一種柞蠶蛋白基因及其克隆方法與重組蛋白制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種柞蠶蛋白基因及其克隆方法與重組蛋白制備方法，該柞蠶蛋白基因的開(kāi)放閱讀框包含537個(gè)堿基，編碼178個(gè)氨基酸；重組克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，收集表達(dá)產(chǎn)物，分離純化，即得。本發(fā)明為研究Ap?HSP20.1的生理功能提供理論依據(jù)，進(jìn)而探討柞蠶HSP更多的生物學(xué)潛在功能，這對(duì)了解柞蠶的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)溫度依賴(lài)的規(guī)律以及柞蠶抗逆、抗病品種的選育具有十分重要的意義，也更助于我們加深對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)HSP功能的了解。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種柞蠶蛋白基因及其克隆方法與重組蛋白制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種柞蠶蛋白基因及其克隆方法與重 組蛋白制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 柞蠶(Antheraea pernyi)是一種在我國(guó)東北、華北等地區(qū)廣泛養(yǎng)殖的產(chǎn)絲量很高 的一種絹絲昆蟲(chóng)，它不僅是紡織工業(yè)的重要原料，而且在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域也有著非常廣泛 的應(yīng)用，柞蠶還是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中主要害蟲(chóng)鱗翅目昆蟲(chóng)的重要模式生物。因此，探索與柞蠶生 長(zhǎng)、發(fā)育有關(guān)功能蛋白質(zhì)子的結(jié)構(gòu)和功能，建立與這些生物學(xué)行為相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控 模式等研究工作具有重要意義，不僅能夠在分子水平解釋柞蠶生長(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制， 而且也為保護(hù)益蟲(chóng)防治害蟲(chóng)以及新型農(nóng)藥的研發(fā)提供理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題和/或缺陷，并提供至少后面將說(shuō)明的優(yōu) 點(diǎn)。
[0004] 為了進(jìn)一步研究柞蠶在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)和功能，本發(fā)明提供一種 柞蠶蛋白基因的開(kāi)放閱讀框序列，將該序列與其他幾個(gè)物種的熱休克蛋白20(heat shock protein 20,HSP20)基因 cDNA序列進(jìn)行了同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化分析。證明該序列是柞蠶 小熱休克蛋白20.1(Ap-HSP20.1)序列，與家蠶HSP20.1序列相似性為98.14% ;同時(shí)構(gòu)建了 該蛋白與pet_28a( + )連接的原核表達(dá)載體，采用鎳柱純化法，純化出該蛋白。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種柞蠶蛋白，其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明還提供一種編碼上述的柞蠶蛋白的基因，其CDNA序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 本發(fā)明還提供一種上述的柞蠶蛋白基因的克隆方法，包括:采用異硫氰酸胍-酚_ 氯仿一步法進(jìn)行柞蠶總RNA提取，然后進(jìn)行單鏈cDNA的合成、設(shè)定引物、RT-PCR擴(kuò)增、純化， 得到RT-PCR產(chǎn)物，將得到的RT-PCR產(chǎn)物連接下pMD19-T克降載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a進(jìn)行培 養(yǎng)，采用藍(lán)白斑和菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)行測(cè)序。
[0008] 優(yōu)選的是，其中設(shè)定引物的正向引物為：5 ' ATGTCACTGCTGCCATTCATC3 '，反向引物 為5，TCATTGTTTTGTTTCGTTGCTCTC3，。
[0009] 本發(fā)明還提供一種上述的柞蠶蛋白的基因的重組蛋白的制備方法，包括:設(shè)定上、 下游引物，在上下游引物中分別引入BamH I和Xho 1限制性酶切位點(diǎn)，以SEQ ID NO.2所示 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后與pET-28( + )載體相連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài) 細(xì)胞，獲得重組菌株;培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，收集表達(dá)產(chǎn)物，分離純化，即得。
