本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種單克隆抗體，具體涉及一種分泌抗人PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞及其特異性單克隆抗體的制備。

背景技術(shù)：

降鈣素原（procalcitonin, PCT）來(lái)源于人第11 號(hào)染色體上的降鈣素I基因，該基因在甲狀腺C細(xì)胞內(nèi)翻譯表達(dá)降鈣素原前體（proprocalcitonin）后，被內(nèi)源性多肽酶剪切掉N端25個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，成為含有116個(gè)氨基酸的無(wú)激素活性的降鈣素前肽物質(zhì)，即為降鈣素原（PCT）。PCT由N末端（1-57aa）-降鈣素（60-91aa）-鈣抑肽（96-116aa）三部分組成，分別由2肽（-Lys-Arg-）及4肽（-Gly-Lys-Lys-Arg-）連接，相對(duì)分子質(zhì)量約為13 KDa，PCT再經(jīng)過(guò)一系列細(xì)胞內(nèi)蛋白酶加工水解成包含32個(gè)氨基酸的具有激素活性的多肽，即為降鈣素（calcitonin, CT）。目前為止，關(guān)于降鈣素原的基礎(chǔ)研究很少，其來(lái)源和病理生理作用仍未明確，在體內(nèi)的生物學(xué)功能也不得而知。但是，根據(jù)PCT在血清中的含量變化與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，PCT被應(yīng)用于多種臨床檢測(cè)和觀察中。

在正常生理情況下，甲狀腺外的降鈣素I基因表達(dá)受到抑制，僅限于在甲狀腺和肺細(xì)胞中表達(dá)，因此，在健康人血中PCT含量極少，通常低于0.10 ng/mL。嚴(yán)重真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)感染以及膿毒癥和多臟器功能衰竭等會(huì)誘導(dǎo)全身多種組織和細(xì)胞中的降鈣素I基因表達(dá)，導(dǎo)致血清中PCT的含量會(huì)迅速升高，PCT濃度甚至?xí)f升至正常水平的數(shù)百至萬(wàn)倍，但CT的含量則保持不變或略有增高。然而，過(guò)敏和病毒感染以及自身性免疫疾病不會(huì)引起血液中PCT升高，局部細(xì)菌感染和慢性炎癥同樣不會(huì)導(dǎo)致PCT水平的明顯變化。因此，PCT是重要的炎癥標(biāo)志物，能夠區(qū)分細(xì)菌感染與病毒感染、自身免疫疾病引起的炎癥反應(yīng)。并且，與其他的炎癥指示因子相比，PCT具有更好的靈敏性和特異性。PCT在感染后2小時(shí)即可以檢測(cè)到，感染后6-12小時(shí)達(dá)到峰值，12-24h為平臺(tái)期，24h后濃度下降，半衰期較長(zhǎng)，為20-24小時(shí)，能在一段時(shí)間維持在高水平。同時(shí)PCT水平與感染程度正相關(guān)，PCT濃度越高意味著受感染程度越嚴(yán)重，因此PCT水平對(duì)炎癥的發(fā)生發(fā)展的診斷以及治療預(yù)后等方面都具有重要意義。其他炎癥因子如IL-6、IL-10、TNF-α在感染后2小時(shí)達(dá)到峰值，并迅速下降，不易被檢測(cè)到；而C反應(yīng)蛋白（CRP）在感染后24-48小時(shí)才達(dá)到峰值，且炎癥控制后濃度仍保持較高水平，不利于早期診斷和治療評(píng)價(jià)。在臨床診斷治療中，傳統(tǒng)檢測(cè)指標(biāo)如體溫、白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）的靈敏性和特異性均不高，而PCT與過(guò)去的生物學(xué)標(biāo)記物相比，其具有較為理想的準(zhǔn)確性和特異性，是一個(gè)理想的感染檢測(cè)標(biāo)志物，有助于臨床的早期診斷和制定合理的治療方案。

