒3份；
[003引 g.陰性對(duì)照無(wú)DNA酶水3份。
[0034] 本發(fā)明彌補(bǔ)了CSFV鑒別診斷上的薄弱環(huán)節(jié)，設(shè)計(jì)了特異性針對(duì)豬攝強(qiáng)毒株的引 物及探針，優(yōu)化并組裝成試劑盒，具有高度特異、敏感、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。在使用過程中將 反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程在一步反應(yīng)中完成，使得檢測(cè)時(shí)間由原來的4-5小時(shí)縮短到現(xiàn)在的 1-2小時(shí)，從而有利于快速檢測(cè)。與普通PCR相比，靈敏度高，對(duì)模板濃度要求較低，可用于 檢測(cè)低微含量的豬攝病毒，無(wú)需電泳就可直觀的反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果，避免了漠化乙錠對(duì)人體健 康的危害。本發(fā)明使用了探針法，只有探針引物特異的結(jié)合到擴(kuò)增的祀序列上時(shí)才會(huì)產(chǎn)生 有效的結(jié)果，巧光定量可W看到整個(gè)擴(kuò)增過程、擴(kuò)增效率、溶解溫度，而且利用已知起始拷 貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品直接得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該 樣品的起始拷貝數(shù)，進(jìn)行精確定量。本發(fā)明有助于豬攝流行株的防控和隱性帶毒動(dòng)物的剔 除，避免造成大范圍的傳染。所述使用方法適用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級(jí)防控單位、獸醫(yī)站 及大中小型養(yǎng)殖場(chǎng)等，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0035]圖1.為本發(fā)明制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0036] 圖2.為本發(fā)明樣本檢測(cè)圖。
[0037]圖1中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表CT值。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)敘述
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 1、引物的設(shè)計(jì)和制備
[0041] 參照GenBank(基因庫(kù)）查找十株毒株，經(jīng)序列比對(duì)尋找每個(gè)序列上均保守的區(qū) 域，選取保守區(qū)域并設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，一條探針引物，序列如下：
[0042] 擴(kuò)增引物序列為：
[0043]沈QIDN0:1 :上游引物GGACCCTATTGTAGATAACACTAATTTTT
[0044]SEQIDN0:2:下游引物TTACCTTAGTCCAACTGTGGACGT [004引探針引物序列為：
[0046]沈QIDN0:3:ATTTATTTAGGTATTACTATTTATTTATTTATTTATTTATTGAATGAG
[0047] 上述引物由大連寶生物工程有限公司合成并進(jìn)行標(biāo)記。
[004引陽(yáng)性對(duì)照：本發(fā)明試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所構(gòu)建并 保存。
[0049]2、制作陽(yáng)性對(duì)照及其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0050] 陽(yáng)性對(duì)照為含有豬攝流行株基因序列的陽(yáng)性質(zhì)粒pGM-180,陽(yáng)性質(zhì)粒構(gòu)建方式如 下：
[0051]a.豬攝流行株基因組RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit說明書進(jìn)行操作。 W提取的病毒RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。WSEQIDN0:l及SEQIDN0:2作為引物 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min;94°C變性50s，51°C退火40s，72°C延伸50s，共30個(gè)循 環(huán)；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產(chǎn)物于lOg/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定。
[005引b. PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析
[005引PCR產(chǎn)物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物與pGEM-TEasy載體連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含lOOmg/L氨節(jié)青霉素的LB平板 上，37°C培養(yǎng)12~16h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用質(zhì)粒（小量）提取試劑盒提取質(zhì)粒，將序列測(cè)定 正確的質(zhì)粒命名pGM-180,應(yīng)用Nano化OP2000核酸蛋白分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度為286ng/ ul，并計(jì)算出拷貝數(shù)為9. 2xl0i° (copies/ul，拷貝數(shù)/微升），將其10倍倍比稀釋后按照標(biāo) 準(zhǔn)曲線制作程序制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。依標(biāo)準(zhǔn)曲線將9.2xl06(copies/ul)濃度的質(zhì)粒作為陽(yáng)性 對(duì)照。
[0054] 3、制備用于檢測(cè)10頭份的試劑盒
[0055] 本試劑盒由W下組分組成：
[0056]a.One StepRT-PCRbuffer:125μ1;
[0057] b.引物濃度均為1化mol/μL的Ξ條引物混合液30μ1，其中180bp上游引物 10μ1，180bp下游引物10μ1，探針引物10μ1;
[005引 C.酶混合物10μ1;
[0059]d.無(wú)RNA/DNA酶水 100μ1;
[0060]e.陽(yáng)性對(duì)照pGM-180陽(yáng)性質(zhì)粒30μ1。
[0061] 4、用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)豬攝流行株病毒
[0062] (1)PCR總體系為25μ1。分別將本發(fā)明試劑盒中OneSt巧RT-PCRbuffer: 12. 5μ1、Ξ條引物共3μ1、酶混合物1