Uhrf1作為子宮內(nèi)膜癌診治標(biāo)志物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基因標(biāo)記物，該基因標(biāo)記物是UHRF1。UHRF1可用于判斷受試者是否具有患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)或者判斷受試者是否患有子宮內(nèi)膜癌。另外，UHRF1還可以用于制備治療子宮內(nèi)膜癌的藥物。本發(fā)明為臨床在分子水平上診斷子宮內(nèi)膜癌提供了新的診斷方法，同時(shí)為子宮內(nèi)膜癌的基因治療提供了新的藥物靶點(diǎn)。
【專利說明】
UHRF1作為子宮內(nèi)膜癌診治標(biāo)志物的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及癌癥診斷、治療、預(yù)測預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測UHRF1異 常為手段的癌癥診斷、預(yù)測預(yù)后方法;及抑制UHRF1基因或蛋白質(zhì)的癌癥治療劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一，在歐美其發(fā)病率已占婦科惡性腫瘤 的第一位。近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展、人們生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)的改變、非正規(guī)的 激素替代治療和性激素濫用等因素，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率明顯上升，且趨于年輕化，成為嚴(yán) 重威脅我國女性健康的生殖道惡性疾病。
[0003] 子宮內(nèi)膜癌占女性惡性腫瘤總數(shù)的7 %，每年新發(fā)病例數(shù)及死亡病例數(shù)分別占女 性惡性腫瘤的3.9%和1.7%。由于地區(qū)間經(jīng)濟(jì)和醫(yī)療服務(wù)體系水平的差異，對(duì)內(nèi)膜癌早期 診斷和治療的水平不同，預(yù)后也明顯不同。雖然在發(fā)展中國家子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率低于發(fā) 達(dá)國家，但其死亡率/發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國家。發(fā)展中國家的死亡率/發(fā)病率為34% (21 000/ 62 000)，5年生存率為67%，而發(fā)達(dá)國家的死亡率/發(fā)病率為21%(29 000/136 000)，5年生 存率為82%。
[0004] 子宮內(nèi)膜癌的高危因素包括肥胖、高血壓、糖尿病、絕經(jīng)延遲、不孕和長期單純雌 激素刺激等。內(nèi)膜癌的高發(fā)年齡為50~60歲，以陰道不規(guī)則出血為主要表現(xiàn)，初次診斷時(shí) 72 %為I期，12 %為Π 期，13 %為ΙΠ 期，3 %為IV期，如早期發(fā)現(xiàn)早期治療，預(yù)后較好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測UHRF1基因或蛋白表達(dá)差異來診斷子宮 內(nèi)膜癌的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測UHRF1基因或蛋白表達(dá)差異來預(yù)測子宮 內(nèi)膜癌預(yù)后的方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種通過抑制UHRF1基因或UHRF1蛋白來治療子宮內(nèi) 膜癌的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的之四在于提供一種用于篩選治療子宮內(nèi)膜癌的藥物的方法。
[0009] 本發(fā)明的目的之五在于提供一種用于治療子宮內(nèi)膜癌的藥物。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供了檢測UHRF1基因或UHRF1蛋白的產(chǎn)品在制備子宮內(nèi)膜癌診斷工具中 的用途。
[0012] 本發(fā)明還提供了檢測UHRF1基因或UHRF1蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后 工具中的用途。
[0013] 進(jìn)一步，所述檢測UHRF1基因或UHRF1蛋白的產(chǎn)品包括檢測UHRF1基因或UHRF1蛋白 的表達(dá)水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合UHRF1基因的核酸或者能夠結(jié)合UHRF1蛋白的物 質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測UHRF1基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠檢測UHRF1蛋白的 表達(dá)水平。
[0014] 本發(fā)明的檢測UHRF1基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能： 如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點(diǎn)雜交、焚光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、AS0法、 高通量測序平臺(tái)等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實(shí)施分析。
[0015] 包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學(xué)合成來獲得，或通過從生物材料制備含有 期望核酸的基因，然后使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸的引物擴(kuò)增它來獲得。
[0016] 進(jìn)一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS (Ampl if i cat ion Refractory Mutation System，擴(kuò)增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴(kuò)增 的核酸可以通過使用點(diǎn)印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特異性寡核苷酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。
[0017] 上面所述的核酸包括擴(kuò)增UHRF1基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化 學(xué)合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)，并通過 化學(xué)合成來制備。
