X IO7U和3. OX IO7U之間的，則 需要重新測定。
[0025] 實施例2: 基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測用試劑盒，其組成為： (I) NASBA 反應(yīng)緩沖液包括：30mM Tris-HCl (PH8.0); 80mM KCl ;10mM MgC12;2mM 脫 氧核糖核苷三磷酸（dNTPs) ;0. 5mM核糖核苷三磷酸（NTPs) ;5mM二硫蘇糖醇；20%二甲基 亞砜（DMSO)。
[0026] (2)NASBA正向引物和反向引物包括，0. 5μΜ正向引物（E2P7f): ACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTT ;0· 5 μ M 反向引物（E2P7T7r) :GTCGACTAATACGACTCACTATAGGG TTCCCTATCAACACTACCTCACCC T。
[0027] (3) NASBA酶反應(yīng)液包括：T7RNA聚合酶40U ;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2U ;RNA酶（RNAseH) 0· 15U，5y g 的 BSA。
[0028] (4)6-四鏈體反應(yīng)緩沖液的組成包括：1〇11^的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，20〇1111的 氯化鈉和20mM的氯化鉀；上游探針2 μ M和下游探針2 μ M，加無菌雙蒸水補足為97 μ 1; (5) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的上、下游探針包含4段GGG序列，該序列又被拆分為兩個 部分：一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1; (6) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的探針包括，上游探針（E2-1丨-A) :GCTGATAGTGACCTACATT GGGTTGGGTTGGG;下游探針（E2-I I -B) :TGGGTGTTCTAACAGAAC AACTC。
[0029] -種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測方法，包括以下步驟： NASBA擴增：選取豬瘟病毒樣品200 μ 1，利用RNA提取試劑得到目標(biāo)基因 RNA。取制 備好的RNA5 μ 1，加入到10 μ 1的NASBA反應(yīng)緩沖液體系中，該10 μ 1體系包括0. 5 μ M正向 引物和0. 5μΜ反向引物。反應(yīng)步驟：65°C變性5分鐘，30°C退火2分鐘。然后加入NASBA 酶反應(yīng)液進行反應(yīng)，等溫擴增反應(yīng)條件為：41°C反應(yīng)90分鐘，最終得到RNA擴增產(chǎn)物； G-四鏈體突光檢測反應(yīng)：取G-四鏈體突光檢測反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)緩沖液的組成包括上 游探針2 μ M和下游探針2 μ M，加無菌雙蒸水補足為96 μ 1，加入2 μ 1的RNA擴增產(chǎn)物。然 后85°C變性3 min ;30°C退火2min，加入原卟啉2 μ Μ，然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔酶標(biāo)板中，將 酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，以399nm波長的光源激發(fā)，檢測610nm波長處發(fā)射的熒光。
[0030] 結(jié)果判定：如果檢測到的熒光強度高于3. OX 107U即可判斷為豬瘟病毒陽性；低 于IX IO7U即可判斷為豬瘟病毒陰性；如果熒光強度在I. OX IO7U和3. OX IO7U之間的，則 需要重新測定。
[0031] 實施例3: 基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測用試劑盒，其組成為： (I) NASBA反應(yīng)緩沖液包括：60mM Tris-HCl (PH8. 0) ; 60mM KCl ;30mM MgC12 ;0· 5mM脫 氧核糖核苷三磷酸（dNTPs) ; 2mM核糖核苷三磷酸（NTPs) ;20mM二硫蘇糖醇；5%二甲基 亞砜（DMSO)。
[0032] (2)NASBA正向引物和反向引物包括，ΙμΜ正向引物（E2P7f): ACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTT ;1 μ M 反向引物（E2P7T7r) :GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTT CCCTATCAACACTACCTCACCC T。
[0033] (3) NASBA酶反應(yīng)液包括：T7RNA聚合酶60U ;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5U ;RNA酶（RNAseH) 0· 05U，0. 5μ g 的 BSA。
[0034] (4)G-四鏈體反應(yīng)緩沖液的組成包括：10mM的4-輕乙基哌嗪乙磺酸，200mM的氯 化鈉和20mM的氯化鉀；上游探針0. 5 μ M和下游探針0. 2 μ M。加無菌雙蒸水補足為97 μ 1。
[0035] (5)G_四鏈體反應(yīng)緩沖液中的上、下游探針包含4段GGG序列，該序列又被拆分為 兩個部分：一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1。
[0036] (6) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的探針包括，上游探針（E2- M -A) :GCTGATAGTGACCTA CATTGGGTTGGGTTGGG;下游探針（E2-i I -B) :TGGGTGTTCTAACAGAAC AACTC。
[0037] -種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測方法，包括以下步驟： NASBA擴增：選取豬瘟病毒樣品200 μ 1，利用RNA提取試劑得到目標(biāo)基因 RNA。取制 備好的RNA5 μ 1，加入到10 μ 1的NASBA反應(yīng)緩沖液體系中，該10 μ 1體系包括1 μ M正向引 物和ΙμΜ反向引物。反應(yīng)步驟：65°C變性5分鐘，30°C退火2分鐘。然后加入NASBA酶反 應(yīng)液進行反應(yīng)，等溫擴增反應(yīng)條件為：41°C反應(yīng)90分鐘，最終得到RNA擴增產(chǎn)物。
[0038] G-四鏈體突光檢測反應(yīng)：取G-四鏈體突光檢測反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)緩沖液的組成包 括上游探針0. 5 μ M和下游探針0. 5 μ M，加無菌雙蒸水補足為96 μ 1，加入0. 5 μ 1的RNA擴 增產(chǎn)物。然后85°C變性3 min;30°C退火2min，加入原卟啉2μΜ，然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔 酶標(biāo)板中，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，以399nm波長的光源激發(fā)，檢測610nm波長處發(fā)射的熒光。
