分子標記豬瘟病毒弱毒疫苗的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，旨在提供一種分子標記豬瘟病毒弱毒疫苗的構(gòu)建方法。本發(fā)明以含有豬瘟病毒疫苗C株基因組5’半長的重組質(zhì)粒pA?F123和含有BVDV VEDEVAC株Erns基因的重組質(zhì)粒pE?B?Erns為模板，在兩端設(shè)計20bp同源片段，使用一步定向克隆試劑盒，獲得重組pA?B?Erns?F123質(zhì)粒；用BamH I和Sal I將含有豬瘟病毒疫苗C株基因組3’半長的F456片段從重組質(zhì)粒pB?F456中切下，克隆于相同酶作用的pA?B?Erns?F123中，獲得重組質(zhì)粒pA?B?Erns?FL。本發(fā)明的反向遺傳操作技術(shù)的建立為研究CSFV基因功能和新型疫苗開辟了新的途徑。利用反向遺傳操作技術(shù)將外源標簽插入病毒基因組可以用來研究病毒的復(fù)制、病毒編碼蛋白的功能及抗病毒藥物的篩選，使用RNA聚合酶Ⅱ系統(tǒng)能夠高效和穩(wěn)定地拯救豬瘟病毒感染性cDNA克隆。
【專利說明】
分子標記豬瘟病毒弱毒疫苗的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分子標記豬瘟病毒弱毒疫苗的構(gòu)建方 法，屬于攜帶牛病毒性腹瀉病毒Erns基因的重組豬瘟病毒的拯救和應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬痕（Classical Swine Fever，CSF)是由豬痕病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種接觸性、致死性傳染病，以高熱和出血為其典型特征，發(fā)病率和死 亡率極高，被世界動物衛(wèi)生組織(0ΙΕ)列為必須申報的動物疫病。豬瘟對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重， 常造成巨大經(jīng)濟損失。
[0003] CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)的成員，CSFV基因組為單 股正鏈線性RNA分子，基因組大小為12.3kb，兩端分別為Y端非翻譯區(qū)（Untranslated Region，UTR)和3'端UTR，中間包含一個大的開放閱讀框(Open Reading Frame，0RF)，其中 0RF編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白。該多聚蛋白在病毒感染的宿主細胞內(nèi)， 受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解為11種病毒特異性蛋白，包括4種病毒結(jié)構(gòu) 蛋白（C、Erns、El和E2)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白[1]，其中誘導(dǎo)機體產(chǎn)生抗體的蛋白主要是E2和 Erns〇
[0004]牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)與豬痕病毒同為痕病毒屬病毒，囊膜蛋白gp48又可稱E0 或Erns，由227個氨基酸組成，含9個糖基化位點的蛋白，并具有T2RNases活性[2]，其生物學 活性與豬瘟病毒Erns具有很多類似之處。經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)Erns保守性高，且其上有 中和表位，可用其研究基因工程疫苗，也可作為基因工程診斷抗原。
[0005] 目前，豬瘟疫情的防控主要是對感染豬進行嚴格撲殺和對周邊地區(qū)進行消毒，在 許多國家和地區(qū)，疫苗免疫依然是控制豬瘟的重要手段，而由我國1954年研發(fā)的基因1型豬 瘟兔化弱毒C株疫苗使用最為廣泛。在相當長時間內(nèi)，由于其性能穩(wěn)定、免疫效果好，被國內(nèi) 外公認為安全有效的弱毒疫苗。但該疫苗存在一定缺陷：疫苗免疫后不能區(qū)分誘導(dǎo)的抗體 為免疫動物還是野毒感染。因此，改造和開發(fā)能夠進行鑒別診斷的新型標記豬瘟弱毒疫苗 以及配套的鑒別檢測方法成為熱點。其中，歐盟多個實驗室聯(lián)合開發(fā)的以BVDV CP7株為骨 架，將E2基因替換為CSFV Alfort/187株E2基因的重組疫苗CP7-E2alf以及血清學檢測方法 已經(jīng)走在前列[3]。然而，由于其骨架為BVDV，免疫后針對BVDV Erns抗體水平低，鑒別診斷 還有一定難度，其次，免疫后細胞免疫水平可能不及C-Strain，無法用于緊急免疫，最后，其 插入E2基因所屬毒株并不在中國流行，引入存在極大生物安全隱患，因此，開發(fā)和研制適 合我國豬瘟流行實際情況的新型分子標記疫苗迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種構(gòu)建分子標記豬 瘟病毒弱毒疫苗的方法。