[0010] 優(yōu)選的是，其中上游引物的序列為：5' -GGGGGATCC ATGTCACTGCTGCCATTCATC-37 , 下游引物的序列為:5' -GGGCTCGAG TCATTGTTTTGTTTCGTTGCTCTC-3'。
[0011]優(yōu)選的是，所述的柞蠶蛋白在柞蠶蛋白體內(nèi)生物免疫功能和體外抗菌方面的應(yīng) 用。
[0012]優(yōu)選的是，所述的柞蠶蛋白在研究柞蠶蛋白生物學(xué)潛在功能、柞蠶生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)溫 度依賴(lài)的規(guī)律和柞蠶抗逆、抗病品種的選育方面的應(yīng)用。
[0013]在本發(fā)明中，柞蠶總RNA提取技術(shù):采用異硫氰酸胍-酸-氯仿一步法(TRIZ0L法）。 TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白 體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)分離，并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯仿時(shí)，它可抽提酸性的苯 酚，而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相，離心后可形成水相層和有機(jī)層，這樣RNA與仍留在有機(jī) 相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開(kāi)。水相層(無(wú)色)主要為RNA，有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
[0014] 在本發(fā)明中，柞蠶HSP20.1基因 CDNA的RT-PCR擴(kuò)增技術(shù):先將含有所需擴(kuò)增分析序 列的靶DNA雙鏈經(jīng)熱變性處理，解開(kāi)為兩個(gè)寡聚核苷酸單鏈，然后加入一對(duì)根據(jù)已知DNA序 列由人工合成的與所擴(kuò)增的DNA兩端鄰近序列互補(bǔ)的寡聚核苷酸片段作為引物，即左右引 物。此引物范圍就在包括所欲擴(kuò)增的DNA片段，一般需20-30個(gè)堿基對(duì)。引物與互補(bǔ)DNA結(jié)合 后，以靶DNA單鏈為模板，經(jīng)反鏈雜交復(fù)性(退火），在Taq DNA聚合酶的作用下以4種三磷酸 脫氧核苷(dNTP)為原料按5 '到3 '方向?qū)⒁镅由臁⒆詣?dòng)合成新的DNA鏈、使DNA重新復(fù)制成 雙鏈。然后又開(kāi)始第二次循環(huán)擴(kuò)增。新合成的DNA鏈含有引物的互補(bǔ)序列，并又可作為下一 輪聚合反應(yīng)的模板。如此重復(fù)上述DNA模板加熱變性雙鏈解開(kāi)一引物退火復(fù)性一在DNA聚合 酶作用下的引物延伸的循環(huán)過(guò)程，使每次循環(huán)延伸的模板又增加1倍，亦即擴(kuò)增DNA產(chǎn)物增 加1倍，經(jīng)反復(fù)循環(huán)，使靶DNA片段指數(shù)性擴(kuò)增。
[0015] 在本發(fā)明中，重組表達(dá)載體的構(gòu)建技術(shù)：用Ca2+處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于能 夠吸收環(huán)境DNA分子的生理狀態(tài)，用大腸桿菌質(zhì)粒與目的基因進(jìn)行重組形成重組質(zhì)粒，將重 組質(zhì)粒DNA與感受態(tài)細(xì)胞混合，在一定溫度下，感受態(tài)細(xì)胞吸收周?chē)亟MDNA分子，完成轉(zhuǎn)化 過(guò)程。
[0016] 在本發(fā)明中，重組蛋白的純化技術(shù):Ni柱中的氯化鎳或者硫酸鎳可以與有His (組 蛋白）標(biāo)簽的堿性蛋白蛋白結(jié)合，組蛋白標(biāo)簽一般是6個(gè)組氨酸(堿性氨基酸）。在蛋白上樣 后，帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白特異性結(jié)合到柱子里，其他的雜蛋白流出。Ni柱中的氯化鎳或者 硫酸鎳可以也可以與咪唑結(jié)合這時(shí)候再用咪唑洗脫，梯度洗脫，咪唑競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合到硫酸鎳 上，目的蛋白就被洗脫了，這時(shí)候收集浸出液即目的蛋白，然后透析掉咪唑。
[0017] 本發(fā)明至少包括以下有益效果:本發(fā)明為研究AP-HSP20.1的生理功能提供理論依 據(jù)，進(jìn)而探討柞蠶HSP更多的生物學(xué)潛在功能，這對(duì)了解柞蠶的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)溫度依賴(lài)的規(guī)律 以及柞蠶抗逆、抗病品種的選育具有十分重要的意義，也更助于我們加深對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)HSP 功能的了解。