[0018] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述核酸為QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的擴(kuò)增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列）所示。
[0019] 上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學(xué)合成來制備，通過使用本 領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當(dāng)設(shè)計(jì)，并通過化學(xué)合成來制備，或者可以通 過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增期望核酸序列的引物擴(kuò) 增它來制備。
[0020] 本發(fā)明的檢測UHRF1蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能:例如， 可以包括ELI SA、放射免疫測定法、免疫組織化學(xué)法、Wes tern印跡等。
[0021 ]本發(fā)明的檢測UHRF1蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合UHRF1蛋白的抗體或其片段。可以 使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。 本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的?？贵w片段指保留抗 體對(duì)抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽?？贵w片段可以包括 F(at/ )2、Fat/、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區(qū)（雙抗 體）、或含有CDR的肽。本發(fā)明的檢測UHRF1蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的 氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細(xì)胞。
[0022] 抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個(gè)或部分靶 蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體作為抗原。使用抗原免 疫動(dòng)物后，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物獲得免疫細(xì)胞并融合骨髓瘤細(xì)胞以獲得雜交瘤。然后從雜交 瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的UHRF1蛋白或其部分對(duì)獲得的抗體實(shí) 施抗原特異性純化來獲得針對(duì)UHRF1蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w:用與上 文相同的抗原免疫動(dòng)物，從經(jīng)過免疫的動(dòng)物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用 上述抗原對(duì)血清實(shí)施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗 體的序列信息來獲得抗體片段。
[0023] 標(biāo)記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實(shí)施。例如，可 以如下熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用DMS0、緩沖劑、等準(zhǔn) 備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標(biāo)記可使用商品化的標(biāo)記試劑盒，諸 如生物素標(biāo)記試劑盒，如生物素標(biāo)記試劑盒-NH2、生物素標(biāo)記試劑盒-SH (DojindoLaboratories);堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒諸如堿性磷酸酶標(biāo)記試劑盒-NH2、堿性磷 酸酶標(biāo)記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories);過氧化物酶標(biāo)記試劑盒諸如過氧化物酶標(biāo) 記試劑盒-NH2、過氧化物酶標(biāo)記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻膽蛋白標(biāo)記試劑 盒諸如藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2， B-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標(biāo)記試劑盒SH (DojindoLaboratories);焚光標(biāo)記試劑盒諸如焚光素標(biāo)記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor(TM) 555標(biāo)記試劑盒_NH2、HiLyte Fluor(TM)647標(biāo)記試劑盒_NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗體 標(biāo)記試劑盒、Qdot(TM)抗體標(biāo)記試劑盒（Invitrogen Corporation)和EZ-標(biāo)記物蛋白質(zhì)標(biāo) 記試劑盒(Funakoshi Corporation)。為了正確標(biāo)記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標(biāo)記 的抗體或其片段。
[0024] 作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品 或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定;例如，它可以包括組織、血液、血漿、 血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級(jí)分或經(jīng)過處理的材 料。
[0025] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述樣品來自受試者的組織。
[0026] 在本發(fā)明中，"預(yù)后"是指癌癥患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過 程或結(jié)果。在本說明書中，預(yù)后可以是通過手術(shù)處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久時(shí)的生機(jī)狀態(tài)。預(yù)后可以通過檢查生物標(biāo)志物即冊(cè)1^1蛋白或編 碼UHRF1蛋白的基因來預(yù)測。預(yù)后預(yù)測可以這樣進(jìn)行:根據(jù)生物標(biāo)志物的有或無，或者升高 或降低，確定患者的預(yù)后是良好還是不良，或者確定良好預(yù)后或不良預(yù)后的概率。
