一種治療缺血性腦中風的藥物組合物及其制備方法與用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種治療缺血性腦中風的藥物組合物及其制備方法與用途。該治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成包括：NADPH 3～12重量份，夾竹桃麻素0.5～8重量份。本發(fā)明通過將NADPH和夾竹桃麻素聯(lián)合給藥，二者在特定的配比下共同作用，該藥物組合物能降低腦梗死體積，顯著改善腦缺血小鼠行為障礙，減輕腦水腫，提高小鼠長期生存的能力和增強神經(jīng)功能康復；而且，該藥物組合物對缺血性腦中風的治療效果顯著優(yōu)于二者單獨給藥對缺血性腦中風的治療效果，NADPH和夾竹桃麻素聯(lián)合給藥具有協(xié)同增效的作用。這表明，該藥物組合物具有治療缺血性腦中風的作用，可以作為潛在的治療缺血性腦中風的藥物。
【專利說明】
一種治療缺血性腦中風的藥物組合物及其制備方法與用途
技術領域
[0001]本發(fā)明屬于藥物領域，具體涉及一種治療缺血性腦中風的藥物組合物及其制備方法與用途。
【背景技術】
[0002]腦卒中(Stroke)，又稱腦中風或腦血管意外，是一種突然起病的腦血液循環(huán)障礙性疾病，是威脅人類健康的三大疾病之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復發(fā)率高的特點。腦卒中是指在腦血管疾病的病人，因各種誘發(fā)因素引起腦內(nèi)動脈狹窄，閉塞或破裂，而造成急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上表現(xiàn)為一過性或永久性腦功能障礙的癥狀和體征。腦卒中分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。近年來，我國的腦血管疾病患者逐年上升，以缺血性腦血管病最多見，約占20-25% ο目前，我國每年新發(fā)腦中風300-350萬人，死亡率高，存活者中約75%致殘，5年復發(fā)率高達41%。
[0003]目前，我國已進入老年化社會，腦中風的發(fā)病率將有進一步增加的趨勢。因此，研究腦中風尤其是缺血性腦中風的病理機制及治療防護一直是醫(yī)藥界的重要任務。理論上，針對急性缺血或缺血再灌后細胞損傷的藥物(神經(jīng)保護劑)可保護腦細胞，提高對缺血缺氧損傷的耐受性，從目前的研究結果看，大多數(shù)在動物實驗中具有療效的藥物，在臨床試驗中往往以失敗告終。
[0004]中國專利文獻CN103340890A公開了NADPH作為制備用于防治腦缺血性中風藥物方面的應用。然而，未見NADPH和夾竹桃麻素聯(lián)合應用治療腦缺血性中風的報道。
[0005]因此，研究新型的治療腦缺血性疾病的藥物具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為此，本發(fā)明提出一種治療缺血性腦中風的藥物組合物。
[0007]為解決上述技術問題，本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明提供一種治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成包括:
[0009]NADPH 3?12重量份，夾竹桃麻素0.5?8重量份。
[0010]優(yōu)選地，本發(fā)明上述治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成包括:
[0011]NADPH 6?9重量份，夾竹桃麻素I?4重量份。
[0012]進一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成包括:
[0013]NADPH 7.5重量份，夾竹桃麻素2.5重量份;或者
[0014]NADPH 6重量份，夾竹桃麻素4重量份;或者
[0015]NADPH 9重量份，夾竹桃麻素I重量份;或者
[0016]NADPH 8重量份，夾竹桃麻素2重量份。
[0017]本發(fā)明還提供一種上述治療缺血性腦中風的藥物組合物的制備方法，包括以下步驟:
[0018]分別取選定重量份的NADPH和夾竹桃麻素，混合均勻制成混合制劑，或分別制成2種制劑和采用不同的給藥方式。
[0019]本發(fā)明還提供包括上述治療缺血性腦中風的藥物組合物的制劑、或者包括上述制備方法制備得到的藥物組合物的制劑，
[0020]所述藥物組合物加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、散劑、合劑、丸劑、顆粒劑、溶液劑、糖漿劑、煎膏劑、貼膏劑、栓劑、氣霧劑、軟膏劑或注射劑。
