一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：(1)擴增淀粉磷酸化酶基因，并將其克隆到原核表達載體中，經(jīng)E.coli表達純化淀粉磷酸化酶；(2)用純化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，測定小鼠血清效價，取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，制備能產(chǎn)生淀粉磷酸化酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株；(3)純化淀粉磷酸化酶單克隆抗體并驗證其特異性。通過本發(fā)明的方法制備的淀粉磷酸化酶單克隆抗體具有高效價、高穩(wěn)定性和高特異性，可后期用于淀粉磷酸化酶的免疫學檢測。
【專利說明】
一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體及其制備方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及單克隆抗體技術領域，尤其涉及一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 木薯是工業(yè)生產(chǎn)和動物飼料的重要原料，也是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ目稍偕Y源作 物。其塊根淀粉含量及組成對加工利用意義重大。淀粉的合成與分解受一系列酶的催化調(diào) 控，包括ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉去分支酶、淀粉磷酸化酶等。淀粉磷酸化 酶在玉米胚乳的基質中發(fā)現(xiàn)是一種112Kd的蛋白質，可將直鏈淀粉或者支鏈淀粉非還原端 α-1，4糖苷鍵磷酸化，產(chǎn)生葡萄糖-1磷酸，在變構酶的作用下生成葡萄糖-6磷酸進入糖酵解 途徑。根據(jù)近幾年的研究顯示，在淀粉合成的整個過程中都存在有淀粉的磷酸化，即有磷酸 體以單酯化形式結合到淀粉上，而淀粉磷酸化酶在形成磷酸酯的過程中起著決定作用。在 植物中，不同器官中的磷酸化程度不同。研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)磷酸體通過共價鍵結合在支鏈淀 粉上而非直鏈淀粉上。目前有研究顯示，在植物淀粉中磷酸化的淀粉鏈比未磷酸化的淀粉 鏈要長。淀粉中磷酸酯含量的多少對淀粉理化品質具有較大的影響，比如磷酸化的淀粉能 增加淀粉的水解，增強提高淀粉的糊化粘度，從而最終影響淀粉的工業(yè)或食品用途。如門福 義等人研究的淀粉磷酸化酶在馬鈴薯淀粉合成運轉中起重要的促進作用，其活性在淀粉形 成的不同時期和不同溫度下表現(xiàn)比較不同的調(diào)節(jié)作用。因此，需要研發(fā)出一種淀粉磷酸化 酶抗體，用于淀粉磷酸化酶的免疫檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，解決了現(xiàn)有 技術中還未有一種制備淀粉磷酸化酶單克隆抗體的方法。
[0004] 本發(fā)明采用的技術手段如下：一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，包括以 下步驟：（1)擴增淀粉磷酸化酶基因，并將其克隆到原核表達載體中，經(jīng)E. co 1 i表達純化淀 粉磷酸化酶；（2)用純化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，測定小鼠血清效價，取小鼠脾細胞 與小鼠骨髓瘤細胞融合，制備能產(chǎn)生淀粉磷酸化酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株；（3)獲得純 化淀粉磷酸化酶單克隆抗體。
[0005] 優(yōu)選地，步驟（1)中，以 5' 一 CGCGGATCCAAGTGCGTGTTGGATGAGACGA - 3'和5' 一 CCGCTCGAGCTCCTCCCATTTAACATATTCA-3'為引物，引入酶切位點BamHI和Xhol，以木薯的cDNA 基因片段為模板擴增出所需片段，連接到克隆載體。