[0007] 為解決技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0008] 提供一種分子標記豬瘟病毒弱毒疫苗的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
[0009] (1)擴增牛病毒性腹瀉病毒中Erns基因編碼區(qū)的片段；
[0010] (2)利用步驟(1)的序列擴增帶有20bp豬瘟病毒疫苗C株同源區(qū)序列的片段；
[0011] (3)以重組質(zhì)粒PA-F123為模板，反向融合PCR獲得缺失豬瘟病毒疫苗C株Erns的基 因組5'半長；
[0012] (4)利用一步定向克隆將步驟(1)和(2)所獲得的片段連接到步驟(3)所得質(zhì)粒，獲 得攜帶有BVDV Erns的C株基因組5'半長的重組pA-B-Erns-F123質(zhì)粒；
[0013] (5)將含有豬瘟病毒疫苗C株基因組3'半長的F456片段從重組質(zhì)粒pB-F456中切 下，克隆于相同酶作用的步驟(4)所得質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pA-B-Erns-FL;
[0014] (6)將步驟(5)中獲得的重組全長感染性克隆質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄為RNA，電轉(zhuǎn)至宿主細 胞，收獲具有感染性的子代病毒粒子并命名為RecC-B-Erns，該子代病毒粒子即為分子標記 豬痕病毒弱毒疫苗。
[0015] 本發(fā)明中，在步驟⑴中擴增牛病毒性腹瀉病毒的Eras基因編碼區(qū)的片段時，使用 下述兩條特異性引物通過RT-PCR擴增cDNA片段：
[0016] 上游引物：5 ' -GAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA;和
[0017] 下游引物：5 ' -TGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。
[0018] 本發(fā)明中，所述步驟（2)是將CSFV⑶RE蛋白C端和E1蛋白N端20bp堿基引入BVDV Erns片段中，并使用下述兩條特異性引物擴增攜帶有該同源片段的序列：
[0019] 上游引物：
[0020] 5;-TGTACCAACCAGTTGAAGCCGAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA；
[0021] 和下游引物：
[0022] 5，-ACATTACAGTAAGGCGATAGTGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。
[0023]本發(fā)明中，所述步驟(3)是使用下述兩條特異性引物進行擴增的：
[0024] 上游引物：5，-CTATCGCCTTACTGTAATGTAACAAGCAAGATA;和
[0025] 下游引物：5 ' -GGCTTCAACTGGTTGGTACAACATAATTG。
[0026]本發(fā)明中，所述步驟(5)中將含有豬瘟病毒疫苗C株基因組3'半長的F456片段從重 組質(zhì)粒PB-F456中切下時，使用的是限制性內(nèi)切酶BamHI和Sal頂每。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0028] 1、本發(fā)明的反向遺傳操作技術(shù)的建立為研究CSFV基因功能和新型疫苗開辟了新 的途徑。利用反向遺傳操作技術(shù)將外源標簽插入病毒基因組可以用來研究病毒的復(fù)制、病 毒編碼蛋白的功能及抗病毒藥物的篩選，使用RNA聚合酶Π 系統(tǒng)已經(jīng)能夠高效和穩(wěn)定地拯 救豬瘟病毒感染性cDNA克隆。研究實例中，將豬瘟病毒C株Erns基因替換為BVDV基因型lb的 Erns基因并拯救獲得具有感染性的重組病毒，命名為RecC-B-Erns，為開發(fā)分子標記豬瘟弱 毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。
[0029] 2、本發(fā)明構(gòu)建的嵌合cDNA pA-B-Erns-FL，能夠快速收獲到具有感染性的子代病 毒粒子;拯救的重組病毒保留了 C株誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生定型熱反應(yīng)以及在兔體內(nèi)復(fù)制等特性，通 過對重組病毒第5、15和20代Erns測序發(fā)現(xiàn)嵌合基因未發(fā)生突變或者丟失現(xiàn)象，說明其遺傳 穩(wěn)定性較好;本發(fā)明還通過改變疫苗C株主要宿主免疫性抗原Erns的抗原性，誘導(dǎo)產(chǎn)生的血 清具有潛在的鑒別診斷價值。