[0021]所述藥學上可接受的輔料為:填充劑、崩解劑、潤滑劑、助懸劑、粘合劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、基質等。填充劑包括:淀粉、預膠化淀粉、乳糖、甘露醇、甲殼素、微晶纖維素、 蔗糖等;崩解劑包括:淀粉、預膠化淀粉、微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、 低取代羥丙纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素納等;潤滑劑包括:硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉、二氧化硅等;助懸劑包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、蔗糖、瓊脂、羥丙基甲基纖維素等;粘合劑包括，淀粉漿、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等;甜味劑包括:糖精鈉、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矯味劑包括:甜味劑及各種香精;防腐劑包括:尼泊金類、 苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸及其鹽類、苯扎溴銨、醋酸氯乙定、桉葉油等;基質包括:PEG6000、 PEG4000、蟲蠟等。
[0022]本發(fā)明還提供上述藥物組合物、上述制備方法制備得到的藥物組合物、或上述藥物組合物的制劑在制備治療缺血性腦中風的藥物中的應用。
[0023]本發(fā)明的上述技術方案相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點:[〇〇24] NADPH本身雖有一定的治療腦卒中的作用，但是NADPH也可能被NADPH氧化酶利用產(chǎn)生氧化自由基而降低NADPH治療腦卒中的療效;夾竹桃麻素本身通過抑制NADPH氧化酶降低R0S產(chǎn)生而發(fā)揮治療腦卒中的作用，但是它對已經(jīng)產(chǎn)生的R0S以及由其它途徑產(chǎn)生的R0S (如線粒體和琥珀酸脫氫酶)沒有抑制作用，因此治療腦卒中時也有局限性。
[0025]本發(fā)明通過將NADPH和夾竹桃麻素聯(lián)合給藥，二者在特定的配比下共同作用，且作用于不同的靶點，既能清除R0S又能抑制R0S的產(chǎn)生。該藥物組合物在采用適合于臨床應用的給藥途徑條件下，能降低腦梗死體積，顯著改善腦缺血小鼠行為障礙，減輕腦水腫，提高小鼠長期生存的能力和增強神經(jīng)功能康復;而且，該藥物組合物對缺血性腦中風的治療效果顯著優(yōu)于二者單獨給藥對缺血性腦中風的治療效果，NADPH和夾竹桃麻素聯(lián)合給藥具有協(xié)同增效的作用。這表明，該藥物組合物具有治療缺血性腦中風的作用，可以作為潛在的治療缺血性腦中風的藥物。【附圖說明】
[0026]為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中:[〇〇27]圖1 (a)、1 (b)是NADPH聯(lián)合Apocynin側腦室注射和靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠腦梗死體積的影響，其中，*表示p〈〇.05，**表示p〈0.01，***表示p〈0.001，##表示p〈 0.01，1.C.V表示側腦室注射給藥，1.V表示靜脈注射給藥；[0〇28]圖2(a)、2(b)是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠腦梗死體積的影響，其中，*表示口〈0.05，**表示口〈0.01，***表示口〈0.001，八表示口〈0.05;[〇〇29]圖3是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠神經(jīng)癥狀的影響，其中，*表示口〈0.05，**表示卩〈0.01，***表示卩〈0.001，八表示口〈0.05;[0〇3〇]圖4是NADPH聯(lián)合Ap〇 cyn in靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠腦水腫的影響，其中，*表示口〈0.05，***表示卩〈0.001，###表示卩〈0.001;[〇〇31]圖5是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠長期存活的影響，其中，*表示p〈〇.05，#表示p〈0.05;[〇〇32]圖6是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠平衡運動的影響，其中，*表示口〈0.05，***表示卩〈0.001，###表示卩〈0.001，八表示口〈0.05;[〇〇33]圖7是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠學習記憶能力的影響，其中，林表示P〈〇? 01，林*表示P〈〇 ? 001，###表示P〈〇 ? 001，A表示p〈0? 05，A A表示p〈 0.01；[〇〇34]圖8是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)ROS 水平的影響，其中，表示P〈〇 ? 001，###表示P〈〇 ? 001，A表示p〈0 ? 05;
