一種人子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)志物、抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明通過將來自人子宮內(nèi)膜癌腫瘤蛋白免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)了一種新的人子宮內(nèi)膜癌腫瘤標(biāo)志物，命名為GAB31，其為異常糖基化的CD44，其特征是在CD44上包含抗原表位的糖結(jié)構(gòu)Galb1?3(Neu5Aca2?6)GlcNAcb1?4Galb1?4Glcb，另外，通過篩選特異性識別所述抗原的單克隆抗體，獲得一株可以特異性識別所述抗原的抗體，通過針對臨床樣本的免疫磁珠實驗，發(fā)現(xiàn)，所述的抗體識別抗原GAB31的檢測方法EM2D9?MB的陽性檢出率明顯高于常規(guī)的脫落細胞鏡檢方法。CGMCC No.1179620151223
【專利說明】
一種人子宮內(nèi)膜癌的標(biāo)志物、抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及一種新型子宮內(nèi)膜癌腫瘤標(biāo)志物GAB31， 以及抗GAB31的單克隆抗體EM2D9。細胞和組織學(xué)水平證明：EM2D9特異性識別人子宮內(nèi)膜癌 細胞及人子宮內(nèi)膜癌組織。本發(fā)明還涉及一個免疫磁珠法檢測人子宮內(nèi)膜癌的方法。該檢 測方法所檢測的抗原為本發(fā)明中的人的子宮內(nèi)膜癌新型標(biāo)記物GAB31，檢測抗體為本發(fā)明 中抗人子宮內(nèi)膜癌GAB31的單克隆抗體EM2D9。
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高居歐美國家女性 生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位。相對于歐美國家，發(fā)展中國家子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率較低，但死亡率較 高。隨著我國百姓的生活及飲食習(xí)慣趨于西化，尤其是經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率 正逐年增高，目前居我國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位，僅次于宮頸癌，且發(fā)病年齡漸趨 年輕化。子宮內(nèi)膜癌的病因至今尚不明確。雖然子宮內(nèi)膜癌的早期診斷方法有經(jīng)陰道超聲、 子宮內(nèi)膜活檢、診斷性刮宮、子宮內(nèi)膜細胞學(xué)等諸多方法，但對于在無癥狀的普通人群和危 險人群中篩查子宮內(nèi)膜癌的方法，業(yè)內(nèi)當(dāng)前尚沒有形成統(tǒng)一的指南或建議。因而，探索子宮 內(nèi)膜癌篩查的策略是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界子宮內(nèi)膜癌研究的熱點領(lǐng)域。目前子宮內(nèi)膜癌的常用診斷 方法用于篩查策略，都或多或少有著比較大的缺陷。經(jīng)陰道超聲無法確定子宮內(nèi)膜病變時 內(nèi)膜厚度的界值;接受子宮內(nèi)膜活檢者或多或少有著不適感，而且有相當(dāng)比例的受檢者因 為組織取材量不足導(dǎo)致漏診;診斷性刮宮是有創(chuàng)性操作，納入篩查策略顯然不合適，且受制 于醫(yī)療水平的原因，非發(fā)達地區(qū)無法普及；宮腔鏡檢查費用高昂，且單獨運用診斷價值有 限;子宮內(nèi)膜細胞學(xué)的特點最接近篩查策略，但是，當(dāng)前缺乏統(tǒng)一的細胞學(xué)標(biāo)準(zhǔn)?？梢?，子宮 內(nèi)膜癌的篩查策略仍需要進一步的探究。