PCT檢測(cè)炎癥的方法已獲得美國(guó)食品藥品管理局（FDA）的許可。早期，檢測(cè)PCT主要使用凝膠層析分析法和高效液相色譜法，這兩種方法不僅費(fèi)時(shí)，且操作要求高，不易自動(dòng)化。近年來(lái)，PCT的檢測(cè)多采用免疫學(xué)方法進(jìn)行，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高和容易操作等優(yōu)點(diǎn)，包括雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法、膠體金法和放射免疫法等。所有這些免疫學(xué)方法的前提都是制備針對(duì)PCT的特異性單克隆抗體，在健康人血漿中PCT含量極低，在 0.2 ng/mL 以下，因此，對(duì)所制備抗體的親和力等參數(shù)要求很高。且目前檢測(cè)體系所用的抗體均來(lái)自國(guó)外大公司，價(jià)格昂貴。因此，制備 PCT 特異性單克隆抗體，為 PCT 的免疫檢測(cè)提供關(guān)鍵原料，對(duì)于擴(kuò)大其臨床應(yīng)用，降低醫(yī)療成本，具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

目前，國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的針對(duì)PCT蛋白的單克隆抗體，主要是使用合成的預(yù)測(cè)表位肽段作為抗原免疫小鼠，經(jīng)過(guò)雜交瘤技術(shù)獲得的，使用的抗原肽段分別是34-60aa以及75-88aa序列，均與降鈣素序列（60-91aa）存在交叉，因此不能夠區(qū)分PCT及CT。本發(fā)明的目的是篩選出特異性識(shí)別PCT蛋白N末端的氨基酸序列的單克隆抗體，減少交叉反應(yīng)，使其可以廣泛的應(yīng)用于PCT的臨床檢測(cè)及基礎(chǔ)研究中。

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，利用原核表達(dá)技術(shù)，表達(dá)并純化人PCT全長(zhǎng)蛋白，純化后的人PCT蛋白具有很高的純度，Western blot實(shí)驗(yàn)顯示該蛋白具有很強(qiáng)的免疫反應(yīng)性。純化后的人PCT蛋白免疫BALB/c小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，篩選到13株分泌抗人PCT蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)鑒定，其中1株識(shí)別的位點(diǎn)位于PCT蛋白N末端4-18aa序列。本發(fā)明對(duì)這株雜交瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞株7H8）進(jìn)行了生物學(xué)特性鑒定。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：篩選一種分泌抗人PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞（雜交瘤細(xì)胞株7H8）已于2015年 9 月 15 日為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）CCTCC所保藏（保藏地址是：中國(guó)武漢武漢大學(xué)，郵編：430072），其保藏號(hào)為CCTCC NO:C2015155，經(jīng)檢測(cè)存活。該細(xì)胞是圓形的半貼壁細(xì)胞（用彎管可以將細(xì)胞從瓶壁上吹下來(lái)，收集細(xì)胞不需要胰酶消化，如果有細(xì)胞懸浮存在也是正常），細(xì)胞分裂倍增的時(shí)間是16-18小時(shí)。

同時(shí)，本發(fā)明還提供一種抗人PCT蛋白N端氨基酸序列的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞的制備方法，該方法包括如下步驟：

（1）將人PCT蛋白與弗氏完全佐劑充分乳化，采用皮下免疫方法，以每只小鼠免疫蛋白濃度分別為30 μg、50 μg、100 μg和150 μg四個(gè)梯度的劑量，每個(gè)梯度免疫3只6~8周齡BALB/c雌性小鼠；

（2）兩周后進(jìn)行第2次免疫，將人PCT蛋白與弗氏不完全佐劑充分乳化，采用與步驟（1）中同樣的劑量和方法加強(qiáng)免疫BALB/c小鼠；

（3）2周后進(jìn)行第3次免疫，免疫劑量與方法同第2次免疫；

（4）融合前3 d用不加佐劑的人PCT抗原，采用脾下加強(qiáng)免疫，每只劑量為100 μg；

（5）融合前1 d用不加佐劑的人PCT抗原加強(qiáng)免疫，每只劑量50 μg；

（6）小鼠斷尾進(jìn)行尾尖采血，4 ℃，4000 g離心5 min，取上清，間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，選取血清效價(jià)大于1,000,000 的小鼠準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞融合試驗(yàn)；