[0035]圖9(a)、9(b)、9(c)、9(d)、9(e)、9(f)是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)N0X2、N0X4蛋白水平的影響，其中，*表示p〈0.05，**表示p〈 0.01，***表示p〈0.001，##表示p〈0.01，###表示p〈0.001，A表示p〈0.05, AA表示p〈0.01;
[0036]圖10(a)、10(b)、10(c)、10(d)、10(e)、10(f)、10(g)、10(h)、10(i)、10(j)、10(k)、 10(1)、10(m)、10(n)、10(0)、10(p)是NADPH聯(lián)合Apocynin靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)NALP3炎癥復合體通路蛋白水平的影響，其中，*表示p〈0.05，#表示p〈 0.01，#表示p〈0.05，##表示p〈0.01，###表示p〈0.001，A表示p〈0.05, AA表示p〈0.01;
[0037]圖1-圖10中，Apocynin表示的為:夾竹桃麻素?！揪唧w實施方式】
[0038]實施例1[〇〇39]本實施例治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成為:NADPH7.5g，夾竹桃麻素2.5g;
[0040]其制備方法，包括以下步驟:分別取選定重量份的NADPH和夾竹桃麻素，混合均勻， 即得。[0041 ]實施例2[〇〇42]本實施例治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成為:NADPH 6g，夾竹桃麻素 4g；[〇〇43]其制備方法，包括以下步驟:分別取選定重量份的NADPH和夾竹桃麻素，混合均勻， 即得。
[0044]實施例3[〇〇45]本實施例治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成為:NADPH 9g，夾竹桃麻素 lg;
[0046]其制備方法，包括以下步驟:分別取選定重量份的NADPH和夾竹桃麻素，混合均勻， 即得。
[0047]實施例4[〇〇48]本實施例治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成為:NADPH 8g，夾竹桃麻素2g;
[0049]其制備方法，包括以下步驟:分別取選定重量份的NADPH和夾竹桃麻素，混合均勻，即得。
[0050]對比例I
[0051 ]本實施例治療缺血性腦中風的藥物組合物，其原料組成為:NADPH Ig，夾竹桃麻素4g；
[0052]其制備方法，包括以下步驟:分別取選定重量份的NADPH和夾竹桃麻素，混合均勻，即得。
[0053]實驗例
[0054]下述各實驗例證明本發(fā)明所述的技術效果。
[0055]本發(fā)明以下實驗例中，Apocynin表示的為:夾竹桃麻素。
[0056]實驗例INADPH聯(lián)合夾竹桃麻素對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用
[0057](I)實驗材料
[0058]清潔級雄性ICR小鼠，質量23?28g，蘇州大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號:XCYK (蘇)2002-2008，實驗動物使用許可證號:SYXK (蘇)2002-0037。
[0059]室溫22°C，濕度50-60%，通風良好，人工晝夜(12h/12h)，自由攝食攝水。實驗前，將雄小鼠在飼養(yǎng)環(huán)境中適應2d。
[0060]分6組:假手術組、模型組、NADPH組(7.5mg/kg)、夾竹桃麻素組(2.5mg/kg)、NADPH+夾竹桃麻素組(7.5mg+2.5mg/kg)，NADPH+夾竹桃麻素組(lmg+4mg/kg)。
[0061 ]外源性NADPH和夾竹桃麻素藥物的來源可以通過人工合成、半合成、生物提取獲得。
[0062](2)實驗方案
[0063]I)小鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型建立
