快速選育豬瘟兔化弱毒株(c株)st敏感細(xì)胞系的方法及專用引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT?PCR)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR技術(shù)快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST(豬睪丸)敏感細(xì)胞系的方法。包括1)獲得ST單克隆細(xì)胞；2)接種豬瘟兔化弱毒株(C株)；3)提取連續(xù)收獲的各批次豬瘟兔化弱毒液(病毒液)的RNA，用RT?PCR技術(shù)確定ST單克隆細(xì)胞系能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒(C株)；4)用實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR技術(shù)確定拷貝數(shù)在106拷貝(copies)/mL以上的為豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系。本發(fā)明能夠快速的為豬瘟弱毒疫苗的生產(chǎn)提供敏感細(xì)胞系，縮短了疫苗生產(chǎn)周期并降低了疫苗成本。
【專利說明】
快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法及專用 引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用RT-PCR技術(shù)（即逆轉(zhuǎn)錄PCR)和 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬痕是由豬痕病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種急性、熱 性、高度傳染性和致死性的烈性傳染病，俗稱爛腸瘟，早年又稱豬霍亂。該病是發(fā)生最多、危 害最大、流行最廣的豬傳染病。近年來中國(guó)因病死亡豬數(shù)占飼養(yǎng)總數(shù)的8%-10%，其中三分 之一是由豬瘟引起的。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(0ΙΕ)將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，我國(guó) 也將豬瘟定為一類烈性傳染病，屬于危害嚴(yán)重、需要采取緊急嚴(yán)厲的強(qiáng)制預(yù)防、控制和撲滅 的動(dòng)物疫病之一。
[0003] 豬瘟遍布于全世界，具有高度接觸傳染性。目前，疫苗接種是預(yù)防控制豬瘟的重要 手段，許多國(guó)家和地區(qū)已先后宣布消滅了豬瘟。中國(guó)豬瘟兔化弱毒疫苗以其具有誘生免疫 反應(yīng)快，對(duì)種豬、乳豬無殘余毒力，免疫豬可抵抗豬瘟強(qiáng)毒株的攻擊等特點(diǎn)，成為國(guó)際上公 認(rèn)的最安全有效的弱毒疫苗。
[0004] 目前用于免疫的豬瘟疫苗主要有四種:脾淋苗、乳兔苗、細(xì)胞苗和聯(lián)苗。這四種疫 苗的豬瘟毒株均是中國(guó)系豬瘟兔化弱毒株(簡(jiǎn)稱C株）。豬瘟脾淋苗和乳兔苗是兔源組織苗， 是利用成兔和乳兔的活組織生產(chǎn)制備的。由于豬瘟脾淋苗和乳兔苗使用動(dòng)物的免疫器官做 成，雖然免疫效果較好，但是成本高，容易污染，產(chǎn)量低，批次間差異大，而且免疫注射后應(yīng) 激反應(yīng)大。而豬瘟細(xì)胞苗具有生產(chǎn)成本低，適用于批量生產(chǎn)，批間差異小，副反應(yīng)低等特點(diǎn) 越來越受到重視。但是由于在豬瘟細(xì)胞苗生產(chǎn)過程中，細(xì)胞產(chǎn)毒效果差，病毒滴度較低，導(dǎo) 致疫苗成品的免疫效果不及豬瘟脾淋苗。因此，篩選對(duì)豬瘟兔化弱毒株敏感的細(xì)胞系，以提 高病毒滴度對(duì)豬瘟細(xì)胞苗的生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義，并可帶來經(jīng)濟(jì)效益。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用RT-PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速選育豬 瘟兔化弱毒株(C株)ST(豬睪丸細(xì)胞)敏感細(xì)胞系的方法，以克服現(xiàn)有豬瘟細(xì)胞疫苗生產(chǎn)中 存在的免疫效果不理想的缺陷。
[0006] 本發(fā)明所提供的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法，主要包括 以下步驟：
[0007] 1)獲得ST單克隆細(xì)胞；
[0008] 2)接種豬瘟兔化弱毒株(C株）；
[0009] 3)提取連續(xù)收獲的各批次豬瘟兔化弱毒液（病毒液）的RNA，用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行初 步鑒定，確定ST單克隆細(xì)胞系能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒(C株）；
[0010] 4)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)定量檢測(cè)豬瘟兔化弱毒液，以確定豬瘟兔化弱毒株 (C株)的拷貝數(shù)，豬瘟兔化弱毒株(C株)能夠持續(xù)感染細(xì)胞，并且確定在第三批次以及以后 批次收獲的病毒液的拷貝數(shù)能夠維持在1〇6拷貝（C〇pieS)/mL的是豬瘟兔化弱毒株(C株)ST 敏感細(xì)胞系。