（7）選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞以1:5~1:10混合，1500 g離心5 min，棄上清；

（8）輕搖離心管使細(xì)胞均勻分散，緩緩加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的PEG 1500并輕輕混勻1.5 min，然后加入20 mL 1640培養(yǎng)基；

（9）800 g離心5 min后棄上清，細(xì)胞中加入含有20%血清的HAT-1640培養(yǎng)基并混勻；

（10）將混勻的細(xì)胞均勻鋪于96孔板中，在37 ℃，5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7 d后觀察融合效果并換液；

（11）換液后第4 d用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液，選擇陽(yáng)性值高且細(xì)胞集落數(shù)目少的孔，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，每孔細(xì)胞數(shù)目理論值為1~2個(gè)；

（12）經(jīng)過(guò)3~4次亞克隆后，即獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞可用于制備抗人PCT蛋白單克隆抗體。

(13) 進(jìn)一步篩選和鑒定能夠分泌識(shí)別的表位位于PCT蛋白的N末端氨基酸，而不識(shí)別降鈣素（CT）的氨基酸序列的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

本發(fā)明還提供所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體。

本發(fā)明還提供所述的單克隆抗體在制備PCT蛋白檢測(cè)的試劑盒中的應(yīng)用。

所術(shù)的應(yīng)用，其中檢測(cè)PCT蛋白的方法采用雙抗夾心ELISA法。

本發(fā)明提供一種針對(duì)降鈣素原PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體的制備方法。本發(fā)明所獲得的單克隆抗體是使用全長(zhǎng)PCT蛋白作為抗原免疫小鼠后通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選得到的，經(jīng)鑒定其識(shí)別的表位位于PCT蛋白的N末端氨基酸，不識(shí)別降鈣素（CT）的氨基酸序列，因此能夠有效避免與降鈣素之間的交叉反應(yīng)性，特異性識(shí)別PCT蛋白，為雙抗夾心免疫化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)PCT蛋白提供一種新的配對(duì)單克隆抗體，對(duì)降低PCT檢測(cè)的假陽(yáng)性率、提高檢測(cè)的特異性具有重要的意義。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明人通過(guò)在大腸桿菌中原核表達(dá)密碼子優(yōu)化后的人PCT全基因序列，使其表達(dá)于胞漿上清中，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室的特異性親和純化等技術(shù)，可以簡(jiǎn)化人重組PCT蛋白的純化過(guò)程，純化后人PCT蛋白保持其天然活性，最大限度保證了蛋白空間構(gòu)象的完整性，將其作為抗原免疫BALB/c小鼠，篩選獲得的抗體可以更好的識(shí)別臨床血清中天然PCT蛋白。

（2）經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合及亞克隆篩選，獲得了7H8單克隆抗體，通過(guò)使用PCT全氨基酸序列截短合成的肽段，利用ELISA法對(duì)獲得的單克隆抗體進(jìn)行表位鑒定，精準(zhǔn)的確定了該抗體識(shí)別的序列是人PCT蛋白N末端（4-18aa）表位序列，Western blot和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，7H8單克隆抗體具有很好的特異性、穩(wěn)定性和靈敏度。

（3）對(duì)7H8抗體進(jìn)行HRP酶標(biāo)記，建立雙抗夾心ELISA法，對(duì)臨床血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，能捕獲血清樣品中的天然PCT蛋白，表明用自主研發(fā)的抗體用于臨床檢測(cè)具有可行性，為開(kāi)發(fā)PCT診斷試劑盒提供了一種很好的新材料。

附圖說(shuō)明

圖1. 原核表達(dá)的人PCT融合蛋白質(zhì)譜鑒定，軟件分析結(jié)果顯示，Protein score為282，與PCT蛋白匹配度很高，結(jié)果可靠。

