一種基于g-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)涉及一種基于G-四鏈體熒光特性的豬 瘟病毒檢測(cè)方法，及用于該豬瘟病毒檢測(cè)方法的試劑盒。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 豬瘟又稱(chēng)經(jīng)典豬瘟，是由豬瘟病毒(一種RNA病毒)引起豬的一種急性或慢性、熱性 和高度接觸性傳染病。豬瘟呈世界性分布，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。由于其危害性高，是 國(guó)際重點(diǎn)檢疫對(duì)象。在我國(guó)，每年由豬瘟導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元。目前，針對(duì)豬瘟 病毒核酸的檢測(cè)方法主要有熒光定量RT-PCR法。但這種診斷方法存在如試劑昂貴，容易污 染，對(duì)操作人員要求較高，需要價(jià)格昂貴的熒光定量PCR擴(kuò)增儀器等，嚴(yán)重阻礙了其在基層 的應(yīng)用。因此，如何快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢出豬瘟病毒是豬瘟病原檢測(cè)面臨的主要難題之一。
[0004] 近些年來(lái)，DNA中存在的G-四鏈體結(jié)構(gòu)引起了科學(xué)家廣泛的興趣。研究人員發(fā) 現(xiàn)，G -四鏈體結(jié)構(gòu)G -四鏈體結(jié)構(gòu)能與Hemin類(lèi)似結(jié)構(gòu)的原P卜啉（Protoporphyrin IX )、 鋅口卜啉（Zinc(II)-Protoporphyrin IX)等結(jié)合產(chǎn)生突光信號(hào)，可用于突光檢測(cè)。
[0005] 核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，即 NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification) 技術(shù)是一項(xiàng)以RNA為模板的快速等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)特別適用于RNA病毒的檢測(cè)。其 特點(diǎn)是整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程在恒溫條件下進(jìn)行，因此不需要特殊(如PCR儀）的控溫裝置。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)豬瘟病毒速度快、精確穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、檢測(cè)步驟 簡(jiǎn)單、成本低廉的基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)方法。
[0008] 本發(fā)明的目的在于提供的另一目的在于提供該基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病 毒檢測(cè)用試劑盒。
[0009] 本發(fā)明是通過(guò)采用如下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的。
[0010] 本發(fā)明的一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)方法，包括以下步驟： (I) NASBA擴(kuò)增：將純化好的豬瘟病毒RNA樣品加入到NASBA反應(yīng)緩沖液體系中，體 系包括0.5-1 μ M正向引物和0.5-1 μ M反向引物。反應(yīng)步驟：65°C變性后降溫，然后加入 NASBA酶反應(yīng)液進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，條件為：41 °C 90分鐘，得到RNA擴(kuò)增產(chǎn)物； 其中：NASBA反應(yīng)緩沖液體系包括NASBA反應(yīng)緩沖液、NASBA正向引物和反向引物； NASBA反應(yīng)緩沖液，包括：30-60mM Tris-HCl (PH8. 0) ; 60-80mM KCl ;10-30mM MgC12 ; 0.5-2mM脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs) ; 0.5-2mM核糖核苷三磷酸（NTPs) ;5-20mM二硫蘇 糖醇；5-20% (v/v)二甲基亞砜（DMSO); NASBA正向引物和反向引物，包括，0· 5-1 μ M正向引物（E2P7f ): ACTATGAGCCCAGGGACAG CTACTT ;0· 5-1 μ M 反向引物（E2P7T7r) :GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTCCCTATCAACACTAC CTCACCC T ； NASBA酶反應(yīng)液，包括：T7RNA聚合酶40-80U ;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2-10U ;RNA酶（RNAseH) 0· 05-0. 15U，0. 5-5μ g 的牛血清白蛋白（BSA); (2) G-四鏈體熒光檢測(cè)反應(yīng)：取G-四鏈體熒光檢測(cè)反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)緩沖液的組成包 括上游探針0. 5-2 μ M和下游探針0. 5-2 μ M，加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足為96 μ 1，加入2 μ 1的RNA 擴(kuò)增產(chǎn)物；然后85°C變性3 min后降溫；加入原卟啉0. 