[0011] 在上述方法中，所述步驟1)ST單克隆細(xì)胞的獲得方法為:將無外源病毒污染的ST 細(xì)胞在37 °C、5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，用0.2 % (質(zhì)量/體積，W/V，單位g/100mL)的胰蛋白酶 消化成單個(gè)散在的細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用為15% (體積/體積，V/V，單位mL/ 100mL)血 清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞濃度為10-lOOcells/mL，用移液器加樣至96孔板，每孔100yL， 顯微鏡下觀察，記錄并標(biāo)記只含有一個(gè)細(xì)胞的孔，每天觀察，細(xì)胞數(shù)量增加后，再逐步擴(kuò)大 培養(yǎng)，得到ST單克隆細(xì)胞。
[0012] 所述步驟2)中接種豬瘟兔化弱毒株(C株)的方法為:將豬瘟兔化弱毒株(C株)接種 ST單克隆細(xì)胞，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h收獲病毒液，連續(xù)收獲8個(gè)批次毒液，每 個(gè)批次病毒液置于_80°C短期保存待檢。
[0013] 所述步驟3)中的RT-PCR鑒定方法，可包括以下步驟：
[0014] 3.1)提取豬瘟兔化弱毒液(病毒液)的總RNA;
[0015] 3.2)以病毒液的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成其cDNA;
[0016] 3.3 )RT-PCR檢測(cè)：以cDNA為模板，在RT-PCR特異性引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反 應(yīng)結(jié)束后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，若能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為383bp的目的片段，則 檢測(cè)結(jié)果為陽性，反之為陰性。
[0017] 所述步驟3.2)中是對(duì)所提取的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行兩步法反轉(zhuǎn)錄，第一步反 應(yīng)體系為：01ig〇 dT Primer(50uM)lyL，dNTP Mixture(10mM each)lyL，Template RNA 2μ L，Rnase free ddH2〇 6yL，反應(yīng)條件為：65°C5min，迅速冷卻；第二步反應(yīng)體系為:Template RNA and Primer Mixture(第一步的產(chǎn)物）10yL，5*PrimeScript II Buffer 4yL，Rnase inhibitor(40U/yL)0.5yL,PrineScript II RTase(200U/yL)lyL,Rnase free H2〇4.5yL, 反應(yīng)條件為:混勻，42 °C 30-60min，95 °C 5min，冰上冷卻。
[0018] 所述步驟3.3)中用于RT-PCR鑒定的特異性引物，是以豬瘟兔化弱毒株(C株）的全 基因組的特異性保守區(qū)域內(nèi)自5'端第54-436bp(序列表中SEQ ID N0:1)為對(duì)象設(shè)計(jì)的，目 的片段長(zhǎng)383bp，用以檢測(cè)ST單克隆細(xì)胞是否能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒株(C株）。
[0019] 所述步驟3.3)中用于RT-PCR鑒定的上游引物具有序列表中SEQ ID N0:2所示的核 苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。
[0020] 所述步驟3.3)中的1^-?0?反應(yīng)體系為：模板〇0財(cái)1以1^2\了39?0?1^8七6『 MIX12 · 5yL，上游引物（ΙΟμΜΛΛ) lyL，下游引物（10μΜ/μυ lyL，加 Rnase free H20至25yL;所 述RT-PCR的反應(yīng)條件為:先94°C預(yù)變性，5min;然后94°C變性30s，56°C_64°C退火20s，72°C 延伸30s，共35個(gè)循環(huán);最后72°C延伸10min。
[0021 ]所述步驟4)中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，可包括以下步驟：
[0022] 4.1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:將豬瘟病毒(C株)作為標(biāo)準(zhǔn)品，梯度稀釋成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X lOVopies/yL，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在引 物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)彳丁實(shí)時(shí)9?光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后，以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度Log 值(X軸)對(duì)其相應(yīng)ct值(Y軸)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0023] 4.2)提取豬瘟兔化弱毒液(病毒液）的基因組RNA，以提取的基因組RNA為模板，在 引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行豬瘟病毒(C株)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)；