[0003] 近年來，腫瘤標(biāo)志物由于其較高的特異性和靈敏度的特點，對腫瘤的篩查、診斷、 分類、預(yù)后監(jiān)測以及治療提供相當(dāng)大的指導(dǎo)意義。有研究表明CD44參與子宮內(nèi)膜癌細胞的 侵襲和轉(zhuǎn)移。CD44屬于細胞多功能粘附分子，是單基因編碼的一種跨膜糖蛋白，其廣泛存在 于多種細胞和組織。CD44有10個變異外顯子，因而其可以通過選擇性剪切、拼接形成多種異 構(gòu)體，結(jié)合細胞表面相應(yīng)配體，進而能夠調(diào)節(jié)細胞的多種生理、病理過程。研究表明，CD44分 子在多種腫瘤中高表達，并與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移能力以及腫瘤環(huán)境中的造血干細 胞的歸巢密切相關(guān)，并可作為腫瘤干細胞的標(biāo)志物，或可作為腫瘤篩查、預(yù)后判斷及治療的 靶點。CD44的生物學(xué)功能及表達調(diào)控模式因不同條件而異，比如腫瘤種類、生長條件。多種 因素可影響其表達，如雌激素受體、轉(zhuǎn)錄因子等。CD44的異常糖基化修飾可導(dǎo)致腫瘤細胞惡 性程度的改變，探究子宮內(nèi)膜癌中CD44的異常修飾，可為子宮內(nèi)膜癌的篩查、診斷、預(yù)后判 斷及治療提供一種新的靶點，對于子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療將具有極其重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明從新鮮的人子宮內(nèi)膜癌組織中提取總蛋白免疫小鼠，制備雜交瘤細胞株。 用ELISA的方法篩選到一株能與人子宮內(nèi)膜癌組織高度特異結(jié)合的抗體EM2D9,該抗體屬于 IgGl亞類。免疫組織化學(xué)證實，EM2D9抗體與人子宮內(nèi)膜癌組織呈強陽性反應(yīng)，而與人正常 子宮內(nèi)膜組織無交叉反應(yīng)。
[0005] 本發(fā)明通過免疫沉淀結(jié)合質(zhì)譜與糖芯片結(jié)果鑒定，EM2D9抗體識別的抗原是一種 異常糖基化的CD44,其定位于細胞膜上，其表位為：6 &1131-3(如1154〇&2-6)61〇麻(^1-4Ga I b I - 4GI cb屬于全新的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)志物。
[0006] 本發(fā)明將EM2D9抗體偶聯(lián)納米磁顆粒，制備成抗子宮內(nèi)膜癌免疫磁珠(EM2D9-MB)， 捕獲并富集脫落的子宮內(nèi)膜癌細胞，經(jīng)瑞氏吉姆薩病理涂片染色，在顯微鏡下進行鏡檢診 斷。該試劑盒適用于腫瘤病人的早期篩查、預(yù)后監(jiān)測及病理輔助診斷。
[0007] 本發(fā)明的創(chuàng)新性在于：（1)篩選并制備了一種抗人子宮內(nèi)膜癌的單克隆抗體 EM2D9，該抗體與人子宮內(nèi)膜癌組織呈強陽性反應(yīng)，而與人正常子宮內(nèi)膜組織無交叉反應(yīng)； (2)揭示了 EM2D9 抗體識別的抗原表位為 Galbl-3(Neu5Aca2-6)GlcNAcbl-4Galbl-4Glcb，為 全新的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)志物；（3)開發(fā)了一種基于EM2D9抗體的高靈敏度的用于檢測人子宮內(nèi) 膜癌的免疫磁珠方法。
[0008] 發(fā)明詳述
[0009] 本發(fā)明提供了一種全新的人子宮內(nèi)膜癌腫瘤標(biāo)志物一異常糖基化的CD44，命名為 GAB31。并獲得了產(chǎn)生抗GAB31的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株分泌單克隆 抗體 EM2D9,單克隆抗體 EM2D9 識別的抗原表位為 Galbl-3(Neu5Aca2-6)GlcNAcbl-4Galbl-4Glcb。該單克隆抗體與人子宮內(nèi)膜癌組織呈強陽性反應(yīng)，而與人正常子宮內(nèi)膜組織無交叉 反應(yīng)。本發(fā)明還提供了基于單克隆抗體EM2D9的體外子宮內(nèi)膜癌診斷的免疫磁珠(EM2D9-MB)診斷方法。
[0010]具體地，本發(fā)明提供了一種異常糖基化的人子宮內(nèi)膜癌腫瘤標(biāo)志物GAB31，其為異 常糖基化的CD44,其特征是在CD44上包含抗原表位的糖結(jié)構(gòu)Galbl-3(Neu5Aca2-6) GlcNAcbl-4Galbl-4Glcb〇
[0011] 在一個優(yōu)選方案中，所述⑶44的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0012] 本發(fā)明的另一個目的是提供針對本發(fā)明所述的人子宮內(nèi)膜癌標(biāo)志物GAB31的抗 體，其能夠特異性識別所述作為抗原表位的糖結(jié)構(gòu)6&1131-3(如1154〇32-6)61〇財〇131-4Ga I b I - 4GI cb，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測人子宮內(nèi)膜癌的試劑盒，其包含本發(fā)明 上述的抗體EM2D9。一個優(yōu)選實施方案中，所述的抗體是抗人子宮內(nèi)膜癌GAB31的單克隆抗 體EM2D9,該單克隆抗體由保藏號為CGMCC No. 11796的雜交瘤細胞株分泌。該雜交瘤細胞株 為小鼠抗人子宮內(nèi)膜癌單克隆抗體細胞株，保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