【附圖說明】
[0030] 圖1為基于豬瘟病毒C株為骨架嵌合BVDV Erns基因 cDNA全長感染性克隆構(gòu)建示意 圖。
[0031] 圖2為基因擴增及酶切鑒定圖，Μ為Wide Range DNA Marker(500-15,000);其中A 泳道1為反向PCR擴增的線性化pA-F123,泳道2為BVDV-Erns基因；B泳道1為BamHI和Sail酶 切的質(zhì)粒pA-B-Erns-F123，泳道2為相同酶切的含有豬瘟病毒疫苗C株基因組3 '半長的重組 質(zhì)粒pB-F456;C泳道1為嵌合完成的重組質(zhì)粒pA-B-Erns-FL，泳道2為BamHI和Sail雙酶切鑒 定結(jié)果。
[0032] 圖3為體外轉(zhuǎn)錄RNA電轉(zhuǎn)PK細胞系后，間接免疫熒光(IFA)檢測病毒蛋白表達情況； 利用抗C-Strain E2的特異性單克隆抗體6B8檢測重組病毒連續(xù)傳代不同代次病毒蛋白的 表達情況，A、B、C分別為第1、5、10代重組病毒，D為第10代病毒上清感染ST細胞后，病毒蛋白 的表達情況。
[0033]圖4為重組病毒在ST細胞中生長曲線圖；A為細胞中RNA拷貝數(shù);B為不同時間點病 毒 TCID50。
[0034] 圖5為重組病毒RecC-B-Erns和商品化疫苗Vaccine C接種實驗動物兔后體溫變化 曲線。
[0035] 圖6為重組病毒RecC-B-Erns和親本C株全病毒多抗與C-Strain囊膜糖蛋白E2， Erns以及BVDV株囊膜糖蛋白Erns之間反應(yīng)性對比圖。其中，A為重組病毒RecC-B-Erns與C-Strain囊膜糖蛋白E2，Erns以及BVDV株囊膜糖蛋白Erns之間反應(yīng)性對比圖，B為親本C株全 病毒多抗與C-Strain囊膜糖蛋白E2，Erns以及BVDV株囊膜糖蛋白Erns之間反應(yīng)性對比圖。
【具體實施方式】
[0036]本發(fā)明通過將牛病毒性腹瀉病毒Erns基因替換至疫苗C株感染性克隆上，拯救獲 得重組豬瘟病毒，克服了現(xiàn)有技術(shù)中Erns改造后無法快速拯救子代病毒的不足。同時，本發(fā) 明還提供了基于Erns基因的可插入式豬瘟病毒cDNA載體構(gòu)建策略及應(yīng)用，在保留疫苗C株 在兔體內(nèi)復(fù)制且對豬無致病力等特性的基礎(chǔ)上，通過該重組嵌合方式快速拯救并獲得子代 病毒粒子。同時，該候選重組病毒能夠提供可靠的細胞和體液免疫，并具有潛在的鑒別診斷 價值。
[0037] 參考附圖，下面將對本發(fā)明進行詳細描述。
[0038] 實施例1: BVDV基因型lb的Erns基因的擴增。
[0039] 根據(jù)BVDV基因型lb的Erns基因序列，在兩端設(shè)計特異性引物：
[0040] B-E0-F：5-GAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA(SEQ ID NO：1)
[0041] B-E0-R：5-TGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT(SEQ ID NO：2)
[0042] BVDV lb型Erns基因序列參照GenBnak(Accesion N.KC695814)并合成。根據(jù)上述 設(shè)計的引物，擴增片段，并使用高保真酶擴增，獲得片段（圖2)。其中，引物名稱中B表示 BVDV，E0表示基因 Erns，F(xiàn)表示上游引物，R表示下游引物。獲得片段克隆于TransGen (全式 金)公司的pEASY-Blunt載體上，進行測序。
[0043] 實施例2:重組嵌合質(zhì)粒pA-B-Erns-F123的構(gòu)建。
[0044] 將CSFV CORE C端和E1N端20bp堿基引入BVDV Erns片段中，使用下述兩條特異性 引物擴增攜帶有該同源片段的序列。
[0045] 上游引物B-H-E〇-F(SEQ ID N0:3):
[0046] 5;-TGTACCAACCAGTTGAAGCCGAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA
[0047] 下游引物B-H-E〇-R(SEQ ID N0:4):
[0048] 5'-ACATTACAGTAAGGCGATAGTGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT
[0049] 其中，引物名稱中B表示BVDV，E0表示基因 Erns，H表示增加同源序列，F(xiàn)表示上游引 物，R表示下游引物。
[0050] 使用下述兩條特異性引物，以含有豬瘟病毒疫苗C株基因組5'半長的重組質(zhì)粒pA-F123為模板，擴增Erns以外的基因片段；
[0051 ]上游引物F123-F(SEQ ID N0:5):
[0052] 5;-CTATCGCCTTACTGTAATGTAACAAGCAAGATA
[0053] 下游引物F123-R(SEQ ID N0:6):