[0064]采用頸內(nèi)動脈線栓法，稍加改進制備小鼠MCAO模型，小鼠以4%水合氯醛(400mg/kg)腹腔注射麻醉，我們采用線栓法制備缺血模型，分離頸總、頸外和頸內(nèi)動脈，結扎勁外和頸總近心端，線栓(6023，DoccoI Corporat1n ,Redlands，USA)從頸外插入直到大腦前動脈起始端，阻斷大腦中動脈供血。阻斷血流2h后，拔出線栓實現(xiàn)再灌注。假手術組小鼠除不插線外，其余步驟均與缺血組和治療組相同。整個手術過程中室溫保持在22?25°C，采用自動控溫加熱墊將小鼠肛溫控制在37±0.5°C。術后將動物置于放有清潔墊料的飼養(yǎng)盒中，自由飲水、進食。
[0065]2)腦梗死體積測定
[0066]腦缺血再灌注24h后將小鼠斷頭取腦，置冰箱(_20°C)數(shù)分鐘，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切4刀分為5片(2mm)，腦片用紅四氮唑(TTC)染色，染色液組成為:1.5mLl%TTC,0.lmLlmol/L K2HPO4，3.4mL生理鹽水，37°C避光染色30min，正常組織呈紅色，梗死組織為白色。
[0067]4%甲醛固定兩天后，用濾紙吸干液體再取出腦梗死組織，以梗死腦組織重量占總大腦重量的百分比作為腦梗死體積的指標。用Sigma Pro5.0軟件計算腦梗塞面積所占百分比。
[0068]3)神經(jīng)癥狀評分
[0069]小鼠腦缺血再灌注24h后，由一不了解分組情況的觀察者按照五分制評分標準對小鼠進行神經(jīng)行為障礙評分:〇分:無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:不能完全伸展對側前肢;2分: 行走時向對側旋轉，出現(xiàn)“追尾”現(xiàn)象;3分:站立不穩(wěn)，向對側傾倒;4分:不能自發(fā)行走，意識障礙。
[0070]4)大腦含水量測定
[0071]腦缺血再灌注24h后將小鼠斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，稱取大腦濕重， 107°C烘烤48h后稱干重，大腦含水量百分比=(濕重-干重)/濕重X 100%。[〇〇72]5)神經(jīng)功能測試[〇〇73] 1、動物模型的制作[〇〇74] 選取體重在23-28g的雄性ICR小鼠，作腦缺血2h再灌注手術。該動物模型腦缺血時間長，死亡率高，注意及時補足動物數(shù)。[〇〇75] I1、運動功能試驗[〇〇76]轉子桿測試(Rota-rod test)在轉子桿上保持平衡需要本體覺、位置覺及微調運動能力。該測試要求小鼠在勻速旋轉桿上保持平衡，并記錄其在轉棒上的運動時間及跌落時間得轉棒旋轉速度。測試中緩慢的加速限制了個體間表現(xiàn)的差異性。
[0077]所需儀器與材料包括:(1)儀器:滾輪軸心的直徑為5cm左右，由堅固的塑料制作而成，外面包裹灰色的橡膠泡沫，管寬約5cm，這個儀器可以在300s內(nèi)從4轉/min加速到40轉/ min; (2)秒表；(3)50%酒精；(4)紙巾。[〇〇78]在測驗的時候，把小鼠放在他們自己的籠子里，讓它們在測試房間內(nèi)適應15min (適應環(huán)境階段)。整個測試是由間隔15min的三次試驗組成。在測驗階段前沒有訓練階段。 它可以在同一次試驗時直接對下一批小鼠進行操作。儀器設定為在300s內(nèi)從4轉/min加速到40轉/min。儀器在開始前以4轉/min的恒速運轉。[〇〇79]II1、學習記憶的行為學試驗一習迷宮實驗(Y-maze test)
[0080]Y型電迷宮3條臂的盡頭均有1燈，底部是電網(wǎng)，其中只有1條臂盡頭的燈發(fā)出亮光， 此時該臂底部電網(wǎng)無電流通過，即為安全區(qū)；另兩臂的燈不亮，底部電網(wǎng)通電(約50V)，為非安全區(qū)；安全區(qū)與非安全區(qū)隨機改變。
[0081]實驗開始時，將動物放入迷宮中任一臂中適應2?3min;然后將其他任一臂的信號燈打開作為條件刺激，經(jīng)Is延遲后，燈不亮的兩臂通電(非條件刺激)；當動物逃避電擊至安全區(qū)后，燈亮持續(xù)15s，然后熄燈休息45s，即完成1次操作并記錄所用時間;然后再開始下一次操作。[〇〇82]6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析[0〇83]數(shù)據(jù)均以均數(shù)土SD(Mean土SD)表示，統(tǒng)計分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，p〈0.05為統(tǒng)計學差異有顯著性。[〇〇84](4)實驗結果NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素側腦室注射和靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠腦梗死體積的影響如圖1 (a )、1 (b)所示。