[0014] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種綴合物，其中包含所述抗人子宮內(nèi)膜癌GAB31與 選自以下組分組成的物質(zhì)綴合:生物標(biāo)記物、抗腫瘤藥物、毒素和放射性活性劑。
[0015] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測或治療人子宮內(nèi)膜癌的試劑盒，其中包 含本發(fā)明上述的抗體。
[0016] 在一個優(yōu)選實施方案中，在所述的試劑盒中，所述的檢測是通過單克隆抗體EM2D9 偶聯(lián)納米磁顆粒進行，優(yōu)選將EM2D9抗體偶聯(lián)納米磁顆粒，制備成抗子宮內(nèi)膜癌免疫磁珠 (EM2D9-MB)。在一個優(yōu)選實施方案中，所述待測樣品是含人子宮內(nèi)膜癌脫落細胞宮腔刮取 物。
[0017]本發(fā)明的另一個目的是提供分泌抗人子宮內(nèi)膜癌GAB31的單克隆抗體EM2D9的雜 交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC No. 11796。
【附圖說明】
[0018]圖I. EM2D9單抗對人子宮內(nèi)膜癌組織切片的免疫組化圖。
[0019]圖2. EM2D9單抗對人正常子宮內(nèi)膜組織切片的免疫組化圖。
[0020]圖3.糖芯片檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0022]下文將參考實施例詳細描述本發(fā)明，所述實施例僅是意圖舉例說明本發(fā)明，而不 是意圖限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的范圍由后附的權(quán)利要求具體限定。
[0023] 實施例1 :EM2D9單克隆抗體的制備和純化 [0024] (1)雜交瘤的制備
[0025] 1)動物免疫及細胞培養(yǎng):采用新鮮的人子宮內(nèi)膜癌組織蛋白勻漿液免疫Balb/C小 鼠（購買自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），以每只20ug總蛋白的劑量進行腹腔注 射方式免疫小鼠。兩周后對小鼠再次免疫。小鼠血清效價達到要求后，加強免疫一次，3天后 取小鼠脾臟，制備成淋巴細胞懸液，準(zhǔn)備細胞融合。復(fù)蘇骨髓瘤細胞3?2/0以1'(：(：0此-17 7 2 )，并用8 - AG (8氮雜鳥嘌呤)篩選以維持細胞對HA T的敏感性。
[0026] 2)細胞融合:將步驟1)制備的淋巴細胞懸液與骨髓瘤細胞進行融合，具體方法參 照《精編免疫學(xué)實驗指南》（（美國）J. E.科學(xué)根(美國）D. H.馬古利斯等，科學(xué)出版社，2009年 1月出版）。將融合后細胞懸液加入含有飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。融合24小時后，加 HAT選擇 培養(yǎng)基（購自Invitrogen公司；HAT即H:Hypoxanthine次黃噪呤，A: Aminopterin甲氨噪呤， T: Thymidine胸腺啼啶核苷)進行選擇性培養(yǎng)。
[0027] 3)抗體檢測:通過ELISA方法確定分泌抗體的雜交瘤細胞株。具體方法是：提取子 宮內(nèi)膜癌組織總蛋白，用0.05mo 1/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)4°C包被過夜，加入10%BSA 37°C 封閉3小時。PBST洗滌3次，然后再加入IOOul待檢上清，37°C孵育lh。洗滌3次，加入抗鼠的辣 根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG-HRP(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），37°C孵育lh。洗 滌3次，加入50ul TMB(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）顯色，室溫靜置5min后，加入 50u 1終止液。用酶標(biāo)儀讀取波長為450nm的OD值。OD值大于陰性對照OD值的2倍以上的視為 陽性。