[0018] 本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本 發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說(shuō)明】：
[0019] 圖1為本發(fā)明柞蠶總RNA提取電泳圖；
[0020] 圖2為在柞蠶蛹期CDNA文庫(kù)中，由瓊脂糖凝膠電泳篩選到大概在540bp處有一條 cDNA序列，M:分子量Marker; 1，2為目標(biāo)條帶；
[0021] 圖3為家蠶HSP20. lORF.seq和柞蠶HSP20. lORF.seq的對(duì)比圖；其中，一致性 (Identity) =98.14% (527/537)Gap = 0.00% (0/537)；
[0022] 圖4為轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pet-28a-Ap-HSP20.1的菌液在37°C的培養(yǎng)條件下，對(duì)菌液進(jìn) 行了 IPTG不同濃度的誘導(dǎo)，處理各樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，IPTG濃度0.2，0.4，0.6或 0.8mM誘導(dǎo)4小時(shí)后，結(jié)果如圖所示，誘導(dǎo)的菌液在大約在30kDa處出現(xiàn)了目的蛋白條帶，在 0.2nM表達(dá)量最高;而未誘導(dǎo)的對(duì)照組則無(wú)條帶;M:分子量Marker; 1，2，3，4分別為IPTG濃度 0 · 2，0 · 4，0 · 6或 0 · 8mM; 5:未加 IPTG。
[0023] 圖5為重組蛋白經(jīng)大量誘導(dǎo)后，經(jīng)分析重組蛋白為可溶性蛋白。按照可溶性蛋白純 化方法經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，結(jié)果顯示在大小約為近30kDa處有單一且清晰的條帶出 現(xiàn)，說(shuō)明純化蛋白的純度和濃度均較高。M:分子量Marker; 1:未加 IPTG; 2:裂解后的上清液； 3:清洗液;4，5為洗脫的目標(biāo)蛋白；
[0024] 圖6為蟲(chóng)5齡3天柞香幼蟲(chóng)給予金黃色葡萄球菌（Staphy I ococcus aureus， S.aureus)免疫刺激后，柞蠶脂肪體Ap-sHSP20.1的基因表達(dá)。由圖6看出，在注射后48h后， 該基因表達(dá)量達(dá)到最高。
[0025]圖7為5齡3天柞蠶幼蟲(chóng)給予大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)免疫刺激后，柞 蠶脂肪體Ap_sHSP20.1的基因表達(dá)。由圖7看出，在注射后24h后，該基因表達(dá)量達(dá)到最高。
[0026] 圖8為5齡3天柞香幼蟲(chóng)給予枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis，B. subtilis)，柞 蠶脂肪體Ap_sHSP20.1的基因表達(dá)。由圖3看出，在注射后3h后，該基因表達(dá)量達(dá)到最高。
[0027] 圖9為純化出的Ap-sHSP20.1蛋白，在體外對(duì)S. aureus抑菌作用。1是I3BS溶液;2是 Ap-sHSP20 · 1蛋白；3是硫酸卡那霉素。
[0028] 圖10為純化出的Ap-sHSP20.1蛋白，在體外對(duì)E. coli抑菌作用。1是PBS溶液；2是 Ap-sHSP20 · 1蛋白；3是硫酸卡那霉素。
[0029] 圖11為純化出的Ap-sHSP20.1蛋白，在體外對(duì)B. subtiIis抑菌作用。1是I3BS溶液;2 是Ap-sHSP20.1蛋白；3是硫酸卡那霉素。
【具體實(shí)施方式】：
[0030] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文 字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0031] 應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"以及"包括"術(shù)語(yǔ)并不配出一個(gè)或多 個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
[0032] 實(shí)施例1:
[0033] 1、所用溶液的配制：
[0034] SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)凝膠配方:如表1所示：
[0035]表 1

[0037] 2\505上樣緩沖液：2.511^謂1^8-!〇^化!16.8)、1.01111^-巰基乙醇、0.68 505、 1.0 mL I %溴酚藍(lán)、2. OmL甘油、加蒸餾水至終體積IOmL。電泳緩沖液:如表2所示：
[0038] 表2
[0040] 加蒸餾水至終體積1000mL。
[0041] 凝膠染色液:如表3所示：
[0042] 表 3
[0044]加蒸餾水至終體積1000 mL，搖勻備用。
[0045] 凝膠脫色液:如表4所示：
[0046] 表 4 LUU4〇」 乂ιμ^：小甶
[0049] 裂解液：