[〇〇85]由圖l(a)、l(b)可知，與模型組相比，側腦室注射NADPH(lmg/kg)聯(lián)合夾竹桃麻素 (4mg/kg)用藥組顯著降低了小鼠腦缺血再灌注24h后腦梗死體積(p〈0.05);和靜脈注射 NADPH(lmg/kg)聯(lián)合夾竹桃麻素(4mg/kg) NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素用藥組都明顯著降低了小鼠腦缺血再灌注24h后腦梗死體積(p〈0.05，p〈0.01);靜脈注射NADPH(7.5mg/kg)聯(lián)合夾竹桃麻素(2.5mg/kg)用藥組也顯著降低了小鼠腦缺血再灌注24h后腦梗死體積(p〈0.001)。但是相互比較三組的結果可以發(fā)現(xiàn)，靜脈注射NADPH(lmg/kg)聯(lián)合夾竹桃麻素(4mg/kg)產(chǎn)生的效果比腦室注射的差，差異有顯著性(p〈0.05);靜脈注射NADPH(7.5mg/kg)聯(lián)合夾竹桃麻素(2.5mg/kg)產(chǎn)生的效果比靜脈注射NADPH(lmg/kg)聯(lián)合夾竹桃麻素(4mg/kg)產(chǎn)生的效果好，差異有顯著性(P〈0.01)。因此，單獨靜脈注射NADPH(lmg/kg)沒有顯著降低腦梗死體積的作用，單獨靜脈注射夾竹桃麻素(2.5mg/kg)只有輕微的治療效果，所以靜脈注射NADPH(7.5mg/kg)聯(lián)合夾竹桃麻素(2.5mg/kg)效果更有臨床應用價值。
[0086]夾竹桃麻素夾竹桃麻素夾竹桃麻素NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠腦梗死體積的影響如圖2 (a)、2 (b)所示。
[0087]由圖2(a)、2(b)可知，與模型組相比，NADPH組和夾竹桃麻素組都明顯降低了小鼠腦缺血再灌注24h后腦梗死體積(p〈0.01);NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素組進一步降低小鼠腦梗死體積(？〈0.001);與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組有顯著性差異(？〈0.05)。這表明^40?!1、夾竹桃麻素以及兩者聯(lián)合用藥均可降低腦缺血性中風小鼠腦梗死體積，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0088]NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠神經(jīng)癥狀的影響如圖3所示。
[0089]由圖3可知，與模型組相比，NADPH組和夾竹桃麻素組明顯降低小鼠腦缺血再灌注24h后神經(jīng)癥狀評(p〈0.05);兩者聯(lián)合應用則進一步降低了小鼠神經(jīng)癥狀評分(p〈0.01);與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組有顯著性差異(P〈0.05)。這表明，NADPH、夾竹桃麻素以及兩者聯(lián)合應用均可改善腦缺血性中風小鼠的神經(jīng)癥狀，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0090]NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠腦水腫的影響如圖4所不O
[0091]由圖4可知，與模型組相比，NADPH組和夾竹桃麻素組明顯降低了小鼠腦缺血再灌注24h后的大腦含水量(p〈0.05);兩者聯(lián)合應用則進一步降低了小鼠的大腦含水量(p〈0.01)。這表明，NADPH，夾竹桃麻素以及兩者聯(lián)合應用均可降低腦缺血性中風小鼠的腦水月中，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0092]NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠長期生存的影響如圖5所示。
[0093]由圖5可知，與模型組相比，NADPH組和夾竹桃麻素組以及兩藥合用組明顯提高了小鼠腦缺血再灌注后28天存活率(p〈0.05)。這表明，NADPH、夾竹桃麻素以及兩者聯(lián)合應用均可提高小鼠生存率，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0094]NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠平衡運動的影響如圖6所示。