[0027] 在本發(fā)明中，"預(yù)后良好"是指在通過手術(shù)處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之 后，患者長時(shí)期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況?；蛘撸A(yù)后好可以意 指在這樣長時(shí)間內(nèi)存活、無轉(zhuǎn)移、無復(fù)發(fā)、或無再發(fā)。例如，預(yù)后良好可以意指至少3年或尤 其是至少5年存活，優(yōu)選沒有轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)。預(yù)后良好最優(yōu)選的狀態(tài)是長期無疾病的存活。如 本文中所使用的，"預(yù)后良好"還可以包括任何這樣的狀態(tài)，其中可以發(fā)現(xiàn)疾病如轉(zhuǎn)移，但是 惡性低且不嚴(yán)重地影響生存能力。
[0028] 在本發(fā)明中，"預(yù)后不良"是指患者在通過手術(shù)處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短 時(shí)期（例如1、2、3、4、5年或更短）內(nèi)發(fā)生致命狀況?；蛘撸A(yù)后差是指在這樣的短時(shí)期里死 亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、或再發(fā)。例如，預(yù)后差可以意指至少3年或尤其至少5年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、或死 亡。
[0029] 預(yù)測預(yù)后是指預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果，并不意味著能以100%的準(zhǔn)確度預(yù)測 患者狀況的過程或結(jié)果。預(yù)測預(yù)后是指確定某些過程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意 味著通過與某些過程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結(jié)果的可能性。如本 發(fā)明而言，本發(fā)明中UHRF1基因或UHRF1蛋白的水平升高的患者中，與不顯示該特征的患者 相比，更有可能觀察到特定過程或結(jié)果。
[0030] 進(jìn)一步，所述檢測UHRF1基因或UHRF1蛋白的產(chǎn)品可以是檢測UHRF1基因或UHRF1蛋 白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通 量測序平臺(tái)。
[0031]本發(fā)明還提供了一種診斷子宮內(nèi)膜癌的工具，所述工具能夠檢測UHRF1基因或 UHRF1蛋白的表達(dá)水平。所述工具包括能夠結(jié)合UHRF1基因的核酸或者能夠結(jié)合UHRF1蛋白 的物質(zhì)（例如抗體）。所述核酸能夠檢測UHRF1基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠檢測UHRF1蛋 白的表達(dá)水平。
[0032]進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0033] 進(jìn)一步，所述診斷子宮內(nèi)膜癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量 測序平臺(tái)；高通量測序平臺(tái)是一種特殊的診斷子宮內(nèi)膜癌的工具，隨著高通量測序技術(shù)的 發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人 群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知 UHRF1基因的異常與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)也屬于UHRF1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的工具，所述預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后工具 包括能夠結(jié)合UHRF1基因的核酸或者能夠結(jié)合UHRF1蛋白的物質(zhì)(例如抗體）。所述核酸能夠 檢測UHRF1基因的mRNA水平;所述物質(zhì)能夠檢測UHRF1蛋白的表達(dá)水平。
[0035] 進(jìn)一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。
[0036] 進(jìn)一步，所述預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高 通量測序平臺(tái)；高通量測序平臺(tái)是一種特殊的診斷子宮內(nèi)膜癌的工具，隨著高通量測序技 術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正 常人群的基因表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知 UHRF1基因的異常與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)也屬于UHRF1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0037]本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗UHRF1抗體或其片段所識(shí)別的氨基酸的 數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合UHRF1即可。當(dāng)抗體作為治療藥物時(shí)，優(yōu)選的是它能 夠識(shí)別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制UHRF1功能?？贵w或其片段識(shí)別的氨基酸的數(shù)目是 至少一個(gè)，更優(yōu)選至少三個(gè)?？贵w的免疫球蛋白類別不受限制，可以是IgG、IgM、IgA、IgE、 IgD或IgY。
[0038]本發(fā)明還提供了一種診斷子宮內(nèi)膜癌或預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的方法，所述方法包 括如下步驟：
[0039] (1)獲取受試者的樣品；
[0040] (2)檢測受試者樣品中UHRF1基因或蛋白的表達(dá)水平；
[0041] (3)將測得的UHRF1基因或蛋白的表達(dá)水平與受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。