[0050] 50mM NaH2P04 6.9g NaH2PfM(MW 137.99g/moI)
[0051] 300mM NaCl 17.54g NaCl(Mff 58.44g/mol)
[0052] IOmM imidozole(咪挫）0.68g imidozole(Mff 68.08g/mol) 用NaOH調(diào)PH值至8.0，加蒸餾水至終體積1000mL。
[0053] 漂洗液：
[0054] 50mM NaH2P04 6.9g NaH2P04(Mff 137.99g/mol)
[0055] 300mM NaCl 17.54g NaCl(Mff 58.44g/mol)
[0056] 20mM imidozole(咪挫）1.36g imidozole(Mff 68.08g/mol)
[0057] 用NaOH調(diào)PH值至8.0，加蒸餾水至終體積1000 mL [0058]溶解液：
[0059] 50mM NaH2P04 6.9g NaH2P04(Mff 137.99g/mol)
[0060] 300mM NaCl 17.54g NaCl(Mff 58.44g/mol)
[0061] 250mM imidozole(咪挫）17.OOg imidozole(Mff 68.08g/mol)
[0062] 用NaOH調(diào)PH值至8.0，加蒸餾水至終體積1000 mL
[0063] 2、五齡柞蠶脂肪體總RNA的提取:取5mg五齡柞蠶脂肪體，用TRizol試劑提取總的 RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的完整性和純度。制備的RNA樣品于一 80 °C 冰箱中保存?zhèn)溆?，圖1示出了柞蠶總RNA提取電泳圖，提取的總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖從上 到下有明顯有三條帶依次是28S，18S和5S(A)，核酸定量分析儀純度檢測(cè)結(jié)果0D260/0D280 =1.85 (B )，說(shuō)明所提取的RNA符合要求，無(wú)蛋白和DNA污染，可以用于PCR反應(yīng)的模板。
[0064] 3、單鏈cDNA的合成：取IyL總RNA，加入0 · 5yg/ul 01 igo (dT) 12yL，DEPC-treated water至12yL，65°C保溫，置于冰上迅速冷卻。離心后加入下列試劑：5Xreaction buffer 4 yL,20yg/yL RiboLockTM RNase Inhibitor lyL，10mmol/L dNTP mix 2yL,200yg/yL ReverAidTM M-MuLV Reverse Transcfiptase lyL，混勾，42°C保溫6〇111；[11，70。05111；[11，終止 反應(yīng)。
[0065] 4、PCR擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì):根據(jù)家蠶及其他鱗翅目昆蟲(chóng)小熱休克蛋白20.1基因的保 守cDNA序列設(shè)計(jì)引物如下：正向引物F1(SEQ ID N0.3):5'ATGTCACTGCTGCCATTCATC 3'；反 向引物R1(SEQ ID N0.4):5'TCATTGTTTTGTTTCGTTGCTCTC 3'。
[0066] 5、柞蠶HSP20.1基因 cDNA的RT-PCR擴(kuò)增：以五齡柞蠶脂肪體總為模版，用反轉(zhuǎn)錄的 cDNA作為PCR反應(yīng)模板。PCR反應(yīng)體系(50u L): 10 X PCR緩沖液5yL，lOmmol/L dNTP混合液4μ L，25umol/L.正、反向引物各2yL，Taq DNA聚合酶IyL，cDNA模板2yL，無(wú)菌水34yL，反應(yīng)條件： 95°(：預(yù)變性4111丨11，95°(：變性3〇8,55°(：退火4〇8,72°(：延伸5〇8,35個(gè)循環(huán)；72°(：延伸611^11。 [0067] 6、柞蠶HSP20.1基因的克隆及序列測(cè)定:將純化后的PCR產(chǎn)物連接下pMD19-T克降 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a進(jìn)行培養(yǎng)。采用藍(lán)白斑和菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，DNA測(cè)序由上 海生物工程有限公司完成。利用DNAStar和DNAman進(jìn)行序列拼接和分析。
[0068] 7、重組表達(dá)載體的構(gòu)建，重組蛋白的制備：
[0069] (I)PCR擴(kuò)增，基因克隆
[0070] 根據(jù)HSP20.1基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物，在上下游引物中分別引入BamH I和Xho 1限 制性酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物上游序列為:5' -GGGGGATCC ATGTCACTGCTGCCATTCATC-37 BamH I (下劃線(xiàn)為BamH 頂每切位點(diǎn)），下游序列為5' -GGGCTCGAG TCATTGTTTTGTTTCGTTGCTCTC-3/.XhoI(下劃線(xiàn)為XhoI酶切位點(diǎn)）。以柞蠶蛹cDNA(SEQIDN0.2所示cDNA)為模板，PCR擴(kuò) 增該ORF(退火溫度為55°C)，經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，以BamH I和Xho I雙酶切后連接 到同樣酶切過(guò)的pET-28a( + )載體中，得到重組質(zhì)粒pET-28a( + )-BmHSP20.1，轉(zhuǎn)化pET-28a ( + )-ApHSP20.1質(zhì)粒進(jìn)入E. coli菌株中，涂平板培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和 雙酶切鑒定。