圖2. PCT蛋白純化后鑒定，lane M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品； lane 1：30% 硫酸銨沉淀樣品；lane 2 ~ 5：Ni-IDA resin 純化后的蛋白；Lane 6：分子篩層析純化后的蛋白。

圖3. PCT蛋白純化后鑒定，圖3(A)：SDS-PAGE鑒定結(jié)果；圖3 (B)：Western blot鑒定結(jié)果，lane M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品； Lane 1：分子篩層析純化后的蛋白。

圖4. 7H8單克隆抗體亞型鑒定，7H8單克隆抗體亞型為 IgG1 亞類(lèi)。

圖5. 單克隆抗體純化后鑒定，圖5(A)：SDS-PAGE 鑒定圖，lane M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；lane 1：未煮沸的純化前腹水；lane 2：煮沸的純化前腹水；lane 3：未煮沸的純化后單克隆抗體；lane 4：煮沸的純化后單克隆抗體；圖5(B):免疫特異性鑒定，lane M：蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；lane 1：重組 PCT蛋白。

圖6. 7H8抗體穩(wěn)定性檢測(cè)，將純化后的單抗 7H8 分別置于-80 ℃、 -20 ℃、4 ℃和37℃的環(huán)境中，于1、2、3、9、27、60天取樣，間接 ELISA 檢測(cè)其效價(jià)變化，結(jié)果顯示：放于37℃的7H8抗體在一個(gè)月后效價(jià)才開(kāi)始下降，4℃條件下60天依然穩(wěn)定。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施方式的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅僅作示例說(shuō)明。

本實(shí)施例所用材料如下：

(1)菌種、序列和細(xì)胞株：大腸桿菌E.coli Top 10、ER2566菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存，密碼子優(yōu)化的PCT全基因序列、SP 2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞由廈門(mén)大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院夏寧邵教授惠贈(zèng)。

(2)主要試劑：HRP-羊抗兔由廈門(mén)大學(xué)夏寧邵教授惠贈(zèng)；標(biāo)準(zhǔn)PCT多克隆抗體購(gòu)自Proteintech公司；蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Thermo公司；弗氏佐劑購(gòu)自美國(guó)sigma公司；HT、HAT培養(yǎng)基添加劑購(gòu)自美國(guó)sigma公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司。

（3）臨床血清樣品：由湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科收集。

本發(fā)明通過(guò)以下方法制備得到分泌抗人PCT蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞：

（1）基因序列

由廈門(mén)大學(xué)惠贈(zèng)的人PCT全基因序列，是將基因密碼子置換為大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子，使其更加容易在大腸桿菌中表達(dá)，優(yōu)化后的核苷酸序列為如SEQ ID NO: 1所示；

表位定位的 4-18 aa 多肽序列為如SEQ ID NO：2所示。

（2）重組PCT蛋白菌株誘導(dǎo)表達(dá)

挑取篩選的單克隆菌株，接種到5 mL LB液體培養(yǎng)基中（含有100 μg/mL硫酸卡那霉素（Kan⁺）37 ℃培養(yǎng)至OD₆₀₀值達(dá)到0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)以轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的菌株進(jìn)行誘導(dǎo)作為陰性對(duì)照，其它培養(yǎng)條件與試驗(yàn)組一致。37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，室溫12000 g離心1min，收集菌體。分別制備蛋白樣品，用12%的SDS-PAGE分析重組蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：在試驗(yàn)組中可以觀察到一條相對(duì)較粗的蛋白條帶，其大小與理論基本一致，而在對(duì)照組中沒(méi)有出現(xiàn)這一條帶，說(shuō)明重組人PCT蛋白在重組菌株中可能獲得了高效表達(dá)。

（3）質(zhì)譜法檢測(cè)重組蛋白性質(zhì)

重組蛋白經(jīng)過(guò)質(zhì)譜儀分析后，將得到的數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配分析，結(jié)果顯示檢測(cè)蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)中PCT蛋白相符。軟件分析結(jié)果顯示，Protein score為282，說(shuō)明匹配度很高，結(jié)果可靠；質(zhì)譜結(jié)果還顯示PCT重組蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量約為13kD，與天然PCT蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量大小符合，這也進(jìn)一步提高了PCT重組蛋白的可信度（圖1）。