[0042] (4)與對(duì)照相比，UHRF1基因或蛋白的表達(dá)水平升高，則該受試者被診斷為子宮內(nèi) 膜癌，或該受試者被確定為預(yù)后不良。
[0043]本發(fā)明還提供了一種子宮內(nèi)膜癌的治療方法，所述方法包括抑制UHRF1基因或 UHRF1蛋白。
[0044]進(jìn)一步，所述方法包括抑制UHRF 1基因的表達(dá)，或抑制UHRF 1蛋白的表達(dá)或抑制 UHRF1蛋白的活性。
[0045] 本發(fā)明還提供了一種癌癥藥物的篩選方法，可以通過在對(duì)癌細(xì)胞添加測試藥物后 或在對(duì)癌癥模型動(dòng)物施用測試藥物后的某個(gè)時(shí)期測量UHRF1基因或者UHRF1蛋白的表達(dá)水 平來測定癌癥藥物改善癌癥預(yù)后的效果。更具體地說，當(dāng)UHRF1基因或者UHRF1蛋白的表達(dá) 水平在添加或施用測試藥物后降低時(shí)或者恢復(fù)正常水平時(shí)，可選擇該藥物作為改善癌癥預(yù) 后的治療藥物。
[0046] 本發(fā)明還提供了一種含有UHRF1基因或UHRF1蛋白的抑制劑的藥物。
[0047] 本發(fā)明還提供了上述抑制劑在制備治療子宮內(nèi)膜癌的藥物中的應(yīng)用。
[0048] 本發(fā)明的UHRF 1基因或UHRF 1蛋白的抑制劑不受限制，只要是可以抑制UHRF 1或涉 及UHRF1上游或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)或活性，且對(duì)于治療癌癥有效的藥物即可。
[0049]進(jìn)一步，所述抑制劑包括反義核酸、dsRNA、核酶、適體、UHRF1結(jié)合蛋白片段、或抗 體或其片段。
[0050] "反義核酸"指含有與編碼UHRF1的mRNA互補(bǔ)的序列的核酸。反義核酸可以由DNA、 RNA或二者組成。反義核酸不需要與靶UHRF1的mRNA 100%互補(bǔ)。反義核酸可含有非互補(bǔ)堿 基，只要它能夠在嚴(yán)格條件下特異性雜交即可。當(dāng)將反義核酸引入細(xì)胞時(shí)，它結(jié)合靶多核苷 酸并抑制轉(zhuǎn)錄、RNA加工、翻譯或穩(wěn)定性。除反義多核苷酸之外，反義核酸還包括多核苷酸模 擬物，它含有經(jīng)過修飾的主鏈、和3'和5'端部分。這樣的反義核酸可以根據(jù)UHRF1序列信息 來恰當(dāng)設(shè)計(jì)并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來生成。
[0051 ] "dsRNA"指含有雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，通過RNA干擾(RNAi )來抑制基因表達(dá)的RNA，包括 siRNA(短干擾RNA)和shRNA(短發(fā)夾RNAhdsRNA不需要與靶基因序列具有100%的同源性， 只要它可抑制靶基因表達(dá)即可。為了穩(wěn)定化或其它目的，可以將dsRNA的一部分用DNA替代。 優(yōu)選的是，s i RNA是21 -2 3個(gè)堿基的雙鏈RNA。s i RNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來 制備，例如通過化學(xué)合成或作為天然存在RNA的類似物。shRNA是具有發(fā)夾轉(zhuǎn)角（hairpin turn)結(jié)構(gòu)的短鏈RNA。shRNA可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備，例如通過化學(xué)合 成或通過將編碼shRNA的DNA引入細(xì)胞并表達(dá)DNA。
[0052] "核酶"指具有催化活性的RNA，它能夠切割、粘貼、插入、和轉(zhuǎn)移RNA。核酶的結(jié)構(gòu)可 以包括錘頭、發(fā)夾等。
[0053] "適體"指結(jié)合某物質(zhì)諸如蛋白質(zhì)的核酸。適體可以是RNA或DNA。核酸的形式可以 是雙鏈或單鏈。適體的長度無限制，只要它能夠特異性結(jié)合靶分子即可，可以由例如10至 200個(gè)核苷酸、優(yōu)選10至100個(gè)核苷酸、更優(yōu)選15至80個(gè)核苷酸、進(jìn)一步更優(yōu)選15至50個(gè)核苷 酸組成。適體可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來選擇。例如，可以采用SELEX(通過指數(shù) 式富集進(jìn)行的配體的系統(tǒng)進(jìn)化）。
[0054] "UHRF1結(jié)合蛋白的片段"指結(jié)合UHRF1且抑制UHRF1實(shí)施原始功能的蛋白質(zhì)的片 段。
[0055]本發(fā)明的藥物可以作為醫(yī)藥單獨(dú)施用或與其它藥物一起施用?？梢耘c本發(fā)明的藥 物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發(fā)明的治療性或預(yù)防性藥物的效果即 可，優(yōu)選的是，用于治療或預(yù)防癌癥的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環(huán)磷酰胺、環(huán)磷酰 胺、達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司汀;抗代謝物，諸如 依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽 (cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿啼啶、替加氟吉美啼啶奧替拉西鉀、去氧氟尿 苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達(dá)拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤;植物生物堿，諸 如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和 長春堿;抗癌抗生素，諸如放線菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊達(dá)比星、表柔比星、凈司他丁 stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、啦柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素 C、和米托蒽醌； 基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達(dá)鉑;激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、 雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、 潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應(yīng)修飾 劑，諸如干擾素 α、干擾素 β、干擾素 γ、白介素、烏苯美司、干BCG、和香菇多糖;和分子靶向藥 物，諸如伊馬替尼（imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲 妥單抗、維A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。