[0071] (2)重組蛋白的表達(dá)及鑒定
[0072]將上述重組克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，取一陽(yáng)性克隆接種于5mL 含卡那霉素(50mg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37°C恒溫水平振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。按1:100的比例接入含 終濃度為50yg/mL的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，220r/min振搖過(guò)夜；取過(guò)夜培養(yǎng)物 按1:100的比例接入含終濃度為50yg/mL的卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C，220r/min振搖4h， 加入IPTG至終濃度0.2mmol/L，37°C誘導(dǎo)表達(dá)4h后，收集菌液；12000r/min離心30s，棄上清， 加100μ1 PBS重懸;將菌液用超聲波冰上破碎至澄清后，12000r/min離心10min，分別取上清 和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物;本發(fā)明采用IPTG濃度為0.2nM，37 °C，4h的誘導(dǎo)條件， 在此條件下蛋白表達(dá)量最高。
[0073] 8、重組蛋白的純化:經(jīng)可溶性分析，該目的蛋白為可溶性蛋白。收集250mL過(guò)夜誘 導(dǎo)的菌液，4°C，8000rpm，離心10min收集菌體。用Ni-NTA親和層析柱，按Qiagen公司Ni-NTA Fast Start試劑盒的操作流程對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化：
[0074] (1)第一次使用時(shí)將600yL裂解緩沖液全部加入lysozyme中使其溶解（_20°C保 存)；
[0075] (2)取IOOyL上述溶液和IOyL Benzonase Nuclease solution加入IOmL裂解緩沖 液中，混勻；
[0076] (3)將收集的菌體在冰上融15min，加入步驟(2)中混合的裂解緩沖液；
[0077] (4)冰上放置30min，中間輕輕渦旋2-3次溶解菌體；
[0078] (5)4°C14000Xg離心30min，回收細(xì)胞裂解液；
[0079] (6)取5yL 5 XSDS-PAGE上樣緩沖液加入到20yL細(xì)胞裂解液中，保存于-20°C，待做 SDS-PAGE電泳分析，如圖5中2所示。
[0080] (7)將蛋白純化柱(試劑盒內(nèi)提供)上下顛倒幾次以重懸樹(shù)脂；
[0081 ] (8)移去底部流出口蓋，打開(kāi)蓋子使柱內(nèi)緩沖液流出；
[0082] (9)將步驟(5)中的細(xì)胞裂解液加到柱子中；
[0083] (10)收集柱流出液。取5yL 5 X SDS-PAGE上樣緩沖液加入到20yL上清中，保存于- 20 °C，待做SDS-PAGE電泳分析；
[0084] (11)用4mL清洗緩沖液清洗兩次，分別收集兩次清洗片段進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖 4中3所示；
[0085] (12)6XHis標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白用ImL洗脫緩沖液洗脫蛋白2次；
[0086] (13)收集洗脫液于2個(gè)管子中進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖5中4,5所示。
[0087] 實(shí)施例2:
[0088] 柞蠶蛋白在柞蠶蛋白體內(nèi)生物免疫功能和體外抗菌方面的應(yīng)用研究：
[0089] (1)柞蠶處理
[0090] 柞蠶5齡3天幼蟲(chóng)，冰上放置5分鐘后，解剖取絲腺、中腸、脂肪體、馬氏管、表皮和血 液等組織后，液氮迅速凍存后置于_70°C冰箱備用。
[0091] 柞蠶幼蟲(chóng)分別注射懸浮在?ομL生理鹽水的I X 106個(gè)熱滅活的大腸桿菌 (Escherichia coli，E·coli)，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus)，枯草 芽孢桿菌(Bacillus 811吮丨1丨8,8.811從丨1丨8)和1(^1的生理鹽水作為對(duì)照（1.0\106細(xì)菌細(xì) 胞懸浮于IOyL已滅菌的0.85%NaCl)，并搜集0,0.5、3、6、12、24、48h的脂肪體，對(duì)于每組處 理，脂肪體樣品至少來(lái)源于三頭柞蠶蛹。用液氮研磨，加入Trizol，凍于-80°C，備用。