（4）目的蛋白大量表達(dá)與蛋白純化

從平板上挑取單菌落接種到50 mL LB（Kan⁺）培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后接種1% 的重組菌到2 L LB培養(yǎng)基（Kan⁺）中培養(yǎng)。待菌液OD₆₀₀值達(dá)到0.6后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)（終濃度為0.4 mmol/L）。37℃培養(yǎng)4 h后，12000 g離心10 min收集菌體。加入100 mL裂解液（50 mmol/L Tris·HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0），10 mm 探頭200 W功率在冰上超聲破碎菌體。將離心收集的上清放入燒杯，按公式V3=V*(100-Q1)/(Q1-Q2)（V代表上清體積；Q1 代表此次的硫酸銨濃度；Q2代表前一次硫酸銨濃度；V3代表加入的飽和硫酸銨體積）緩慢滴入飽和硫酸銨（pH 7.4），在冰上攪拌30 min，4 ℃靜置2 h。4 ℃，12 000 g，離心10 min，用PBS（pH 7.4）將沉淀溶解。依次做20%到80%七個(gè)梯度初步純化重組PCT蛋白，收集樣品SDS-PAGE鑒定。

用5到10倍柱體積的 buffer 0（50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，pH 8.0）以1 mL/min的速度平衡His-taq柱，然后PBS溶解的重組PCT蛋白以相同速度過(guò)柱，再用buffer 0溶解的20、50、100、250 mM 咪唑梯度洗脫重組蛋白，洗脫液于4 ℃用 PBS（pH 7.4）透析去除咪唑，收集樣品 SDS-PAGE 鑒定。

以0.5 mL/min的流速，用10倍柱床體積的流動(dòng)相PBS（pH 7.0）平衡TSK-GEL G3000 SW層析柱至280 nm吸收值無(wú)明顯變化，將檢測(cè)器吸收值歸零，在上樣環(huán)中注入樣品2 ml，以0.5 mL/min的流速過(guò)柱，收集280 nm處吸收值大于0.5 AU的蛋白峰。SDS-PAGE分析收集的蛋白峰（圖2）。

純化后人PCT蛋白樣品經(jīng)過(guò)電泳后，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示目的蛋白主要溶解在上清中，沉淀于30%的飽和硫酸銨中。人PCT蛋白經(jīng)過(guò)His-taq柱和TSK-GEL G3000 SW層析柱純化后，在SDS-PAGE電泳圖上只觀察到一條蛋白條帶（圖3A），說(shuō)明純度有了極大的提高，用Bandscan軟件分析蛋白的純度超過(guò)了99%。

對(duì)純化后蛋白進(jìn)行Western blot分析。將純化蛋白轉(zhuǎn)膜后，用含5%的脫脂奶的TN（50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl， pH7.5）緩沖液封閉2 h。加入按1:2000的比例用脫脂奶稀釋PCT多克隆抗體，37℃反應(yīng)2 h。用TNT緩沖液（50 mmol/L Tris·HCl，150 mmol/L NaCl，0.05％Tween-20，pH7.5）洗膜三次，每次10 min，加入HRP酶標(biāo)羊抗兔，室溫反應(yīng)2 h。用TNT洗膜三次，每次10 min，用HRP-DAB顯色試劑盒顯色。Western blot結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白與Proteintech公司的PCT兔源多克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)（圖3B），進(jìn)一步說(shuō)明人PCT基因在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)，而且具有良好的抗原性。

（5）動(dòng)物免疫與血清效價(jià)檢測(cè)

將純化后的PCT蛋白用PBS緩沖液透析后，稀釋至每只小鼠免疫蛋白濃度分別為30 μg、50 μg、100 μg和150 μg四個(gè)梯度，每個(gè)梯度免疫3只小鼠，1:1加入弗氏完全佐劑充分乳化。采用皮下多點(diǎn)免疫的方法，對(duì)每只小鼠分別以每只500 μl的劑量進(jìn)行初次免疫；兩周后，進(jìn)行再次免疫時(shí)1: 1加入蛋白溶液和弗式不完全佐劑，充分乳化后以同樣劑量免疫小鼠，一共加強(qiáng)免疫2次，每次間隔2周。在每次免疫的前一天收集小鼠血清進(jìn)行間接ELISA，以檢測(cè)PCT重組蛋白的免疫原性及血清抗體效價(jià)。