[0056] 本發(fā)明的藥物可根據(jù)需要制備成各種劑型。包括但不限于，經(jīng)皮、粘膜、鼻、口頰、 舌下或經(jīng)口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。
[0057] 本發(fā)明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發(fā)揮期望的治療效果或預(yù)防效果即 可，包括但不限于靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，眼內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，肺內(nèi)，口服，小泡內(nèi)，肌肉內(nèi)，氣管內(nèi)，皮下 的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關(guān)節(jié)內(nèi)，心室內(nèi)，直腸，陰道， 顱骨內(nèi)，尿道內(nèi)，肝內(nèi)，瘤內(nèi)。在某些情況下，可以系統(tǒng)地給藥。在某些情況下是局部地給藥。
[0058] 本發(fā)明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預(yù)防效果即可，可 以依據(jù)癥狀、性別、年齡等來恰當(dāng)?shù)拇_定。本發(fā)明的治療藥物或預(yù)防藥物的劑量可以使用例 如對(duì)疾病的治療效果或者預(yù)防效果作為指標(biāo)來確定。
[0059]在本發(fā)明的上下文中，"診斷子宮內(nèi)膜癌"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有子宮內(nèi) 膜癌、也包括判斷受試者是否存在患有子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0060] 本文所用的"治療"涵蓋患有相關(guān)疾病或病癥的哺乳動(dòng)物例如人類中治療相關(guān)的 疾病或疾病狀態(tài)，并且包括：
[0061] (1)預(yù)防疾病或疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，尤其是當(dāng)該哺乳動(dòng)物易感于所述疾 病狀態(tài)，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態(tài)時(shí)；
[0062] (2)抑制疾病或疾病狀態(tài)，即阻止其發(fā)生;或者
[0063] (3)緩解疾病或疾病狀態(tài)，即使疾病或疾病狀態(tài)消退。
[0064] 術(shù)語"治療"通常涉及治療人類或動(dòng)物(例如，被獸醫(yī)所應(yīng)用），其中可達(dá)到某些預(yù) 期的治療效果，例如，抑制病癥的發(fā)展(包括降低發(fā)展速度、使發(fā)展停止）、改善病癥和治愈 病癥。還包括作為預(yù)防措施(例如預(yù)防）的治療。對(duì)還沒有發(fā)展為病癥但有發(fā)展為該病癥危 險(xiǎn)的患者的用途，也包括在術(shù)語"治療"中。
[0065]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0066]本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)了一種診斷子宮內(nèi)膜癌的分子標(biāo)志物，使用該分子標(biāo)志物可以在子 宮內(nèi)膜癌發(fā)生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。
[0067]另外，通過預(yù)測患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方 案策略。
[0068]本發(fā)明的包括UHRF1基因或蛋白的抑制劑的治療藥物可用作新的子宮內(nèi)膜癌的治 療藥物。
【附圖說明】
[0069] 圖1顯示利用QPCR檢測UHRF1基因在子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織中的表 達(dá)情況；
[0070] 圖2顯示利用Western blot檢測UHRF1蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組 織中的表達(dá)情況；
[0071] 圖3顯示利用QPCR檢測siRNA對(duì)UHRF1基因的干擾效率；
[0072]圖4顯示抑制UHRF1蛋白功能對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響。
[0073]具體的實(shí)施方式
[0074]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0075] 實(shí)施例1 UHRF1基因的差異表達(dá)
[0076] 1、樣本收集：
[0077] 子宮內(nèi)膜癌組織樣本:收集子宮內(nèi)膜癌患者，全部患者均經(jīng)手術(shù)治療，手術(shù)石蠟標(biāo) 本10例。所有患者均經(jīng)過病理檢查確診患有子宮內(nèi)膜癌。其他入組條件為:所有患者入院前 未接受過任何治療:未合并其他惡性腫瘤;未合并其他激素相關(guān)性疾病;臨床資料完整。 [0078] 10例子宮內(nèi)膜癌患者，發(fā)病平均年齡58歲。患者主要臨床表現(xiàn)為陰道不規(guī)則出血、 下腹痛、月經(jīng)紊亂、陰道排液等，亦有部分患者無明顯癥狀而于健康查體發(fā)現(xiàn)。子宮內(nèi)膜癌 標(biāo)本經(jīng)HE染色切片，組織形態(tài)學(xué)確診為子宮內(nèi)膜癌。
[0079] 正常子宮內(nèi)膜組織樣本：10例正常子宮內(nèi)膜手術(shù)石蠟標(biāo)本。樣本來源的病人所患 疾病包括:子宮肌瘤、子宮脫垂、膀朧膨出、直腸膨出。
[0080] 2、組織RNA的獲取
[0081 ] 使用Trizol-步法提取組織總RNA，通過Nanodrop ND-1000讀取260nm和280nm處 的吸光度值(A)測定RNA溶液的純度。經(jīng)1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察， 檢測RNA的完整性。
[0082] 3、基因芯片雜交及掃描
[0083] 總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對(duì)標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美 國Agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4x 44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0084] 4、芯片數(shù)據(jù)處理與分析
[0085]雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對(duì)于兩組比值 的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。