[0092] (2)柞蠶RNA的提取
[0093] RNA提取步驟:加液氮預(yù)冷研缽，將事先提取的組織加入到預(yù)冷的研缽中研磨至粉 末后迅速將研磨好的樣品轉(zhuǎn)移至含有裂解液的離心管中并立即勻漿混勻;將處理好的樣品 與ImL TRN充分混勻，室溫下靜置5min;加入0.2mL氯仿，蓋好管蓋劇烈振蕩15s，室溫下靜置 3min;將靜置好的樣品，4°C，12000r/min離心10min，樣品將會(huì)分成三層，分別為黃色的有機(jī) 相，中間層和上層無(wú)色的水相，RNA主要存在于水相中，小心地將水相轉(zhuǎn)移至新管中；將得到 的水相加入等體積的異丙醇，混勻后室溫下靜置20-30min，4°C，12000r/min離心10min后棄 上清;加入lmL75%的乙醇洗滌沉淀，洗滌時(shí)要注意充分洗滌，渦旋混勻后4°C，7500r/min離 心5min，用潔凈的濾紙吸盡乙醇，在超凈工作臺(tái)上瞭干5min;加適量的RNase-free的雙蒸水 混勻，使RNA充分溶解，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0094] (3)提取的總RNA的質(zhì)量檢測(cè)
[0095] (1)紫外檢測(cè)：利用微量核酸定量?jī)x(NAN0DR0P 2000 Spectrophotometer)檢測(cè)總 RNA的純度和濃度，讀取A260/A280比值、A260/A230比值、濃度(ng/yL)，并計(jì)算得率。
[0096] (2)電泳檢測(cè)：取3yL樣品和IyL 6X溴酚藍(lán)/二甲苯青/聚蔗糖凝膠上樣液混合均 勻，點(diǎn)樣到1 %的瓊脂糖凝膠中，100V電泳，檢測(cè)樣品的完整性。
[0097] (4)第一鏈CDNA的合成
[0098] 取ΙμL總RNA，加入0.5yg/yl 01igo(dT)2yl，DEPC-treated water至 12μ1，65Γ保 溫，置于冰上迅速冷卻，離心后加入下列試劑：5Xreaction buffer 4yl，20ug/ul RiboLockTM RNase Inhibitor 1ul，1Ommol/L d NTP mix 2yl,200yg/yl ReverAidTM M-MuLV Reverse Transcfiptase ΙμL，混勾，42°C保溫6〇111；[11，70。05111；[11，終止反應(yīng)。
[0099] (5)熒光定量PCR
[0100] 以本實(shí)驗(yàn)室克隆的柞蠶小熱休克蛋白20.1的基因序列為模板，用Premier 5.0軟 件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，以管家基因18S rRNA為內(nèi)參基因，引物序列，上游引物：5 ' -AGAGATTACTACCGGCCGTG-3 ' ；下游引物:5 ' -CTGACGAGAGATGTAGCCGT-3 ' ICR反應(yīng)程序?yàn)?95 °C預(yù)變性4min;94°C變性3〇8,55°(：退火358,72°(：延伸4〇8，共40個(gè)循環(huán)。在進(jìn)行定量?0?之 前，先進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，摸索最佳反應(yīng)條件，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，在得到單一、清晰條帶后再 進(jìn)行定量PCR試驗(yàn)。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行熒光定量PCR反 應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)，按下列比例配制反應(yīng)體系：
[0101 ] 2 X SYBR Premix Ex TaqTM 10 μ L 上游引物（10.0 μ Μ) 0.5μ L 下游引物（10.0 μ Μ) 0.5μ L
[0102] 模板 1μ L ddH20 8.0 μ L 終體積 20 μ L
[0103] PCR反應(yīng)在Bio-rad CFX96熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5s; 95 。(:變性5s，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最適退火溫度(58-62 °C)退火30s，72 °C延伸30s，共40個(gè)循 環(huán)。以18S rRNA為內(nèi)參，用2_^^相對(duì)定量法分析Ap-sHSP20.1基因在微生物感染柞蠶幼蟲(chóng) 不同時(shí)間脂肪體組織中的相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果如圖6~8所示，從圖中可知，在5齡3天柞蠶幼 蟲(chóng)在注射金黃色葡萄球菌給予免疫刺激后48h，柞蠶小熱休克蛋白的基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在 48h達(dá)到最高是空白對(duì)照的213倍；而柞蠶幼蟲(chóng)對(duì)大腸桿菌最為敏感，在注射1.5h，Ap-SHSP20.1基因表達(dá)水平達(dá)到空白對(duì)照的150倍，在24h達(dá)到最高將近2000倍;但在枯草芽孢 桿菌的免疫刺激后，Ap-sHSP20.1基因表達(dá)變化在3h達(dá)到最高是空白對(duì)照的19倍。