[0039] 結(jié)果判定：如果檢測到的熒光強度高于3. OX IO7U即可判斷為豬瘟病毒陽性；低 于IX IO7U即可判斷為豬瘟病毒陰性；如果熒光強度在I. OX IO7U和3. OX IO7U之間的，則 需要重新測定。
[0040] 以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，任 何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修 改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測方法，包括以下步驟： (1 )NASBA擴增：將純化好的豬瘟病毒RNA樣品加入到NASBA反應(yīng)緩沖液體系中，體系 包括0. 5-1iiM正向引物和0. 5-1iiM反向引物； 反應(yīng)步驟：65°C變性后降溫，然后加入NASBA酶反應(yīng)液進行等溫擴增反應(yīng)，條件為： 41°C90分鐘，得到RNA擴增產(chǎn)物； 其中：NASBA反應(yīng)緩沖液體系包括NASBA反應(yīng)緩沖液、NASBA正向引物和反向引物；NASBA反應(yīng)緩沖液，包括：30-60mMTris-HC1(PH8. 0) ; 60-80mMKC1 ;10-30mMMgC12 ; 0. 5-2mM脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs) ; 0. 5-2mM核糖核苷三磷酸（NTPs);5-20mM二硫蘇 糖醇；5-20% (v/v)二甲基亞砜（DMSO); NASBA正向引物和反向引物，包括，0? 5-1iiM正向引物（E2P7f):ACTATGAGCCCAGGGACAG CTACTT;0.5-liiM反向引物（E2P7T7r):GTCGACTAATACGACTCACTATAGGGTTCCCTATCAAC ACTACCTCACCCT； NASBA酶反應(yīng)液，包括：T7RNA聚合酶40-80U;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2-10U;RNA酶（RNAseH) 0? 05-0. 15U，0. 5-5iig的牛血清白蛋白（BSA); (2)G-四鏈體熒光檢測反應(yīng)：取G-四鏈體熒光檢測反應(yīng)緩沖液，反應(yīng)緩沖液的組成包 括上游探針0. 5-2yM和下游探針0. 5-2yM，加無菌雙蒸水補足為96yl，加入2yl的RNA 擴增產(chǎn)物；然后85°C變性3min后降溫；加入原卟啉0. 5-2yM，然后將溶液轉(zhuǎn)移到96孔酶 標(biāo)板中，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀，以399nm波長的光源激發(fā)，檢測610nm波長處發(fā)射的熒光；檢 測到的熒光強度高于3.OX107U即可判斷為豬瘟病毒陽性國； 其中：G-四鏈體反應(yīng)緩沖液的組成包括：10mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，200mM的氯 化鈉和20mM的氯化鉀；上游探針0. 5-2iiM和下游探針0. 5-2iiM。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測方法，其中：G-四 鏈體反應(yīng)緩沖液中的上、下游探針包含4段GGG序列，該序列又被拆分為兩個部分：一個部 分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測方法，其中： G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的探針包括，上游探針（E2-II-A):GCTGATAGTGACCTACATTGGGTTGGG TTGGG;下游探針（E2-II-B):TGGGTGTTCTAACAGAACAACTC。
4. 一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測用試劑盒，其組成為： (1) NASBA反應(yīng)緩沖液包括：30-60mMTris-HCl(PH8. 0) ; 6〇-80mMKC1 ；10-30mM MgC12 ;0. 5-2mM脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs) ; 0. 5-2mM核糖核苷三磷酸（NTPs) ;5-20mM 二硫蘇糖醇；5-20% (v/v)二甲基亞砜（DMSO); (2) NASBA正向引物和反向引物包括，0.5-1iiM正向引物（E2P7f): ACTATGAGCCCAGGGACAGCTACTT;0? 5-1iiM反向引物（E2P7T7r):GTCGACTAATACGACTCACTATA GGGTTCCCTATCAACACTACCTCACCCT； (3) NASBA酶反應(yīng)液包括：T7RNA聚合酶40-80U;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2-10U;RNA酶（RNAseH) 0? 05-0. 15U，0. 5-5iig的牛血清白蛋白（BSA); (4)G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的上、下游探針包含4段GGG序列，該序列又被拆分為兩個 部分：一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模式是3:1 ; (5) G-四鏈體反應(yīng)緩沖液中的探針包括，上游探針（E2-I1 -A):GCTGATAGTGACCTACATTG GGTTGGGTTGGG;下游探針（E2-II-B):TGGGTGTTCTAACAGAACAACTC; (6)G-四鏈體反應(yīng)緩沖液的組成包括：10mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸，200mM的氯化 鈉和20mM的氯化鉀；上游探針0. 5-2iiM和下游探針0. 5-2iiM。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于G-四鏈體熒光特性的豬瘟病毒檢測方法及試劑盒，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，其利用核酸等溫擴增（NASBA）體系對目標(biāo)RNA進行擴增得到單鏈的RNA產(chǎn)物；將上、下游探針和RNA擴增產(chǎn)物加入到G-四鏈體熒光檢測緩沖液中，經(jīng)變性、退火后再加入原卟啉，利用酶標(biāo)儀或熒光光度計檢測該反應(yīng)體系中熒光強度，可判定樣品中有無豬瘟病毒存在。本發(fā)明檢測豬瘟病毒速度快、精確穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、檢測步驟簡單、成本低廉。
【IPC分類】C12R1-93, C12Q1-68, C12Q1-70
【公開號】CN104611462
【申請?zhí)枴緾N201410744990
【發(fā)明人】王毅, 鄧明剛, 魯小璐
【申請人】貴州大興農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司, 王毅
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年12月9日