[0086] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0087]采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著性意義。
[0088] 6、結(jié)果
[0089] 芯片結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織與正常子宮內(nèi)膜組織之間共篩選出654個(gè)差異表 達(dá)基因，其中表達(dá)水平上調(diào)的基因421個(gè)，表達(dá)水平下調(diào)的基因233個(gè)。
[0090] 實(shí)施例2大樣本驗(yàn)證篩選出的差異表達(dá)基因
[0091] 考慮現(xiàn)有技術(shù)中還未見關(guān)于該基因與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)性進(jìn)行研究的基因作為候 選基因，同時(shí)考慮基因測序的結(jié)果，選擇UHRF1基因（其表達(dá)在子宮內(nèi)膜癌組織中上調(diào))進(jìn)行 驗(yàn)證。
[0092] 1、樣本收集
[0093]按照實(shí)施例1的方法收集子宮內(nèi)膜癌組織50例，正常子宮內(nèi)膜組織60例。
[0094] 2、在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證
[0095] 2.1提取組織RNA [0096]步驟同實(shí)施例1。
[0097] 2.2逆轉(zhuǎn)錄
[0098] 使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lyg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μ1 反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取lyg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分:DEPC水，5 X逆 轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mm〇l/l dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 MMLVRT，模板 RNA。42 °C孵育1小時(shí)，72 °C 10分鐘，短暫離心。
[0099] 2.3 PCR
[0100] 使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)mRNA焚光定量上下游PCR引物，合成 引物序列，使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒操作，具體步驟按說明書進(jìn)行操作，采 用25μ1反應(yīng)體系，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行管，所有擴(kuò)增反應(yīng)均重復(fù)三次以上以保證結(jié)果的可 靠性。配制以下反應(yīng)體系(如表1所示），各項(xiàng)操作均于冰上進(jìn)行：
[0101]表1熒光定量PCR各組分及相應(yīng)體積
[0103] 以GAH)H為內(nèi)參，以SYBR Green I作為熒光標(biāo)記物，在Light Cycler熒光定量PCR 儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，△ ACT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0104] UHRF1基因引物序列如下所示：
[0105] 上游引物：5'-TATGAGGATGATGTGGAC-3'（SEQ ID N0.1);
[0106] 下游引物：5'-TGTTGGTGAGTTTCTGAT-3'（SEQ ID N0.2)。
[0107] GAPDH基因引物序列如下所示：
[0108] 上游引物：5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0109] 下游引物：5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.4)
[0110] 2.4 結(jié)果
[0111] 結(jié)果如圖1所示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中UHRF1基因的mRNA 水平明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)
[0112] 3、在蛋白水平上進(jìn)行驗(yàn)證
[0113] 3.1提取組織總蛋白
[0114]按照EpiQuik組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒的說明書進(jìn)行蛋白提取的操作。
[0115] 3.2 Western blot檢測
[0116] 將提取的蛋白定量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、 顯色。
[0117] 3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0118]將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將UHRF1蛋白 條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0119] 3.4 結(jié)果
[0120] 結(jié)果如圖2所示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中UHRF1蛋白水平顯 著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05)。
[0121] 實(shí)施例3抑制UHRF1基因表達(dá)
[0122] l、siRNA 設(shè)計(jì)合成
[0123] 針對(duì) UHRF1 的 siRNA 序列：
[0124] 正義鏈為5'-ACUCAUUGACCUUGUACAGCC-3'（SEQ ID N0.5)
[0125] 反義鏈為5'-CUGUACAAGGUCAAUGAGUAC-3'（SEQ ID N0.6);
[0126] 以上s i RNA序列與陰性對(duì)照s i RNA序列（s i RNA-NC)均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公 司提供。
[0127] 2、子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0128] 2.1細(xì)胞培養(yǎng)
[0129] Ishikawa3-H-12細(xì)胞系均用50ml的培養(yǎng)瓶貼壁培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清，l〇〇U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素）中，在37 °C，5 %⑶2飽和濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培 養(yǎng)。