[0054] 5，-GGCTTCAACTGGTTGGTACAACATAATTG
[0055] 其中，引物名稱中F123表示重組質(zhì)粒pA-F123，F(xiàn)表示上游引物，R表示下游引物。
[0056] pA-F123為攜帶豬瘟病毒疫苗C株基因組的質(zhì)粒，pA表示低拷貝質(zhì)粒pACYC-177， F123表示豬瘟病毒疫苗C株基因組5'半長。
[0057] 利用Vazyme (諾唯贊）公司一步定向克隆試劑盒將上述PCR產(chǎn)物連接并轉(zhuǎn)化DH5a感 受態(tài)細胞，將陽性克隆該段擴增，獲得重組的pA-B-Erns-F123質(zhì)粒;產(chǎn)物測序與預(yù)期一致。 [0058] 實施例3:重組嵌合質(zhì)粒pA-B-Erns-FL全長cDNA的構(gòu)建。
[0059] (1)將含有豬瘟病毒疫苗C株基因組3'半長的F456片段用限制性內(nèi)切酶BamH I和 Sal I酶從重組質(zhì)粒pB-F456中切下，酶切產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后克隆于相同酶作用的pA-B-Erns-F123中，獲得攜帶BVDV Erns基因的感染性cDNA載體pA-B-Erns-FL，并用BamHI和Sail 酶切鑒定，大小一致（圖2);對含有全長cDNA的細菌進行連續(xù)傳代，第10代細菌抽提質(zhì)粒后 對替換區(qū)域進行測序，測序結(jié)果與預(yù)期一致。這一結(jié)果表明，通過本發(fā)明構(gòu)建的攜帶BVDV Erns基因的感染性cDNA載體在宿主菌內(nèi)是穩(wěn)定的。
[0060] 實施例4:重組嵌合病毒的拯救。
[00611 200ml LB培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)過夜的菌液500μ1，同時加入濃度為100mg/ml的 Amp200yl，37°C擴大培養(yǎng)12h。收集菌液后用Promega公司中量質(zhì)粒純化試劑盒抽提質(zhì)粒。經(jīng) 濃度測定的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Xhol進行線性化。線性化的質(zhì)粒經(jīng)純化后用MEGAscript體 外RNA合成試劑盒(Ambion公司）。體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA經(jīng)電泳檢測完整性和正確性。經(jīng)濃度 測定后存放于_80°C備用。
[0062]電轉(zhuǎn)前一天，將ST或PK-15細胞分瓶。電轉(zhuǎn)時，將前一天分瓶的細胞消化后，用PBS 洗滌細胞2次。將1~1.5yg上述RNA與細胞混勻后加入0.2cm的電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad公司）中，用 電轉(zhuǎn)儀Gene Pulser Xcell(Bi〇-Rad公司）進行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)參數(shù)為150V，500yF，電阻無窮。電 轉(zhuǎn)后用完全培養(yǎng)基將細胞重懸后加入培養(yǎng)瓶中，37°C，5%C02培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)后96h進行IFA鑒 定，結(jié)果顯示電轉(zhuǎn)不同RNA的細胞均可檢測到熒光信號，且呈典型戒指狀的核周圍染色（圖 3)。細胞經(jīng)胰酶消化后以1:4的比例繼續(xù)連續(xù)傳代培養(yǎng)。在檢測是否產(chǎn)生感染性子代病毒 時，將細胞_76°C/37°C反復(fù)凍融三次，離心去除細胞碎片后取上清接種新的ST或PK-15細 胞，37°C培養(yǎng)96h后IFA檢測（圖3D)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)錄的RNA在細胞內(nèi)能復(fù)制并合成病毒蛋白， 最終產(chǎn)生具有感染性的子代病毒，并命名為RecC-B-Erns，該子代病毒粒子即可作為分子標 記豬瘟病毒弱毒疫苗。這一結(jié)果表明通過本發(fā)明用BVDV Erns基因替換疫苗C株的Erns基 因并不影響重組病毒在細胞內(nèi)RNA的復(fù)制、蛋白的合成以及子代病毒的包裝和釋放。
[0063]實施例5:重組嵌合病毒在ST細胞中生長曲線。
[0064]在24孔板中接入2 X 105/孔的ST細胞，待長成70 %融合度后，分別接種RecCpp40 (第40代C株重組病毒）、RecC-B-Erns各200個TCID5Q，每個病毒設(shè)置多個重復(fù)孔。待病毒吸附 1.5h后，加入生長培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。感染后不同時間點分別收集總培養(yǎng)物，細胞RNA以及培 養(yǎng)上清，直至感染后96h，樣品于-80°C保存。最后分別測定不同時間點的子代病毒TCID 50以 及病毒基因組拷貝數(shù)(圖4)。