5-2 μ Μ，然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔酶 標(biāo)板中，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，以399nm波長(zhǎng)的光源激發(fā)，檢測(cè)610nm波長(zhǎng)處發(fā)射的熒光。如 果檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度高于3. OX IO7U即可判斷為豬瘟病毒陽(yáng)性國(guó)； 其中：G-四鏈體反應(yīng)緩沖液的組成包括：IOmM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，200mM的氯 化鈉和20mM的氯化鉀；上游探針0. 5-2 μ M和下游探針0. 5-2 μ M。
[0011] 上述的一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)方法，其中：G_四鏈體反應(yīng)緩 沖液中的上、下游探針包含4段GGG序列，該序列又被拆分為兩個(gè)部分：一個(gè)部分包含3段 GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1。
[0012] 上述的一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)方法，其中：G_四鏈體反應(yīng)緩 沖液中的探針包括，上游探針（E2- II -A) :GCTGATAGTGACCTACATTGGGTTGGGTTGGG ;下游探針 (E2-II -B) ：TGGGTGTTCTAACAGAAC AACTC0
[0013] 本發(fā)明的一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)用試劑盒，其組成為： (1) NASBA 反應(yīng)緩沖液包括：30-60mM Tris-HCl (PH8. 0) ; 6〇-80mM KCl ；10-30mM MgC12 ;0. 5-2mM脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs) ; 0. 5-2mM核糖核苷三磷酸（NTPs) ;5-20mM 二硫蘇糖醇；5-20% (v/v)二甲基亞砜（DMSO); (2) NASBA正向引物和反向引物包括，0.5-1 μΜ正向引物（E2P7f): ACTATGAGCCCAGGGACAG CTACTT ;0· 5-1 μ M 反向引物（E2P7T7r) :GTCGACTAATACGACTCACTATA GGGTTCCCTATCAAC ACTACCTCACCC T ； (3) NASBA酶反應(yīng)液包括：T7RNA聚合酶40-80U ;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2-10U ;RNA酶（RNAseH) 0· 05-0. 15U，0. 5-5μ g 的牛血清白蛋白（BSA); (4) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的上、下游探針包含4段GGG序列，該序列又被拆分為兩個(gè) 部分：一個(gè)部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1 ; (5) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的探針包括，上游探針（E2-1丨-A) :GCTGATAGTGACCTACATT GGGTTGGGTTGGG ;下游探針（E2-I I -B) :TGGGTGTTCTAACAGAAC AACTC ; (6) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液的組成包括：10mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，200mM的氯化 鈉和20mM的氯化鉀；上游探針0. 5-2 μ M和下游探針0. 2-2 μ M。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有明顯的有益效果，從以上技術(shù)方案可知：本發(fā)明利 用的G-四鏈體DNA包含4段GGG序列，具有很容易拆分、組裝的特性，將G-四鏈體DNA 序列分成了兩個(gè)部分，采用3 : 1拆分的模式構(gòu)建探針，即一條探針中含有3段GGG序 列，另外一條只含有一段GGG序列，也就是說(shuō)將序列d(GGGTAGGGCGGGTT GGG)不對(duì)稱(chēng)分為 d(GGGTAGGGCGGG)和d(TGGG)分別與兩條結(jié)合序列的3'和5'端融合形成探針，這兩條結(jié) 合序列與靶基因的部分序列互補(bǔ)。當(dāng)不存在靶基因時(shí)，探針呈游離狀態(tài)，分成兩個(gè)部分的 DNA序列不能組裝成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，不能表現(xiàn)出熒光活性。在靶基因存在的情況下，在變 性與退火過(guò)程中，探針與靶基因特異性結(jié)合，兩拆分部分相互靠近從而組裝成G-四鏈體結(jié) 構(gòu)，與原卟啉結(jié)合后表現(xiàn)出熒光活性，在有激發(fā)光激發(fā)的條件下發(fā)出熒光，這樣可以通過(guò)體 系中熒光的有無(wú)來(lái)檢測(cè)靶基因。