[0024] 4.3)根據(jù)熒光信號(hào)的變化及強(qiáng)度，對(duì)待測(cè)樣品中的豬瘟病毒(C株)進(jìn)行定性、定量 檢測(cè)，出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線表明樣品中含有豬瘟病毒，未出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線表明樣品中不含 有豬瘟病毒，再根據(jù)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度和步驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)樣品中所含的 豬痕病毒的拷貝數(shù)。
[0025] 所述步驟4.1)和4.2)中用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針，是以豬 瘟兔化弱毒株(C株)的全基因組的特異性保守區(qū)域內(nèi)自5'端第151-243bp為對(duì)象設(shè)計(jì)的，目 的片段長(zhǎng)93bp(序列表中SEQ ID N0:4)，用以確定病毒的拷貝數(shù)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的 目的片段93bp是步驟3.3RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的一部分）。
[0026] 所述步驟4.1)和4.2)中用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的上游引物的核苷酸序列 如序列表中SED ID N0:4所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:5所示。
[0027] 所述步驟4.1)和4.2)中用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的TaqMan探針，其核苷酸序 列如序列表中SEQ ID N0:6所示；所述探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，其5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基 團(tuán)，3 '端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)；所述報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA;為防 止PCR擴(kuò)增時(shí)被延伸，所述探針的3'端已經(jīng)磷酸化處理。
[0028]所述步驟4.1)和4.2)中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系為:模板RNA 2yL，2X RT-PCR buffer 12.5yL，上游引物（20yMAxL)0.5yL(10ng)，下游引物（20μΜ/μL)0·5μL (10ng)，Mix酶0 · 5yL，HS酶0 · 5yL，TaqMan探針（20μΜ/μυ0 · 5yL( 10ng)，加 Rnase free Η20至 25yL;實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件為:先52°(：15!1^11，951€58 ;然后941€58,581€4〇8，共45個(gè) 循環(huán)。
[0029] 本發(fā)明另一目的是提供快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系方法中的專 用引物，包括：
[0030] 步驟3)中T-PCR技術(shù)進(jìn)行初步鑒定的上游引物，其具有序列表中SEQ ID N0:2所示 的核苷酸序列；下游引物，其具有序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列;或
[0031] 步驟4)中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)定量檢測(cè)的上游引物，其核苷酸序列如序列表 中SED ID N0:5所示；下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示;TaqMan探針， 其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。
[0032] 本發(fā)明提供了一種用RT-PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速選育豬瘟兔化 弱毒株(C株)ST(豬睪丸細(xì)胞)敏感細(xì)胞系的方法。本發(fā)明能夠快速的為豬瘟弱毒疫苗的生 產(chǎn)提供敏感細(xì)胞系，縮短了疫苗生產(chǎn)周期并降低了疫苗成本，解決了現(xiàn)今豬瘟細(xì)胞疫苗由 于豬瘟病毒滴度低導(dǎo)致的疫苗免疫效果不理想的難題。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0034] 1、本發(fā)明篩選的ST敏感細(xì)胞系能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒株(C株），能夠連續(xù)多 次收獲豬瘟兔化弱毒液，生產(chǎn)過程中可以直接使用；
[0035] 2、本發(fā)明建立的篩選ST敏感細(xì)胞系的方法是細(xì)胞進(jìn)行單克隆后，先用RT-PCR技術(shù) 進(jìn)行初步鑒定，確定ST單克隆細(xì)胞系能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒(C株），再用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)定量檢測(cè)豬瘟兔化弱毒液，比常規(guī)的免疫熒光方法能夠更加快速地選育豬瘟ST敏 感細(xì)胞系；
[0036] 3、本發(fā)明篩選的ST敏感細(xì)胞系是針對(duì)豬瘟疫苗使用的毒株(豬瘟兔化弱毒株(C 株)），能夠直接應(yīng)用于豬瘟疫苗生產(chǎn)；