[0130] 2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0131] (1)轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，在500μ1無抗培養(yǎng)基中接種0.5-2*105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合 度為30-50%。鋪板時(shí)要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長。
[0132] (2)用50μ1無血清培養(yǎng)基稀釋siRNA(轉(zhuǎn)染細(xì)胞的終濃度為33ηΜ，輕輕吹吸3-5次混 勻。
[0133] (3)輕輕顛倒混勾轉(zhuǎn)染試劑，用50μ1無血清培養(yǎng)基稀釋?duì)│蘈 Lipofectamine2000輕 輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置5min。
[0134] (4)混合轉(zhuǎn)染試劑和siRNA稀釋液，輕輕吹吸3-5次混勻，室溫下靜置20min。
[0135] (5)轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到24孔細(xì)胞板中，100μ1/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。
[0136] (6)細(xì)胞板置于37 °C，5 %C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-48小時(shí)。轉(zhuǎn)染4-6小時(shí)后可換鮮培養(yǎng) 基。
[0137] 3、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測s iRNA的干擾效率
[0138] 3.1提取細(xì)胞總RNA利用常規(guī)方法進(jìn)行操作。
[0139] 3.2逆轉(zhuǎn)錄
[0140] 步驟同實(shí)施例2。
[0141] 3.3 QPCR
[0142] 步驟同實(shí)施例2。
[0143] 3.4結(jié)果
[0144] 結(jié)果如圖3所示，siRNA-UHRFl能夠有效的抑制UHRF1基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué) 意義(P〈0.05)。
[0145] 實(shí)施例4 UHRF1基因的表達(dá)對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖能力的測定
[0146] 1、步驟：
[0147] 應(yīng)用5-溴-2'脫氧尿嘧啶(Brd U)標(biāo)記及檢測試劑盒。參照試劑盒使用說明，細(xì)胞 轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3)48小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)基，加入Brd U標(biāo)記培養(yǎng)基，37°C，5 %⑶2培 養(yǎng)箱中培育60min。棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗后，以70 %乙醇固定，過夜。用一抗為小鼠的抗Brd U抗體，二抗為帶FITC的抗小鼠的熒光抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)。然后進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測。
[0148] 2、Brd U摻入結(jié)果：
[0149] 結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染siRNA-NC細(xì)胞組摻入率平均為：（26.86± 1.43) % ; siRNA-UHRFl細(xì) 胞組摻入率平均為（10.12 ±0.76) %，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， UHRF1基因表達(dá)促進(jìn)了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。
[0150] 實(shí)施例5子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞抗體中和實(shí)驗(yàn)
[0151] 1、步驟：
[0152]將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa3-H-12接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2*103個(gè)細(xì)胞/ 孔/200μ1，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行如下處理：
[0153] 實(shí)驗(yàn)組1(對(duì)照組）：子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中加入無關(guān)單抗(1:50);
[0154] 實(shí)驗(yàn)組2:子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中加入抗人UHRF1單抗(1:50)。
[0155] 將細(xì)胞在37°C、5%⑶2培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)后，加入3H-TdR(lyCi/孔），再培養(yǎng)24小 時(shí)，收集細(xì)胞，加液體閃爍液，β計(jì)數(shù)儀檢測cpm值。
[0156] 2、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0157] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0158] 3、結(jié)果
[0159] 結(jié)果如圖4所示，相比于對(duì)照組，加入抗人UHRF1單抗的細(xì)胞組細(xì)胞增殖減緩。上述 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制UHRF1蛋白的功能可以抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。
[0160] 實(shí)施例6流式細(xì)胞儀測定UHRF1基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
[0161] 購買BD公司的AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。
[0162] 1、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