[0015] 以 NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification)病毒 RNA 擴(kuò)增系統(tǒng)和 G-四鏈體熒光檢測(cè)系統(tǒng)為核心，成功地將二者進(jìn)行偶聯(lián)，在確保高靈敏度、高準(zhǔn)確率的前 提下，實(shí)現(xiàn)對(duì)豬瘟病毒的快速診斷，并使檢測(cè)周期縮短至2. 5小時(shí)；且無(wú)需檢測(cè)人員特殊技 能；它是一個(gè)速度快、成本低的診斷系統(tǒng)。NASBA偶聯(lián)G -四鏈體的熒光檢測(cè)體系探針不需 要額外的熒光標(biāo)記步驟，價(jià)格比熒光標(biāo)記的探針便宜很多等；由于NASBA擴(kuò)增的模板只能 是RNA，從而可以有效避免熒光RT-PCR擴(kuò)增DNA污染物引起假陽(yáng)性，因此大大提高了檢測(cè) 的準(zhǔn)確性。只需要等溫設(shè)備就可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，不需要昂貴的熒光PCR儀。NASBA擴(kuò)增效率 比PCR要高，具有較高的檢測(cè)靈敏度。探針無(wú)需熒光標(biāo)記，價(jià)格便宜。且檢測(cè)速度快，操作 簡(jiǎn)便，G-四鏈體熒光反應(yīng)步驟僅需5分鐘；試劑價(jià)格便宜，不需要納米金顆粒等試劑，利于 推廣使用。如果用酶標(biāo)板做檢測(cè)，可以高通量檢測(cè)，多樣品的同時(shí)檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1: 基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)用試劑盒，其組成為： (I) NASBA 反應(yīng)緩沖液包括：40mM Tris-HCl (PH8.0); 70mM KCl ;20mM MgC12;lmM 脫 氧核糖核苷三磷酸（dNTPs) ; ImM核糖核苷三磷酸（NTPs) ; IOmM二硫蘇糖醇；10%二甲基 亞砜（DMSO)。
[0017] (2)NASBA正向引物和反向引物包括，0. 5μΜ正向引物（E2P7f): ACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTT ;0· 5 μ M 反向引物（E2P7T7r) :GTCGACTAATACGACTCACTATAGGG TTCCCTATCAACACTACCTCACCC T。
[0018] (3) NASBA酶反應(yīng)液包括：T7RNA聚合酶60U ;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U ;RNA酶（RNAseH) 0· ?υ，2μ g 的 BSA。
[0019] (4)6-四鏈體反應(yīng)緩沖液的組成包括：1〇11^的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，20〇1111的 氯化鈉和20mM的氯化鉀；上游探針1 μ M和下游探針1 μ M。加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足為97 μ 1。
[0020] (5)G_四鏈體反應(yīng)緩沖液中的上、下游探針包含4段GGG序列，該序列又被拆分為 兩個(gè)部分：一個(gè)部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1。
[0021] (6) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的探針包括，上游探針（E2- M -A) :GCTGATAGTGACCTA CATTGGGTTGGGTTGGG ;下游探針（E2-| I -B) :TGGGTGTTCTAACAGAAC AACTC。
[0022] -種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測(cè)方法，包括以下步驟： NASBA擴(kuò)增：選取豬瘟病毒樣品200 μ 1，利用RNA提取試劑得到目標(biāo)基因 RNA。取制 備好的RNA5 μ 1，加入到10 μ 1的NASBA反應(yīng)緩沖液體系中，該10 μ 1體系包括0. 5 μ M正向 引物和0. 5μΜ反向引物。反應(yīng)步驟：65°C變性5分鐘，30°C退火2分鐘。然后加入NASBA 酶反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件為：41°C反應(yīng)90分鐘，最終得到RNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0023] G-四鏈體突光檢測(cè)反應(yīng)：取G-四鏈體突光檢測(cè)反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)緩沖液的組成包 括上游探針1 μ M和下游探針1 μ M，加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足為96 μ 1，加入2 μ 1的RNA擴(kuò)增產(chǎn)物。 然后85°C變性3 min ;30°C退火2min，加入原卟啉2 μ M，然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板中， 將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，以399nm波長(zhǎng)的光源激發(fā)，檢測(cè)610nm波長(zhǎng)處發(fā)射的熒光。
[0024] 結(jié)果判定：如果檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度高于3. OX IO7U即可判斷為豬瘟病毒陽(yáng)性；低 于IX IO7U即可判斷為豬瘟病毒陰性；如果熒光強(qiáng)度在I. O