[0037] 4、本發(fā)明篩選的ST細(xì)胞系對(duì)豬瘟病毒敏感，并且可高滴度持續(xù)感染豬瘟病毒，有 利于克服當(dāng)前豬瘟病毒細(xì)胞培養(yǎng)滴度低的難題，可縮短疫苗生產(chǎn)周期并降低疫苗成本，對(duì) 豬瘟疫苗的生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。
[0038]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0039] 圖1為C4株單個(gè)ST細(xì)胞在96孔板中的生長(zhǎng)狀態(tài)
[0040] 圖2為El 1株單個(gè)ST細(xì)胞在96孔板中的生長(zhǎng)狀態(tài) [00411圖3為標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR擴(kuò)增曲線 [0042]圖4為實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0043] 圖5為D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株豬瘟兔化弱毒株(C株)拷 貝數(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J·，Russel1，David ff., Molecular Cloning : A Laboratory Manual? 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0045] 所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/質(zhì)量(W/W，單位g/lOOg)百分比濃度、質(zhì) 量/體積(W/V，單位g/100mL)百分比濃度或體積/體積(V/V，單位mL/100mL)百分比濃度。
[0046] 實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑以達(dá) 到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的 來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提 示替換使用。
[0047] 所用引物和TaqMan探針由寶生物工程(大連)有限公司公司合成。
[0048] 實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0049] 實(shí)施例、快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系
[0050] 本發(fā)明用RT-PCR技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株） ST(豬睪丸細(xì)胞)敏感細(xì)胞系的方法，包括以下步驟：
[0051 ] 1)獲得ST單克隆細(xì)胞
[0052]將無外源病毒污染的ST細(xì)胞(購自美國(guó)菌種保藏中心(ATCC))在37°C、5%C02培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)48h，用0.2% (質(zhì)量/體積，W/V，單位g/100mL)的胰蛋白酶消化成單個(gè)散在的細(xì)胞 后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用15% (體積/體積，V/V，單位mL/ 100mL)血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋至細(xì) 胞濃度為10-100個(gè)細(xì)胞(cells)/mL(-般情況下，胰酶消化液以及血清添加量只需標(biāo)出比 例即可），用移液器加樣至96孔板，每孔100yL，顯微鏡下觀察，記錄并標(biāo)記只含有一個(gè)細(xì)胞 的孔，分別標(biāo)記為D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株，每天觀察，其中，C4株、 El 1株單個(gè)ST細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)如圖1、圖2所示。細(xì)胞數(shù)量增加后逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，先擴(kuò)大培養(yǎng) 至24孔板，再擴(kuò)大培養(yǎng)至6孔板，最后將克隆的ST細(xì)胞接種至25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將DMEM培 養(yǎng)基中的血清添加量改為10 % (體積/體積，V/V，單位mL/100mL)，進(jìn)行細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，得到 ST單克隆細(xì)胞。
[0053] 2)接種豬瘟兔化弱毒株(C株）
[0054] 將D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株ST單克隆細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)至 75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，均按1% (體積/體積，V/V，單位mL/100mL)病毒量接種豬瘟兔化弱毒株 (C株，購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所），在37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h收獲病毒液，連續(xù)收 獲8批次(豬瘟病毒不引起細(xì)胞病變，可連續(xù)收獲毒液，每一收為一個(gè)批次）。