第三次免疫8 d后，小鼠尾靜脈采血，4 ℃，4 000 g離心5 min，取上清，間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)，選取血清效價(jià)高于1, 000, 000的小鼠，在融合前4 d再加強(qiáng)一次免疫，在脾臟注射30 μg PCT蛋白，2 d后尾靜脈注射20 μg蛋白。

（6）細(xì)胞融合、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選與亞克隆

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠的脾臟細(xì)胞以1:5~1:10混合，1500 g離心5 min，棄上清。輕搖離心管使細(xì)胞均勻分散，緩緩加入1 mL 37 ℃預(yù)熱的PEG 1500并輕輕混勻，融合90s后加入20 mL 1640培養(yǎng)基終止。800 g離心5 min后棄上清，在細(xì)胞沉淀中加入20%血清的HAT-1640培養(yǎng)基并混勻。

混勻細(xì)胞均勻鋪于96孔板中，在37 ℃，5% CO₂ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7 d后觀察融合效果并換液。換液后第4 d用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清液，選擇陽(yáng)性值高且細(xì)胞集落數(shù)目少的孔，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，每孔細(xì)胞數(shù)目理論值為1~2個(gè)。經(jīng)過(guò)3~4次亞克隆后，即獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，將此細(xì)胞株部分用于單克隆抗體的生產(chǎn)，部分于液氮罐內(nèi)凍存。

融合7 d后通過(guò)觀察和計(jì)算得到本次細(xì)胞的融合率為80.1%，融合10 d后通過(guò)間接ELISA法測(cè)得陽(yáng)性克隆率為31.2%。采用間接ELISA和有限稀釋法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)3~4次亞克隆后，獲得了13株能夠穩(wěn)定分泌抗人PCT蛋白單克隆抗體的細(xì)胞株。

（7）單克隆抗體的產(chǎn)生與純化

取 8-10 周齡 BALB/c 小鼠，先腹腔注射無(wú)菌石蠟油，每只 0.5 mL。7 d 后向腹腔內(nèi)注入雜交瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 1×10⁶ - 2×10⁶ /mL，每只小鼠大約注射 0.5mL。8-10 d 后即開(kāi)始采集腹水。將采集好的腹水 1:1（V/V） 緩慢加入飽和硫酸銨，冰上攪拌 30 min，4 ℃，12000 g 離心 10 min 后棄上清。沉淀用一定體積的 PBS 溶解，移至透析袋中透析平衡至 20 倍體積的 Binding buffer（Protein A Sefinose Kit 中提供）中以除去高濃度的離子，然后用蛋白 A 柱純化。將純化前與純化后的腹水抗體經(jīng) SDS-PAGE電泳，純化后的抗體，出現(xiàn)了三條帶：50kDa 的重鏈、25kDa 的輕鏈和約 100kDa 大小的條帶，但不煮沸時(shí)主要為 100 kDa 的條帶，煮沸后重鏈條帶明顯變強(qiáng)，100 kDa 的條帶變?nèi)?，且大小是重鏈的兩倍，煮沸前后輕鏈條帶強(qiáng)弱相差不大（圖5），因此，100 kDa 的條帶為重鏈與重鏈的聚合體，原因是兩條重鏈間的二硫鍵沒(méi)有完全破壞。從凝膠上看不到其它雜蛋白條帶，這說(shuō)明經(jīng)親和柱層析后，單克隆抗體達(dá)到了相當(dāng)高的純度，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