[0104] (6)抑菌實(shí)驗(yàn)
[0105] ①按照配方(牛肉膏0.5g、蛋白胨lg、NaCl 0.5g、瓊脂1.5~2.0g、蒸餾水IOOmUpH =7.2)配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，置于121°C高壓滅菌鍋中滅菌30min，倒平板，冷卻后備 用。
[0106] ②取經(jīng)純化的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌于牛肉膏蛋白胨液體培 養(yǎng)基中活化12h。
[0107] ③取各菌液50yL至平板上涂布，放入不銹鋼管，管內(nèi)分別滴加硫酸卡那霉素 (250mg/ml)、滅菌PBS以及純化的蛋白（0.5mg/ml)各10yL。放人恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18h。 觀(guān)察細(xì)菌生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，圖9~11示出了純化出的Ap-sHSP20.1蛋 白，在體外對(duì)S. Aureus、E. Coli、和B. Subti Iis的抑菌作用，其中1是PBS溶液；2是Ap-sHSP20.1蛋白；3是硫酸卡那霉素，從圖中可知，純化的蛋白對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和 枯草芽孢桿菌均有明顯的抗菌作用。
[0108] 盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開(kāi)如上，但其并不僅僅限于說(shuō)明書(shū)和實(shí)施方式中所列 運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種柞蠶蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的柞蠶蛋白的基因，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO. 2所示。3. -種如權(quán)利要求2所述的柞蠶蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括:采用異硫氰 酸胍-酚-氯仿一步法進(jìn)行柞蠶總RNA提取，然后進(jìn)行單鏈cDNA的合成、設(shè)定引物、RT-PCR擴(kuò) 增、純化，得到RT-PCR產(chǎn)物，將得到的RT-PCR產(chǎn)物連接下pMD19-T克降載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a進(jìn)行培養(yǎng)，采用藍(lán)白斑和菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆，然后進(jìn)行測(cè)序。4. 如權(quán)利要求3所述的柞蠶蛋白基因的克隆方法，其特征在于，其中設(shè)定引物的正向引 物為：5 ' ATGTCACTGCTGCCATTCATC3 '，反向引物為5 ' TCATTGTTTTGTTTCGTTGCTCTC3 '。5. -種權(quán)利要求2所述的柞蠶蛋白的基因的重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括： 設(shè)定上、下游引物，在上下游引物中分別引入BamH I和Xhol限制性酶切位點(diǎn)，以SEQ ID N0.2所示CDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后與pET-28( + )載體相連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組菌株;培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，收集表達(dá)產(chǎn)物，分離 純化，即得。6. 如權(quán)利要求5所述的柞蠶蛋白的基因的重組蛋白的制備方法，其特征在于，其中上游 引物的序列為：57 -GGGGGATCC ATGTCACTGCTGCCATTCATC-3'，下游引物的序列為：5'-GGGCTCGAG TCATTGTTTTGTTTCGTTGCTCTC-37。7. 如權(quán)利要求1所述的柞蠶蛋白在柞蠶蛋白體內(nèi)生物免疫功能和體外抗菌方面的應(yīng) 用。8. 如權(quán)利要求1所述的柞蠶蛋白在研究柞蠶蛋白生物學(xué)潛在功能、柞蠶生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)溫 度依賴(lài)的規(guī)律和柞蠶抗逆、抗病品種的選育方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK105859864SQ201610466960
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】張叢芬, 羅學(xué)剛, 林曉艷
【申請(qǐng)人】西南科技大學(xué)