表達載體pET28a( + )用BamH I/Xho I雙 酶切后，與Pho目的基因的酶切產(chǎn)物于16°C連接12小時，將5yL連接產(chǎn)物轉入感受態(tài)大腸桿 菌中，接種于LB卡那霉素抗性固體培養(yǎng)基，在37°C的條件下培養(yǎng)過夜，挑取單克隆體至卡那 霉素 LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm/min的條件下培養(yǎng)過夜，獲得pET28a( + )-SP基因重組質 粒;將基因重組質粒pET28a( + )_淀粉磷酸化酶轉化到大腸桿菌E. coli BL21中，經(jīng)1. Ommol/ L異丙基-D-硫代半乳糖苷誘導4-6h后，收集的菌在4°C用超聲波破菌儀裂解菌體并高速離 心收集上清和沉淀，后將細菌重懸于緩沖溶液中，超聲波破碎細菌，離心洗滌，8mol/L尿素 變性增溶，經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖親和柱分離制得純化的淀粉磷酸化酶。優(yōu)選地，緩沖溶液為 0.5mol/L NaCl和20mmol/L Tris-HCl。
[0006] 優(yōu)選地，步驟(2)中，使用純化后的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，在無菌條件下取 出250μ1小鼠快速免疫佐劑，與含抗原淀粉磷酸化酶蛋白250yg和250μ1的生理鹽水迅速混 勻，通過小鼠后腿肌肉注射免疫小鼠，后斷尾采血，全血4°C過夜，4°C 10000r/min離心 lOmin，收集血清并測定其效價，挑選效價為100000以上的小鼠按50ug八鼠的劑量腹腔加強 免疫，72小時后取全血，在75 %酒精中浸泡5min，分離脾細胞后和骨髓瘤細胞混合，在50 % 的PEG作用下離心融合，HAT篩選培養(yǎng)，有限稀釋法克隆細胞直至出現(xiàn)陽性單克隆率為 100%，獲得雜交瘤細胞株。
[0007] 優(yōu)選地，步驟(3)中，將腹水濾掉沉淀和脂質，濾液用4倍體積的0.06MpH 4.0的醋 酸緩沖液稀釋，氫氧化鈉調(diào)至pH為4.5，逐滴加入辛酸，室溫攪拌30min后，以8000r/min離心 30min，收集的上清液在冰浴條件下加入飽和硫酸銨，冰浴攪拌30min后，以6000r/min離心 20min，沉淀用0.02M PBS透析72小時后獲得純化的抗淀粉磷酸化酶抗體。
[0008] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種抗淀粉磷酸化酶單克隆抗體。
[0009] 優(yōu)選地，抗體效價為100000以上。
[0010] 采用本發(fā)明所提供的一種抗淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，一方面，通過 聚合酶鏈式反應擴增淀粉磷酸化酶基因，并將其克隆到原核表達載體（pET28a)中，經(jīng) E.coli表達并純化淀粉磷酸化酶;另一方面，用純化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，測定小 鼠血清效價，取小鼠脾細胞與小鼠淀粉磷酸化酶2/0細胞融合，制備能產(chǎn)生抗淀粉磷酸化酶 單克隆抗體的雜交瘤細胞株，后獲得高純度抗淀粉磷酸化酶單克隆抗體。通過本發(fā)明的方 法制備的抗淀粉磷酸化酶單克隆抗體具有高效價、高穩(wěn)定性和高特異性，為后期用于淀粉 磷酸化酶的免疫檢測奠定良好基礎。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明的PCR擴增的Pho基因片段，1: PCR回收片段;2 :Marker;
[0012] 圖2為本發(fā)明的pET28a( + )-淀粉磷酸化酶基因原核表達后菌液的SDS-聚丙烯酰 胺凝膠電泳圖；1:上清;2:表達上清;3:包含體;4: Marker;
[0013] 圖3為本發(fā)明的重組pET28a( + ) -淀粉磷酸化酶蛋白的Western blot圖，IMarker; 2:上清純化產(chǎn)物。
【具體實施方式】
[0014] 以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于 限定本發(fā)明的范圍。
[0015] 實施例一：
[0016] -種抗淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0017] 1、聚合酶鏈式反應擴增淀粉磷酸化酶基因，并將其克隆到原核表達載體(pET28a) 中，經(jīng)E.coli表達純化淀粉磷酸化酶(SP)，具體為：