[0028] 3)雜交瘤的克隆化和凍存:使用有限稀釋法將篩選出的陽性雜交瘤細胞進行克隆 化培養(yǎng)。經(jīng)過3輪的克隆化培養(yǎng)，篩選出高效價單克隆抗體的雜交瘤細胞克隆擴大培養(yǎng)。
[0029] 本發(fā)明中獲得的一種陽性雜交瘤細胞株為抗人子宮內(nèi)膜癌的單克隆雜交瘤細胞 株，該雜交瘤細胞株于2015年12月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(CGMCC，中國，北京），保藏號為CGMCC No · 11796。
[0030] (2)EM2D9單抗的制備和純化
[0031] 將上述穩(wěn)定分泌單克隆抗體EM2D9的雜交瘤細胞株(保藏號CGMCC No. 11796)擴大 培養(yǎng)，并收集細胞培養(yǎng)上清。采用Protein G對單抗EM2D9進行親和層析純化，簡單步驟是： 首先用PBS平衡Protein G親和層析柱(購自"GE"公司）；然后將含EM2D9單抗的細胞培養(yǎng)上 清過Protein G親和層析柱;隨后用PBS洗滌層析柱，直到流出柱子的洗滌液的OD值接近零； 使用0.2M的甘氨酸-HCL溶液(PH2.8)洗脫柱子，分管收集洗脫液，測定各收集管的OD值。含 EM2D9單抗的洗脫液經(jīng)PBS透析濃縮后-20°C凍存。
[0032] 實施例2:EM2D9單克隆抗體的鑒定
[0033]使用實施例1中制備的EM2D9單抗對人子宮內(nèi)膜癌組織和人正常子宮內(nèi)膜組織切 片，結(jié)果如圖1、2所示。結(jié)果表明，人子宮內(nèi)膜癌組織經(jīng)EM2D9單抗免疫組化染色顯色后呈 現(xiàn)陽性反應(yīng)（圖1)，而人正常子宮內(nèi)膜組織經(jīng)EM2D9單抗免疫組化染色顯色后呈現(xiàn)陰性反應(yīng) (圖 2)。
[0034]使用實施例1中制備的EM2D9單抗，免疫組化檢測人子宮內(nèi)膜癌組織、人正常子宮 內(nèi)膜組織和其它組織，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，EM2D9抗體與人子宮內(nèi)膜癌組織呈強陽性 反應(yīng)，而與人正常子宮內(nèi)膜組織和其它組織無交叉反應(yīng)。
[0035]表 1
[0036] 免疫組化檢測抗人子宮內(nèi)膜癌單抗EM2D9對多種組織的免疫反應(yīng)
[0038] 實施例3:GAB31抗原的制備
[0039] 1)總蛋白提取:50mg人子宮內(nèi)膜癌組織，剪碎研磨成勻漿后，加入1ml的三去污裂 解液，4°C裂解5分鐘，12000rpm離心20分鐘，取上清，即為人子宮內(nèi)膜癌組織總蛋白。
[0040] 2)免疫沉淀:加入IOOug EM2D9單抗，4°C孵育2h。
[0041 ] 3)抗原鑒定：加入50ul Protein G beads，4°C孵育2h。用PBS洗滌beads，然后用 〇. 2M的甘氨酸-HCL溶液(PH 2.8)洗脫beads，進行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜結(jié)果如表2所示。質(zhì)譜結(jié)果 表明，EM2D9的抗原為⑶44。經(jīng)過分析EM2D9的糖心片數(shù)據(jù)(如圖3所示)發(fā)現(xiàn)，EM2D9單抗識別 的抗原表位為人CD44的糖鏈，該表位是Galbl-3(Neu5Aca2-6)GlcNAcbl-4Galbl-4Glcb。由 于EM2D9單抗只特異性的識別人子宮內(nèi)膜癌組織，表明該抗原為異常糖基化修飾的CD44,其 表位Galbl-3(Neu5Aca2-6)GlcNAcbl-4Galbl-4Glcb只表達于人子宮內(nèi)膜癌組織細胞。 [0042]表 2
[0043] EM2D9抗原的質(zhì)譜鑒定
[0045]實施例4:人子宮內(nèi)膜癌免疫診斷試劑的制備
[0046]利用本發(fā)明中所制備的單抗EM2D9,本發(fā)明我們將EM2D9抗體偶聯(lián)納米磁顆粒，制 備成抗子宮內(nèi)膜癌免疫磁珠(EM2D9-MB)。將其與宮腔刮取物混合，捕獲并富集脫落的子宮 內(nèi)膜癌細胞，經(jīng)瑞氏吉姆薩病理染色，在顯微鏡下進行診斷。該試劑盒適用于腫瘤病人的早 期篩查、預(yù)后監(jiān)測及病理輔助診斷。實驗證實本發(fā)明的人子宮內(nèi)膜癌免疫診斷試劑與已有 技術(shù)相比具有以下積極效果：（1)靈敏度高，由于偶聯(lián)單抗EM2D9免疫磁顆粒的富集作用，該 方法的靈敏度遠高于常規(guī)的脫落細胞學(xué)的檢測方法；（2)特異性強，由于該方法偶聯(lián)了特異 性結(jié)合子宮內(nèi)膜癌組織細胞的EM2D9抗體，它能特異性的識別子宮內(nèi)膜癌細胞；（3)方便快 捷，節(jié)省患者就醫(yī)費用，由于該方法靈敏度高、特異性強等特點，對子宮內(nèi)膜癌患者的檢出 率高，避免患者反復(fù)就醫(yī)確診，節(jié)省費用。