[0163] 步驟同實(shí)施例3。
[0164] 2、凋亡檢測
[0165] (1)細(xì)胞用不含的胰酶消化收集；
[0166] (2)用洗滌細(xì)胞二次(離心收集細(xì)胞5*105);
[0167] (3)加入500μ1 binding buffer懸浮細(xì)胞；
[0168] (4)加入5μ1 AnnexinV-FITC混勾后，加入5μ1 Propidium Iodide混勾；
[0169] (5)室溫、避光、反應(yīng) 5-15min;
[0170] (6)在lh內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測；
[0171 ] (7)用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長Ex = 488nm發(fā)射波長Em = 530nm。
[0172] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：
[0173]實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0174] 4、結(jié)果：
[0175] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-NC細(xì)胞組細(xì)胞平均凋亡率為12%，轉(zhuǎn)染siRNA-UHRFl組 細(xì)胞平均凋亡率為38%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
[0176] 實(shí)施例7Transwell實(shí)驗(yàn)檢測UHRF1基因表達(dá)對(duì)細(xì)胞迀移的影響
[0177] 步驟：
[0178] 1、從-80 °C的冰箱中取出凍存的Matr i ge 1物，然后在4 °C溫度條件下過夜，使其變 成液體。
[0179] 2、取出200μ1無血清細(xì)胞培養(yǎng)基，加入50μ1的Matrigel試劑，在低溫條件，最好是 在冰面上操作將其混和均勻，然后各加入1〇〇μ1，放在37°C，二氧化碳的培養(yǎng)箱中培育5h，此 間常觀察液體情況，當(dāng)液體變成稍白色時(shí)，說明其已變?yōu)槟虘B(tài)。
[0180] 3、將轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞(按照實(shí)施例3步驟操作）用胰酶消化，用不含血清的培養(yǎng)基清 洗3次，然后計(jì)數(shù)，再將其配成細(xì)胞懸浮液。
[0181] 4、用無血清的培養(yǎng)基將凝膠輕輕洗1次，然后將2*105細(xì)胞懸浮于100μΙ RPMI 1640中，再接種于transwell上室。
[0182] 5、下室加600μ1 10%FBS RPMI 1640。
[0183] 6、37 °C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12h后，取出transwe 11小室，每組均重復(fù)4個(gè)樣本。
[0184] 7、其中1個(gè)小室棄去培養(yǎng)基，用無鈣的roS洗3遍，4%多聚甲酵固定10min，棉簽擦 掉上層未迀移的細(xì)胞，PBS洗3遍，結(jié)晶紫染色或Giemsa染色，在顯微鏡下觀察。剩余3個(gè)小室 將其下層迀移細(xì)胞用0.25%膜蛋白酶消化，計(jì)算迀移細(xì)胞數(shù)。
[0185] 結(jié)果：
[0186] 迀移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染siRNA-NC細(xì)胞組細(xì)胞迀移個(gè)數(shù)平均為228個(gè)，轉(zhuǎn)染siRNA-UHRF1細(xì)胞組細(xì)胞迀移個(gè)數(shù)平均為102個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
[0187] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測UHRFl基因或UHRFl蛋白的產(chǎn)品在制備診斷子宮內(nèi)膜癌或預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后 的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述檢測UHRFl基因或UHRF1蛋白的產(chǎn)品包 括檢測UHRFl基因或UHRFl蛋白的表達(dá)水平的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合UHRF1基因的核 酸或者能夠結(jié)合UHRFl蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測UHRFl基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能 夠檢測UHRFl蛋白的表達(dá)水平。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述核酸是實(shí)時(shí)定量PCR中使用的特異擴(kuò) 增UHRFl基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。5. -種診斷子宮內(nèi)膜癌或預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的工具，其特征在于，所述工具包括能 夠檢測UHRFl基因或UHRFl蛋白的表達(dá)水平的工具。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能夠結(jié)合UHRFl基因的核酸 或者能夠結(jié)合UHRFl蛋白的物質(zhì);所述核酸能夠檢測UHRFl基因的表達(dá)水平;所述物質(zhì)能夠 檢測UHRFl蛋白的表達(dá)水平。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是實(shí)時(shí)定量PCR中使用的特異擴(kuò) 增UHRFl基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。8. -種治療子宮內(nèi)膜癌的藥物，其特征在于，所述藥物包含UHRFl基因或UHRFl蛋白的 抑制劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物，其特征在于，所述抑制劑能夠抑制UHRFl或涉及UHRFl上 游或下游途徑的物質(zhì)的表達(dá)或活性。10. 權(quán)利要求8或9所述的抑制劑在制備治療子宮內(nèi)膜癌的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105886660SQ201610494676
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月29日
【發(fā)明人】楊承剛, 常鵬, 孫耀蘭
【申請(qǐng)人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司