[0055] 3)提取連續(xù)收獲的8個(gè)批次病毒液的RNA，用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行初步鑒定，確定ST單 克隆細(xì)胞系能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒(C株），具體方法包括以下步驟：
[0056] 3.1)提取病毒液的總RNA
[0057] 對(duì)各批次收獲的病毒液取樣，用TAKARA公司的TaKaRaRNAiso Reagent試劑盒提取 總RNA，具體步驟如下：
[0058] 3.1 · 1移液器吸取200yL病毒液，加入lmL RNAiso Reagent，混合均勾。
[0059] 3 · 1 · 2向上述步驟3 · 1 · 1的勾衆(zhòng)裂解液中加入氯仿（RNAiso Reagent的1/5體積 量），蓋緊離心管蓋，用力震蕩（氯仿沸點(diǎn)低、易揮發(fā)，振蕩時(shí)應(yīng)小心離心管蓋突然彈開）。待 充分乳化溶液呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后，再室溫靜置5分鐘。
[0060] 3·1·312,00(^、4Γ 離心 15 分鐘。
[0061] 3.1.4從離心機(jī)中小心取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。
[0062] 3.1.5向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15_30°C下 靜置10分鐘。
[0063] 3.1.612,000g、4°C離心10分鐘。一般在離心后，試管底部會(huì)出現(xiàn)沉淀。
[0064] 3.1.7RNA沉淀的清洗小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75 %的乙醇lmL(切勿 觸及沉淀），輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁，12,000g、4°C離心5分鐘后小心棄去乙醇。
[0065] 3.1.8RNA的溶解室溫干燥沉淀2-5分鐘，加入適量的RNasefree水溶解沉淀，必要 時(shí)可用移液槍輕輕吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后保存?zhèn)溆谩?br>[0066] 3.2以病毒液的RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成其cDNA
[0067]對(duì)所提取的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行兩步法反轉(zhuǎn)錄，第一步反應(yīng)體系為:01igo dT Primer(50uM)lyL,dNTP Mixture(10mM each)lyL,Template RNA 2yL,Rnase free ddH2〇 6yL，反應(yīng)條件為：65°C5min，迅速冷卻；第二步反應(yīng)體系為：Template RNA and Primer Mixture(第一步的產(chǎn)物）10yL，5*PrimeScript II Buffer 4yL，Rnase inhibitorHOU/yL) 0.5yL，PrineScript II RTase(200UAiL)lyL，Rnase free H204.5yL，反應(yīng)條件為：混勻，42 °C 30-60min，95 °C 5min，冰上冷卻。
[0068] 3.3RT-PCR 檢測(cè)
[0069] 檢索Genbank上的豬瘟兔化弱毒(C株）的基因序列，用生物信息學(xué)的方法，經(jīng)過比 對(duì)分析，找到豬瘟兔化弱毒(C株)全基因組的特異性保守區(qū)域，以自5'端第54-436bp區(qū)域 (383bp，序列表中SEQ ID N0:1)為對(duì)象，用軟件Primer Express2.0設(shè)計(jì)用于RT-PCR鑒定的 專用引物，用以檢測(cè)ST單克隆細(xì)胞是否能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒株(C株），引物序列如 下：
[0070] RT-PCR鑒定豬瘟兔化弱毒(C株)的特異性引物：
[0071] 上游引物（Forward primer) :5'-ATTTGGTTCAGGGCCTCC-3'（序列表中SEQ ID N0: 2)
[0072] 下游引物（Reverse primer) :5，-TCCACTCCCATTGGTTTT-3,（序列表中SEQ ID NO: 3)〇
[0073] 以cDNA為模板，在RT-PCR專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，RT-PCR反應(yīng)體系為： 模板cDNA lyL，2XTaq PCR Master MIX 12.5yL，上游引物（10yMAiL)lyL，下游引物（10μΜ/ yL) lyL，加 Rnase free Η20至25yL;所述RT-PCR的反應(yīng)條件為：先94°C預(yù)變性，5min;然后94 。(:變性30s，56°C_64°C退火20s，72°C延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0074] 反應(yīng)結(jié)束后對(duì)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，若能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為383bp 的目的片段，則檢測(cè)結(jié)果為陽性，反之為陰性。
[0075] 經(jīng)RT-PCR初步鑒定，確定所得D3株、C4株、C8株、D5株、E10株、E11株、F9株和H9株ST 單克隆細(xì)胞系能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒(C株)。