[0018] pET28a( + )-淀粉磷酸化酶基因重組質粒的構建:設計淀粉磷酸化酶L序列引物為： 5 '-CGCGGATCCAAGTGCGTGTTGGATGAGACGA-3 ' 和5 '-CCGCTCGAGCTCCTCCCATTTAACATATTCA-3'， 分別引入酶切位點BamHI和Xhol，以木薯的cDNA為模板擴增出所需片段，原核表達載體 pET28a( + )分別用BamHI和Xhol雙酶切將其線性化后，與淀粉磷酸化酶目的基因的酶切產(chǎn)物 于16 °C進行連接反應過夜。后將5yL連接產(chǎn)物轉入感受態(tài)大腸桿菌DH5a中，接種于LB卡那霉 素抗性固體培養(yǎng)基，在37°C的條件下培養(yǎng)過夜，挑取單克隆至1.5mL卡那霉素 LB液體培養(yǎng)基 中，37°C，200rpm/min培養(yǎng)過夜，獲得pET28a( + )-SPL基因重組質粒。構建的重組質粒pET28a (+ ) -淀粉磷酸化酶經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切鑒定，得到342bp的目的條帶，1 %瓊脂糖凝膠電泳 結果如圖l，（a:PCR回收片段;b:Marker)。
[0019] pET28a( + ) -淀粉磷酸化酶基因原核表達:將構建好的基因重組質粒pET28a( + )_ 淀粉磷酸化酶轉化到大腸桿菌E.coli BL21中，經(jīng)1 .Ommol/L異丙基-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)誘導4-6h后，收集的細菌在4°C用超聲波破菌儀裂解菌體并高速離心收集上清和沉 淀并進行分析。加入等體積的十二烷基硫酸鈉(SDS-PAGE)。在100°C下煮沸3min，冰浴4min， 室溫下離心lmin(離心半徑8cm, 12000r/min)，取20yL離心液進行SDS-聚丙稀酰胺凝膠電 泳，誘導后的菌液在相對分子質量約為61000處出現(xiàn)明顯的目的條帶，未經(jīng)誘導的菌液無相 應條帶，結果如圖2。
[0020] Western blot檢測重組pET28a( + ) -淀粉磷酸化酶蛋白，SDS-PAGE后轉移硝酸纖 維素膜，用5%脫脂奶粉封閉;加抗His標簽單克隆抗體（1:1000)作為第一抗體，室溫輕搖作 用2h;TBST(Tris_buffered saline with Tween-20)洗滌3次；加入HRP標記的羊抗鼠 IgG (1:2000)為第二抗體，室溫反應2h，TBST(Tris_buffered saline with Tween-20)洗滌3 次；增強化學發(fā)光法(enhanced chemiluminecence，ECL)顯色，對表達產(chǎn)物-淀粉磷酸化酶 蛋白進行Western blot分析，得到的特異性蛋白的相對分子質量約為61000,如圖3。
[0021]淀粉磷酸化酶蛋白的純化處理：重組質粒pET28a( + ) -淀粉磷酸化酶陽性菌BL21 (DE3)經(jīng)IPTG誘導表達，離心收集菌體，將細菌重懸于Buffer A(0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，pH8.0)中，4°C超聲波破碎細菌，離心洗滌包涵體，8mo VL尿素變性增溶，經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖親和柱分離純化目的蛋白。純化蛋白經(jīng)透析法復性，尿素濃度梯度依次為6.00、 4.00、2.00、1.00、0.25、0.10及0.00mo 1/L，每個濃度透析時間為12h，表達的淀粉磷酸化酶 作為制備抗體的免疫原，提高免疫原純度，以獲得特異性抗體。
[0022] 2、用純化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，測定小鼠血清效價，取小鼠脾細胞與小 鼠淀粉磷酸化酶2/0細胞融合，制備能產(chǎn)生淀粉磷酸化酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株，具體 為：
[0023]淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠：使用純化后的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，按50ug/ 鼠的劑量免疫5只小鼠，在無菌條件下取出250μ1小鼠快速免疫佐劑（QuickAntibody-mouse)與含抗原淀粉磷酸化酶蛋白250yg和250μ1生理鹽水迅速混勻，通過后腿小腿肌肉注 射免疫小鼠，每只小鼠注射1〇〇μ1，第21天按同樣方式加強免疫1針，第35天小鼠斷尾采血， 全血4°C過夜，在4°C、10000r/min離心10min，收集血清，通過間接ELISA法測血清效價，用采 血前小鼠的血清作為陰性對照，得到5只小鼠血清效價，挑選效價為100000以上的小鼠取脾 臟進行細胞融合，將5周小鼠快速免疫佐劑取代傳統(tǒng)的弗氏佐劑，避免用弗氏佐劑乳化過程 中對抗原結構的破壞。