[0095]由圖6可知，與模型組相比，NADPH、夾竹桃麻素組明顯增強了腦缺血再灌注后28天存活小鼠的平衡運動能力(P〈0.05)，NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素組更顯著增強了腦缺血再灌注后28天存活小鼠的平衡運動能力(p〈0.001);與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組有顯著性差異(?〈0.05)。這表明眞0?!1、夾竹桃麻素以及兩者合用均可提高小鼠平衡運動能力，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0096]NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠學習記憶能力的影響如圖7所示。[〇〇97]由圖7可知，與模型組相比，NADPH，夾竹桃麻素組明顯增強了腦缺血再灌注后28天存活小鼠的學習記憶能力(P〈〇.01)，NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素組更顯著提高了腦缺血再灌注后28天存活小鼠的學習記憶能力(p〈0.001);與單獨用藥組相比，聯(lián)合用藥組有顯著性差異 (p〈0.05)。這表明，NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素可更有效地提高小鼠學習記憶能力。[〇〇98]實驗例2NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)R0S水平的影響[〇〇99](1)實驗材料
[0100]同實驗例1。
[0101](2)實驗方案
[0102] 1)小鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型建立
[0103]同實驗例1。
[0104]2)R0S 的測定
[0105]小鼠缺血再灌后3h，深度麻醉后斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冰凍切片機切片，厚10M1貼片于明膠處理過的載玻片上，然后用冰凍切片氧化應激活性氧熒光測定試劑盒檢測，即在熒光顯微鏡下觀察(定性檢測):激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm，熒光增強，表明活性氧族(R0S)含量高。
[0106](3)實驗結果[〇1〇7] NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)ROSA 平的影響如圖8所示。[〇1〇8]由圖8可知，與假手術(sham)組相比，Model組小鼠腦缺血再灌注3h后顯著提高了 R0S水平(p〈0.001);應用NADPH，夾竹桃麻素后，與Model組相比，均明顯地抑制了缺血性腦中風小鼠大腦皮層R0S水平的升高(？〈0.001)，聯(lián)合應用嫩0?11和夾竹桃麻素更顯著地抑制了缺血性腦中風小鼠大腦皮層R0S水平的升高(p〈0.001)。結果提示NADPH，夾竹桃麻素，以及兩者聯(lián)合用藥，均可降低缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)R0S水平，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0109]實驗例3NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)N0X水平的影響
[0110](D實驗材料 [〇111]同實驗例1。[〇112](2)實驗方案
[0113] 1)小鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型建立
[0114]同實驗例1。
[0115]2)Western blot方法
[0116] a.配制12 % SDS-PAGE，上樣，電壓積層膠90V、分離膠110V，電泳；[〇117] b.電泳結束后采用濕轉法將樣品轉移至NC膜，10%的膠恒流0.5A，1.5h; 14%的膠恒流 〇.3A，45min;
[0118] c.轉膜結束后，將NC膜放入含有5 %脫脂奶粉的TBS中室溫下封閉2h;[〇119] d.加入含有5 %脫脂奶粉和0.1 %疊氮鈉的TBS配置的一抗，4 °C過夜。e.TBS-T漂洗15min X 3次，TBS漂洗 15min X I次；
[0120]f.加入用含有5 %脫脂奶粉TBS配置的二抗，室溫2h;
[0121]g.TBS-T漂洗15minX 3次，TBS漂洗15min X I次，將膜置于ECL顯色液中(臨用前A、B液等體積混勻)，室溫Imin，壓片、曝光、顯影。
[0122](3)實驗結果
[0123]NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)N0X2、N0X4蛋白水平的影響如圖9(a)、9(b)、9(c)、9(d)、9(e)、9(f)所示。