[0076] 4)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)定量檢測(cè)病毒液，以確定病毒的拷貝數(shù)。病毒能夠 持續(xù)感染細(xì)胞，并且在第三批次以及以后批次收獲毒液的拷貝數(shù)能夠維持在106c〇pie S/mL 的是豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系(豬瘟病毒感染細(xì)胞有適應(yīng)階段，前兩批次毒液毒 價(jià)較低），具體方法包括以下步驟：
[0077]用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針，是以豬瘟兔化弱毒(C株)全 基因組的特異性保守區(qū)域內(nèi)自5'端第151-243bp(長(zhǎng)93bp，序列表中SEQ ID N0:4)為對(duì)象設(shè) 計(jì)的（93bp目的片段是步驟3.3RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物383bp的一部分），用以確定病毒的拷貝數(shù)， 引物和TaqMan探針的序列如下：
[0078] 上游引物（Forward primer) :5，-CCCTGGGTGGTCTAAG-3,（序列表中SEQ ID N0:5) 下游引物（Reverseprimer):5'-CATGCCCTCGTCCAC-3'（序列表中SEQIDN0 :6)TaqMan探 針：5'-(FAM)CCTGAGTACAGGACAGTCGTCAGTAGTT(TAMRA)-3'（序列表中SEQ ID N0:7)。
[0079] 所述TaqMan探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，其5 '端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3 '端標(biāo)記有淬 滅熒光基團(tuán)；所述報(bào)告熒光基團(tuán)為FAM，所述熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA;為防止PCR擴(kuò)增時(shí)被延 伸，所述探針的3'端已經(jīng)磷酸化處理。
[0080] 4.1建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:將豬瘟病毒(C株)作為標(biāo)準(zhǔn)品，梯度稀釋成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1\105、1\104、1\103、1\10 2、1\101拷貝（(3(^68)/^，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)，以不同 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。
[0081 ] 所述步驟4.1)中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系為:模板RNA 2yL，2XRT-PCR buffer 12 · 5yL，上游引物（20μΜΛΛ) 0 · 5yL (1 Ong)，下游引物（20μΜ/μL) 0 · 5yL (1 Ong)，Mi X酶 0 · 5yL，HS酶0 · 5yL，TaqMan探針（20μΜ/μυ〇 · 5yL( lOng)，加 Rnase free H20至25yL;實(shí)時(shí)熒 光定量RT-PCR的反應(yīng)條件為:先52 °C 15min，95 °C 5s;然后94 °C 5s，58 °C 40s，共45個(gè)循環(huán)。 [0082] 標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線如圖3所示(從左至右曲線分別對(duì)應(yīng)1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101拷貝（copies)AiL濃度的標(biāo)準(zhǔn)品），標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線為平 滑的"S"形曲線。檢測(cè)結(jié)束后，以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度Log值(X軸)對(duì)其相應(yīng)Ct值(Y軸)作圖，繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4(橫坐標(biāo)為Ct值，縱坐標(biāo)為拷貝數(shù))所示，R 2 = 0.999,誤差小，由標(biāo) 準(zhǔn)曲線得到的線性方程為：
[0083] y = -3.394x+40.812。
[0084] 4.2提取收獲的8個(gè)批次的各株病毒液的基因組RNA，以提取的基因組RNA為模板， 在引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)。
[0085] 所述步驟4.2)中的實(shí)時(shí)熒光定量1?1'-?0?的反應(yīng)體系為:模板1?熟2以1^，2\1?1'-?0? buffer 12 · 5yL，上游引物（20μΜΛΛ) 0 · 5yL (1 Ong)，下游引物（20μΜ/μL) 0 · 5yL (1 Ong)，Mi X酶 0 · 5yL，HS酶0 · 5yL，TaqMan探針（20μΜ/μυ〇 · 5yL( lOng)，加 Rnase free H20至25yL;實(shí)時(shí)熒 光定量PCR的反應(yīng)條件為:先52°(：15!1^11，951€58 ;然后941€58,581€4〇8，共45個(gè)循環(huán)。
[0086] 4.3根據(jù)熒光信號(hào)的變化及強(qiáng)度，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，出現(xiàn)熒光擴(kuò)增 曲線表明樣品中含有豬痕病毒(C株），未出現(xiàn)焚光擴(kuò)增曲線表明樣品中不含有豬痕病毒(C 株），再根據(jù)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度和步驟4.1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)樣品中所含的豬瘟病 毒(C株)的拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見表1。