[0024]雜交瘤細胞的制備:挑選效價為100000以上的小鼠按50ug八鼠的劑量腹腔加強免 疫，72小時后摘眼球取全血，75%酒精中浸泡5min，無菌條件下取出小鼠脾臟，分離脾細胞 后和骨髓瘤細胞混合，本制備方法采用2000r/min高速離心10min，離心后在50%PEG作用下 融合，為保證高融合率得到特異性雜交瘤細胞的可能，融合過程用50%PEG，合理控制融合 時間，并融合后采用輕柔一吸一打的方法，使融合的細胞較少可能形成2個以上的多個細胞 核聚合體;HAT篩選培養(yǎng)，陽性細胞用有限稀釋法克隆細胞直至出現(xiàn)陽性單克隆率為100%， 由于細胞融合率較高，融合板檢測時陽性率為100%，為防止檢測到的抗體是未融合B細胞 產(chǎn)生，采用將融合板細胞上清液全部吸走，換上新的培養(yǎng)液再檢測的方法，以確定真實的陽 性細胞并用有限稀釋法進行克隆以得到陽性單克隆細胞。小鼠體內(nèi)誘生腹水法制備抗體， 將陽性雜交瘤細胞于液氮中長期保存。
[0025] 3、純化獲得抗淀粉磷酸化酶單克隆抗體
[0026]腹水的純化:腹水用濾紙濾去沉淀和脂質，濾液用4倍體積的0.06MPH4.0的醋酸緩 沖液稀釋，氫氧化鈉調(diào)PH至4.5，逐滴加入辛酸（終濃度為25μ1/πι1)，室溫攪拌30min后，以 8000r/min離心30min，收集的上清液在冰浴條件下等體積加入飽和硫酸銨，冰浴攪拌30min 后，以6000r/min離心20min，沉淀用0.02M PBS透析72小時后分裝獲得淀粉磷酸化酶抗體。 [0027]對本實施例一獲得的淀粉磷酸化酶抗體進行效價和亞型測定：
[0028]抗體檢測效價的測定采用棋盤法，蛋白用0.05M PH 9.6的碳酸鹽緩沖液梯度包 被，100μΙ/孔包被，4°C過夜，封閉，加 100μΙ/孔梯度稀釋的抗體，37°C反應30min，洗滌液洗 滌4-5次，加100μ1/孔酶標羊抗鼠抗體，在37°C反應30min，洗滌液洗滌4-5次，TMB底物液37 °C反應15min，0.5M H2S〇4終止反應。選擇陽性吸光度值大于陰性吸光度值的2.1倍時，抗原 抗體的稀釋倍數(shù)為抗原抗體的效價?？贵w亞型用購買的分型試劑盒根據(jù)說明書進行檢測。 [0029]融合后的細胞經(jīng)過2-4次的克隆和間接ELI SA方法篩選得到15株陽性單克隆細胞， 15株陽性單克隆細胞分別體外誘導法制備腹水。純化后15株抗體效價均達到105及以上，純 化目的為減少腹水中雜質對檢測過程中結果的干擾，濃縮抗體體積?？贵w亞型鑒定結果顯 示其中2H5和2E9為IgM型，1C7和3D2為IgG2a型，1F9為IgG2b型，其余抗體均為IgGl型。
[0030]表1純化后抗體效價和亞型測定
[0031]
[0032] 抗體的特異性檢測：
[0033] 將淀粉磷酸化抗體分別加到事先包被好淀粉磷酸化酶、鈣調(diào)蛋白、牛血清白蛋白 的酶標孔中反應，顯色結果表明淀粉磷酸化酶抗體只結合淀粉磷酸化酶抗原，不結合鈣調(diào) 蛋白、牛血清白蛋白，說明產(chǎn)生的抗體為淀粉磷酸化酶特異性抗體。
[0034] 表 2
[0035]
[0036]抗體的穩(wěn)定性測定：
[0037] 將所有純化后的I gG型的抗體置-20 °C反復凍融5次、4 °C保存30天，37 °C作用7天， 比較處理前后抗體效價的變化情況。
[0038] 13株IgG型的抗體熱穩(wěn)定性效價檢測結果見表2,大部分抗體在-20 °C凍融5次和在 4°C保存30天活性下降不明顯，其中2A2和3D2活性下降相對較少，說明抗體活性穩(wěn)定，優(yōu)選 作為生物檢測試劑盒。
[0039]表2抗體穩(wěn)定性測定
[0040]
[0041]
[0042] 對比例一:對比例一與實施例一的區(qū)別在于:采用弗氏佐劑、抗原淀粉磷酸化酶蛋 白和生理鹽水迅速混勻注射免疫小鼠，獲得的小鼠血清效價低于10000。
[0043] 對比例二:對比例二與實施例一的區(qū)別在于:采用1000r/min轉速離心10min，離心 后在100%PEG作用下融合，陽性單克隆雜交瘤量大大降低。
[0044] 綜上所述，采用本發(fā)明所提供的一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，一方 面，通過聚合酶鏈式反應擴增淀粉磷酸化酶基因，并將其克隆到原核表達載體(pET28a)中， 經(jīng)E.coli表達純化淀粉磷酸化酶;另一方面，用純化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，測定小 鼠血清效價，取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，制備能產(chǎn)生淀粉磷酸化酶單克隆抗體 的雜交瘤細胞株，后獲得高純淀粉磷酸化酶單克隆抗體。通過本發(fā)明的方法制備的淀粉磷 酸化酶單克隆抗體具有高效價、穩(wěn)定性和特異性，為后期用于淀粉磷酸化酶的免疫檢測奠 定良好基礎。