[0065]實施例6:重組嵌合病毒在兔體內(nèi)的復(fù)制及抗體反應(yīng)性鑒定。
[0066] 將傳至第10代的重組病毒RecC-B-Erns，以103TCID5Q感染家兔，陽性對照組為豬瘟 病毒C株脾淋苗，陰性對照為MEM培養(yǎng)液。每天測量體溫3次，在感染后的24-72h可觀察到給 予重組病毒和陽性對照的三組兔子體溫升高（圖5)，且在感染后的第5天再次相同劑量的病 毒感染并沒有再次出現(xiàn)特異性升溫。而陰性對照組的家兔第一次沒有升溫，再次給予后出 現(xiàn)與實驗組之前類似的體溫反應(yīng)。
[0067]收集第28天RecC-B-Erns組和陽性對照組兔血清，利用間接ELI SA，分別與純化的 重組蛋白C-E2、C-Erns和BVDV-Erns反應(yīng)，結(jié)果表明重組病毒和疫苗C株產(chǎn)生的全病毒血清 與C-E2反應(yīng)性基本一致，同時，都能夠與兩種Erns蛋白反應(yīng)，存在交叉反應(yīng)性，但與同源 Erns蛋白反應(yīng)性顯著高于異源Erns蛋白，存在潛在鑒別意義。
[0068]還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上 實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián) 想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種分子標記豬瘟病毒弱毒疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 擴增牛病毒性腹瀉病毒中Erns基因編碼區(qū)的片段； (2) 利用步驟(1)的序列擴增帶有20bp豬瘟病毒疫苗C株同源區(qū)序列的片段； (3) 以重組質(zhì)粒pA-F123為模板，反向融合PCR獲得缺失豬瘟病毒疫苗C株Erns的基因組 5'半長； (4) 利用一步定向克隆將步驟（1)和(2)所獲得的片段連接到步驟(3)所得質(zhì)粒，獲得攜 帶有BVDV Erns的C株基因組5'半長的重組pA-B-Erns-F123質(zhì)粒； (5) 將含有豬瘟病毒疫苗C株基因組3'半長的F456片段從重組質(zhì)粒pB-F456中切下，克 隆于相同酶作用的步驟(4)所得質(zhì)粒中，獲得重組質(zhì)粒pA-B-Erns-FL; (6) 將步驟(5)中獲得的重組全長感染性克隆質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄為RNA，電轉(zhuǎn)至宿主細胞，收 獲具有感染性的子代病毒粒子并命名為RecC-B-Erns，該子代病毒粒子即為分子標記豬痕 病毒弱毒疫苗。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（1)中擴增牛病毒性腹瀉病毒的 Erns基因編碼區(qū)的片段時，使用下述兩條特異性引物通過RT-PCR擴增cDNA片段： 上游引物:5' -GAGAACATAACACAATGGAACCTACAAGATAATGGGA;和 下游引物：5 ' -TGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)是將CSFV CORE蛋白C端和El 蛋白N端20bp堿基引入BVDV Erns片段中，并使用下述兩條特異性引物擴增攜帶有該同源片 段的序列： 上游引物： 5 ltgtaccaaccagttgaagccgagaacataacacaatggaacctacaagataatggga; 和下游引物： 5'-ACATTACAGTAAGGCGATAGTGCATATGCCCCAAACCATGTCTTACTCT。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)是使用下述兩條特異性引物 進行擴增的： 上游引物：5' -CTATCGCCTTACTGTAATGTAACAAGCAAGATA;和 下游引物：5 ' -GGCTTCAACTGGTTGGTACAACATAATTG。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)中將含有豬瘟病毒疫苗C株基 因組3'半長的F456片段從重組質(zhì)粒pB-F456中切下時，使用的是限制性內(nèi)切酶BamHI和Sal I 酶。
【文檔編號】C12N15/40GK105886531SQ201610224932
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月12日
【發(fā)明人】方維煥, 廖迅, 李肖梁
【申請人】浙江大學