[0087]結(jié)果如表1和圖5所示，在所得8株ST單克隆細(xì)胞系中，C4和E11兩株細(xì)胞收獲的第3 批次至第8批次毒液拷貝數(shù)能夠維持在106C〇pieS/mL，并且高峰期毒液拷貝數(shù)可達(dá) 10 7C〇pieS/mL，產(chǎn)毒量明顯高于其它細(xì)胞株，屬于豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系，可 應(yīng)用于豬瘟疫苗的生產(chǎn)。
[0088] 表1豬瘟病毒(C株)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果
[0089]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法，主要包括以下步驟： 1) 獲得ST單克隆細(xì)胞； 2) 接種豬瘟兔化弱毒株(C株）； 3) 提取連續(xù)收獲的各批次豬瘟兔化弱毒液(病毒液）的RNA，用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行初步鑒 定，確定ST單克隆細(xì)胞系能夠持續(xù)感染豬瘟兔化弱毒(C株）； 4) 用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)定量檢測(cè)豬瘟兔化弱毒液，以確定豬瘟兔化弱毒株(C 株)的拷貝數(shù)，確定豬瘟兔化弱毒株(C株)能夠持續(xù)感染細(xì)胞，并且在第三批次以及以后批 次收獲的病毒液的拷貝數(shù)能夠維持在IO 6拷貝（c〇pieS)/mL的確定為豬瘟兔化弱毒株(C株） ST敏感細(xì)胞系。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法，其特征 在于:所述步驟1)ST單克隆細(xì)胞的獲得方法為:將無外源病毒污染的ST細(xì)胞在37°C、5%C0 2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，用0.2 % (質(zhì)量/體積，W/V，單位g/1OOmL)的胰蛋白酶消化成單個(gè)散在的 細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后用為15 % (體積/體積，V/V，單位mL/1 OOmL)血清的DMEM培養(yǎng)基稀 釋至細(xì)胞濃度為IO-IOOcel ls/mL，用移液器加樣至96孔板，每孔IOOyL，顯微鏡下觀察，記錄 并標(biāo)記只含有一個(gè)細(xì)胞的孔，每天觀察，細(xì)胞數(shù)量增加后，再逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，得到ST單克隆 細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法，其 特征在于:所述步驟2)中接種豬瘟兔化弱毒株(C株）的方法為:將豬瘟兔化弱毒株(C株)接 種ST單克隆細(xì)胞，在37 °C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48h收獲病毒液，連續(xù)收獲8個(gè)批次毒液， 每個(gè)批次病毒液置于-80°C短期保存待檢。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法， 其特征在于:所述步驟3)中的RT-PCR鑒定方法，可包括以下步驟： 3.1) 提取豬瘟兔化弱毒液(病毒液)的總RNA; 3.2) 以病毒液的總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成其cDNA; 3.3) RT-PCR檢測(cè)：以cDNA為模板，在RT-PCR特異性引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié) 束后對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，若能擴(kuò)增出長(zhǎng)度為383bp的目的片段，則檢測(cè) 結(jié)果為陽性，反之為陰性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法，其特征 在于:所述步驟3.2)中是對(duì)所提取的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行兩步法反轉(zhuǎn)錄，第一步反應(yīng)體 系為：01 igo dT Primer(50uM)lyL，dNTP Mixture(10mM each)lyL，Template RNA 2yL， Rnase free ddH2〇 6yL，反應(yīng)條件為：65°C5min，迅速冷卻；第二步反應(yīng)體系為：Template RNA and Primer Mixture(第一步的產(chǎn)物）10yL，5*PrimeScript II Buffer 4yL，Rnase inhibitor(40U/yL)0.5yL,PrineScript II RTase(200U/yL)IyL,Rnase free H2〇4.5yL, 反應(yīng)條件為:混勻，42 °C 30-60min，95 °C 5min，冰上冷卻。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法，其 特征在于:所述步驟3.3)中用于RT-PCR鑒定的上游引物具有序列表中SEQ ID NO:2所示的 核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列。7. 