[0045] 進一步地，通過針對淀粉磷酸化酶抗原的純化條件、細胞融合條件的優(yōu)化、肝腹水 抗體純化參數(shù)的優(yōu)化，有效提高了淀粉磷酸化酶單克隆抗體的效價、穩(wěn)定性和特異性。 [0046]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明保護的范圍之內(nèi)。
【主權項】
1. 一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：（1)擴增淀 粉磷酸化酶基因，并將其克隆到原核表達載體中，經(jīng)E.coli表達純化淀粉磷酸化酶；（2)用 純化的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，測定小鼠血清效價，取小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞 融合，制備能產(chǎn)生抗淀粉磷酸化酶單克隆抗體的雜交瘤細胞株；（3)獲得純化淀粉磷酸化酶 單克隆抗體。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 步驟（1)中，以 5'-CGCGGATCCAAGTGCGTGTTGGATGAGACGA - 3'和 5' - CCGCTCGAGCTCCTCCCATTTAACATATTCA-3'為引物，引入酶切位點BamHI和Xhol，以木薯的cDNA 為模板擴增出所需片段，連接到克隆載體，表達載體pET28a( + )用BamH I/Xho I雙酶切后， 與淀粉磷酸化酶SP目的基因的酶切產(chǎn)物于16°C連接12小時，將5yL連接產(chǎn)物轉入感受態(tài)大 腸桿菌中，接種于LB卡那霉素抗性固體培養(yǎng)基，在37 °C的條件下培養(yǎng)過夜，挑取單克隆體至 卡那霉素 LB液體培養(yǎng)基中，37°C，200rpm/min的條件下培養(yǎng)過夜，獲得pET28a( + )-SP基因重 組質粒;將基因重組質粒pET28a( + )-SP轉化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)1.0mmol/L異丙基-D-硫 代半乳糖苷誘導4-6h后，收集的菌在4 °C用超聲波破菌儀裂解菌體并高速離心收集上清和 沉淀，后將細菌重懸于緩沖溶液中，超聲波破碎細菌，離心洗滌，8mol/L尿素變性增溶，經(jīng) Ni-NTA瓊脂糖親和柱分離制得純化的淀粉磷酸化酶，緩沖溶液為0.5mol/L NaCl和20mmol/ L Tris-HCl〇3. 根據(jù)權利要求1所述的一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 步驟(2)中，使用純化后的淀粉磷酸化酶蛋白免疫小鼠，在無菌條件下取出250μ1小鼠快速 免疫佐劑，與含抗原淀粉磷酸化酶蛋白250yg的250μ1的生理鹽水迅速混勻，通過小鼠后腿 肌肉注射免疫小鼠，后斷尾采血，全血4°C過夜，4°C10000r/min離心10min，收集血清并測定 其效價，挑選效價為100000以上的小鼠按50ug八鼠的劑量腹腔加強免疫，72小時后取全血， 在75 %酒精中浸泡5min，分離脾細胞后和骨髓瘤細胞混合，在50 %的PEG作用下離心融合， HAT篩選培養(yǎng)，有限稀釋法克隆細胞直至出現(xiàn)陽性單克隆率為100%，獲得雜交瘤細胞株。4. 根據(jù)權利要求1所述的一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述 步驟(3)中，將腹水濾掉沉淀和脂質，濾液用4倍體積的0.06M pH 4.0的醋酸緩沖液稀釋，氫 氧化鈉調(diào)至pH為4.5，逐滴加入辛酸，室溫攪拌30min后，以8000r/min離心30min，收集的上 清液在冰浴條件下加入飽和硫酸銨，冰浴攪拌30min后，以6000r/min離心20min，沉淀用 0.02M PBS透析72小時后獲得純化的淀粉磷酸化酶單克隆抗體。5. -種淀粉磷酸化酶單克隆抗體，根據(jù)權利要求1-4任一項所述的方法制得。6. 根據(jù)權利要求5所述的一種淀粉磷酸化酶單克隆抗體，其特征在于:所述抗體效價為 100000 以上。
【文檔編號】C07K16/40GK106084056SQ201610401822
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】歐文軍, 余厚美
【申請人】中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所