[0047]具體實驗方法如下：
[0048] 1)宮腔刮取物采集:子宮內(nèi)膜癌患者來自北京大學(xué)第三醫(yī)院。
[0049] 2)子宮內(nèi)膜細胞的富集:將偶聯(lián)EM2D9抗體的磁顆粒與患者的宮腔刮取物溫孵育 20min，然后使用磁力架將磁顆粒與患者的宮腔刮取物分離，從而富集子宮內(nèi)膜癌細胞；
[0050] 3)瑞氏吉姆薩病理染色:將步驟2)富集得到的子宮內(nèi)膜癌細胞進行瑞氏吉姆薩病 理染色，并制備染色玻片用于鏡檢。
[0051] 4)鏡檢診斷:根據(jù)子宮內(nèi)膜癌細胞的形態(tài)特征，判斷病理染色結(jié)果。
[0052] EM2D9-MB法與常規(guī)涂片法陽性檢出率比較結(jié)果，如表3所示。結(jié)果表明，采用 EM2D9-MB檢測了來自北京大學(xué)第三醫(yī)院32例子宮內(nèi)膜癌患者的宮腔刮取物，EM2D9-MB的陽 性檢出率為90.63 % (29/32)，遠高于常規(guī)脫落細胞涂片的陽性檢出率43.75 % (14/32)。因 此，子宮內(nèi)膜癌細胞特異表達的GAB31是一個很有應(yīng)用前景的子宮內(nèi)膜癌標(biāo)志物，抗子宮內(nèi) 膜癌免疫磁珠(EM2D9-MB)是一種簡單高效的子宮內(nèi)膜癌診斷試劑。
【主權(quán)項】
1. 一種人子宮內(nèi)膜癌腫瘤標(biāo)志物GAB31，其為異常糖基化的CD44,所述異常糖基化的 CD44 是指 CD44 帶有作為抗原表位的糖結(jié)構(gòu) Galbl-3(Neu5Aca2-6)GlcNAcbl-4Galbl-4Glcb， 命名為GAB31。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的人子宮內(nèi)膜癌腫瘤標(biāo)志物GAB31，其中所述CD44的氨基酸序列 如SEQ ID No:l所示。3. -種針對根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人子宮內(nèi)膜癌腫瘤標(biāo)志物GAB31的抗體，其能夠 特異性識別所述作為抗原表位的糖結(jié)構(gòu)Galbl-3(Neu5Aca2-6)GlcNAcbl-4Galbl-4Glcb，所 述抗體為特異性抗人子宮內(nèi)膜癌CD44的單克隆抗體EM2D9，該單克隆抗體有保藏號為CGMCC No. 11796的雜交瘤細胞株分泌。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述標(biāo)志物或權(quán)利要求3所述的抗體用于制備診斷子宮內(nèi)膜癌試劑 的應(yīng)用。5. -種綴合物，其中抗人子宮內(nèi)膜癌CD44的抗體HM2D9與選自以下組分組成的綴合物： 生物標(biāo)記物、抗腫瘤藥物、毒素、放射性活性劑、磁珠，所述抗體EM2D9為單克隆抗體，由保藏 號為CGMCC No. 11796的雜交瘤細胞株分泌。6. -種用于檢測或治療人子宮內(nèi)膜癌的試劑盒，其中包含根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的抗 原或抗體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述檢測是通過免疫磁珠法進行，所述免疫磁珠 法是采用將權(quán)利要求3所述的抗體EM2D9偶聯(lián)納米磁顆粒，制備成抗子宮內(nèi)膜癌免疫磁珠 EM2D9-MB。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其中待測樣品是含子宮內(nèi)膜癌脫落細胞的人宮腔 刮取物。9. 分泌抗人子宮內(nèi)膜癌CD44的抗體EM2D9的雜交瘤細胞株，其保藏號為CGMCC Νο·11796〇
【文檔編號】G01N33/68GK105859872SQ201610426014
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月15日
【發(fā)明人】李翀, 史桂芝
【申請人】李翀