根據(jù)權(quán)利要求4或5或6所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法， 其特征在于：所述步驟3.3)中的RT-PCR反應(yīng)體系為：模板cDNA lyL，2 X Taq PCR Master MIX 12.5yL，上游引物（ΙΟμΜ/μυ?μL，下游引物（ΙΟμΜ/μυ?μL，加 Rnase free H2O至25μΜ 所述RT-PCR的反應(yīng)條件為:先94°C預(yù)變性，5min;然后94°C變性30s，56°C_64°C退火20s，72 °C延伸30s，共35個(gè)循環(huán);最后72 °C延伸IOmin。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7任一所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株）ST敏感細(xì)胞系的方 法，其特征在于:所述步驟4)中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟： 4.1) 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線:將豬瘟病毒(C株)作為標(biāo)準(zhǔn)品，梯度稀釋成I X 108、1 X 107、1 X 106、 I X 105、1 X 104、1 X 103、I X 102、I X lOVopies/yL，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在引物和 TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后，以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度Log值(X 軸)對(duì)其相應(yīng)Ct值(Y軸)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 4.2) 提取豬瘟兔化弱毒液(病毒液）的基因組RNA，以提取的基因組RNA為模板，在引物 和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行豬瘟病毒(C株)的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)； 4.3) 根據(jù)熒光信號(hào)的變化及強(qiáng)度，對(duì)待測(cè)樣品中的豬瘟病毒（C株)進(jìn)行定性、定量檢 測(cè)，出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線表明樣品中含有豬瘟病毒，未出現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線表明樣品中不含有 豬瘟病毒，再根據(jù)樣品的熒光信號(hào)強(qiáng)度和步驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)樣品中所含的豬 瘟病毒的拷貝數(shù)。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系的方法，其特征 在于:所述步驟4.1)和4.2)中用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)的上游引物的核苷酸序列如序 列表中SED ID N0:5所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示;TaqMan探 針的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:7所示，所述探針為經(jīng)過熒光標(biāo)記的，其5'端標(biāo)記有 報(bào)告熒光基團(tuán)（如FAM)，3 '端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)（如TAMRA，所述探針的3 '端已經(jīng)磷酸化處 理； 所述步驟4.1)和4.2)中的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系為：模板1?嫩2以1^，2\1?1'-PCR buffer 12· 5yL，上游引物（20μΜ/μL)0·5yL(IOng)，下游引物（20μΜ/μL)0·5yL(IOng)， Mix酶0 · 5yL，HS酶0 · 5yL，TaqMan探針（20μΜ/μυ〇 · 5yL( IOng)，加 Rnase free H2O至25yL;實(shí) 時(shí)熒光定量RT-PCR的反應(yīng)條件為：先52°(：1511^11，951€58 ;然后941€58,581€4〇8，共45個(gè)循 環(huán)。10. 權(quán)利要求1-9所述的快速選育豬瘟兔化弱毒株(C株)ST敏感細(xì)胞系方法中的專用引 物，包括： 步驟3)中T-PCR技術(shù)進(jìn)行初步鑒定的上游引物，其具有序列表中SEQ ID NO: 2所示的核 苷酸序列；下游引物，其具有序列表中SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列;或 步驟4)中實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)定量檢測(cè)的上游引物，其核苷酸序列如序列表中 SED ID N0:5所示；下游引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；TaqMan探針，其 核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:7所示。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105886662SQ201610053986
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日
【發(fā)明人】商曉桂, 張貴剛, 郝鵬, 魏學(xué)峰, 劉國(guó)英, 范秀麗, 韓志玲, 宋志剛, 孔彩萍, 王艷杰
【申請(qǐng)人】金宇保靈生物藥品有限公司