[0124]由圖9(&)、9(13)、9((:)、9((1)、9(6)、9(0可知，假手術組勵父2和勵父4的表達較低，而缺血再灌注8h、16h，N0X2蛋白表達明顯升高(p〈0.01),而N0X4蛋白表達是在16h顯著升高(p〈0.001)。給予NADPH、夾竹桃麻素，以及聯(lián)合給藥，與Model組相比，NADPH，夾竹桃麻素及聯(lián)合給藥都不同程度的抑制了N0X2和N0X4的表達。這表明，NADPH，夾竹桃麻素，以及兩者聯(lián)合用藥，均可抑制N0X2和N0X4的表達上調，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0125]實驗例4NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)NALP3炎癥復合體相關組件及炎癥因子蛋白水平的影響
[0126](D實驗材料
[0127]同實驗例I。
[0128](2)實驗方案
[0129]I)小鼠短暫性大腦中動脈阻塞模型建立
[0130]同實驗例I。
[0131]2)ffestern blot方法
[0132]同實驗例2。
[0133](3)實驗結果
[0134]NADPH聯(lián)合夾竹桃麻素靜脈注射給藥對缺血性腦中風小鼠大腦皮層缺血區(qū)NALP3炎癥復合體通路蛋白水平的影響如圖10(a)、10(b)、10(c)、10(d)、10(e)、10(f)、10(g)、10(h)、10(i)、10( j)、10(k)、10(1)、10(m)、10(n)、10(o)、10(p)所示。
[0135]由圖10(a)、10(b)、10(c)、10(d)、10(e)、10(f)、10(g)、10(h)、10(i)、10(j)、10(10、10(1)、10(111)、10(11)、10(0)、10(?)可知，假手術組11^3蛋白表達較低，而1/1?組小鼠缺血側腦組織中NLRP3、ASC、前體caspase-1，和il-lb、il-18的蛋白水平在8h和16h都有顯著增加。以上結果說明，缺血誘發(fā)炎癥小體蛋白、IL-1增、IL-18炎癥因子的表達增加。給予NADPH，夾竹桃麻素，以及聯(lián)合給藥，與model組相比，NADPH、夾竹桃麻素以及聯(lián)合給藥不同程度的降低了NLRP3、ASC、前體caspase-Ι裂解caspase-Ι和il-lb、il_18的蛋白水平。這表明，NADPH，夾竹桃麻素，以及聯(lián)合給藥均能抑制NLRP3炎癥復合物通路的激活及炎癥因子的產(chǎn)生，兩藥合用的效果優(yōu)于單獨使用。
[0136]綜上，本發(fā)明通過將NADPH和夾竹桃麻素聯(lián)合給藥，二者在特定的配比下共同作用，該藥物組合物能降低腦梗死體積，顯著改善腦缺血小鼠行為障礙，減輕腦水腫，提高小鼠長期生存的能力和增強神經(jīng)功能康復;而且，該藥物組合物對缺血性腦中風的治療效果顯著優(yōu)于二者單獨給藥對缺血性腦中風的治療效果，NADPH和夾竹桃麻素聯(lián)合給藥具有協(xié)同增效的作用。這表明，該藥物組合物具有治療缺血性腦中風的作用，可以作為潛在的治療缺血性腦中風的藥物。
[0137]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權項】
1.一種藥物組合物，其特征在于，其原料組成包括:NADPH 3?12重量份，夾竹桃麻素0.5?8重量份。2.根據(jù)權利要求1所述的藥物組合物，其特征在于，其原料組成包括:NADPH 6?9重量份，夾竹桃麻素1?4重量份。3.根據(jù)權利要求2所述的藥物組合物，其特征在于，其原料組成包括:NADPH 7.5重量份，夾竹桃麻素2.5重量份;或者NADPH 6重量份，夾竹桃麻素4重量份;或者 NADPH 9重量份，夾竹桃麻素1重量份;或者 NADPH 8重量份，夾竹桃麻素2重量份。4.一種權利要求1-3任一項所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步 驟:分別取選定重量份的NADPH和夾竹桃麻素，混合均勻，即得。5.包括權利要求1-3任一項所述的藥物組合物的制劑、或者包括權利要求4所述的制備 方法制備得到的藥物組合物的制劑，其特征在于，所述藥物組合物加入常規(guī)輔料，按照常規(guī)工藝，制成臨床上可接受的片劑、膠囊劑、散 劑、合劑、丸劑、顆粒劑、溶液劑、糖漿劑、煎膏劑、貼膏劑、栓劑、氣霧劑、軟膏劑或注射劑。6.權利要求1-3任一項所述的藥物組合物、權利要求4所述的制備方法制備得到的藥物 組合物、或權利要求5所述的藥物組合物的制劑在制備治療缺血性腦中風的藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/12GK105998048SQ201610318781
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】秦正紅, 李梅
【申請人】重慶納德福實業(yè)集團股份有限公司