（8）單抗抗原表位的分析

對(duì)原核表達(dá)的 PCT 全氨基酸序列的N-端進(jìn)行截短合成，每15個(gè)氨基酸一條肽鏈，每條肽鏈與前一條肽鏈重復(fù)5個(gè)氨基酸，全長(zhǎng)共合成12條肽鏈，截短合成蛋白分別命名為1R、2R、3R、4R、5R、6R、7R、8R、9R、10R、11R、12R，利用間接 ELISA 對(duì)單克隆抗體的表位進(jìn)行定位。

將截短合成的12條多肽鏈用 CB 液（15mmol/L Na2CO3，35mmol/L NaHCO3）稀釋至濃度為 100ug/mL，包被 ELISA 板，37℃4h，再4℃ 過(guò)夜。洗板一次，加入 ED 封閉液37℃孵育2h后，洗板5次，加入100 ug/ml的單克隆抗體，37℃ 孵育 60min 后，洗板 5 次，加入HRP-羊抗鼠二抗，37℃ 孵育30 min，洗板5次，最后加入TMB底物顯色劑，37℃ 反應(yīng) 10 min，加入終止液，450nm/630nm 雙波長(zhǎng)檢測(cè)。通過(guò)篩選，7H8與第2條肽鏈反應(yīng)明顯，與其他肽鏈都未能出現(xiàn)特異性，說(shuō)明 7H8 識(shí)別的表位為人PCT蛋白N端4-18aa之間，即成功獲得針對(duì)人PCT蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體。篩選的其他株抗體主要是針對(duì)43-69aa和75-88aa表位。

（9）單克隆抗體亞型鑒定

將純化的 PCT 蛋白用1× CB 緩沖液（15mmol/L Na2CO3，35mmol/L NaHCO3）稀釋至濃度為 1ug/mL，包被 ELISA 板，4℃ 過(guò)夜。洗板一次后，加入 ED 封閉液，37℃ 2h 后，洗板 5 次，加入雜交瘤細(xì)胞上清，37℃ 孵育 30min 后，洗板 5 次，加入 HRP-羊抗鼠二抗（IgG、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM），37℃ 孵育 30min，洗板 5 次，最后加入 TMB 底物顯色劑，37℃ 反應(yīng) 10min，加入終止液，450/630nm 雙波長(zhǎng)檢測(cè)。結(jié)果顯示：7H8單克隆抗體為 IgG1 亞類(lèi)（圖4）。

（10）雜交瘤細(xì)胞系與單克隆抗體穩(wěn)定性的鑒定

對(duì)7H8分別進(jìn)行體外傳20代和液氮凍存3個(gè)月后再?gòu)?fù)蘇處理，間接ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清中抗人PCT McAb的效價(jià)。腹水單抗分別置于37 ℃、4 ℃、-20℃和-80℃的環(huán)境中。于1、2、3、9、27、60天取樣，間接 ELISA 檢測(cè)其效價(jià)變化。以-20 ℃保存的樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，小鼠血清作為陰性對(duì)照。

本發(fā)明篩選獲得的雜交瘤細(xì)胞體外傳20代后，采用間接ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中單克隆抗體的效價(jià)，其效價(jià)基本保持不變，仍然可以達(dá)到1×10⁴。將凍存于液氮中的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)單克隆抗體，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，凍存3個(gè)月后其效價(jià)也基本沒(méi)變，可以達(dá)到1×10⁴，說(shuō)明獲得的雜交瘤細(xì)胞系穩(wěn)定性好。腹水單抗分別置于37 ℃、4 ℃、-20℃和-80℃的環(huán)境中，37℃的7H8抗體在一個(gè)月后效價(jià)才開(kāi)始下降，4℃條件下60天依然穩(wěn)定（圖6）。說(shuō)明單抗的穩(wěn)定性好，完全符合商用抗體的貨架期穩(wěn)定性要求，具有良好的應(yīng)用前景。

（11）單克隆抗體的效價(jià)、特異性及適用范圍的鑒定

用1 μg/mL的人PCT蛋白包被96孔酶標(biāo)板，用間接ELISA方法檢測(cè)純化抗體效價(jià)。以陽(yáng)性值與陰性值的比值大于2.0的最大抗體稀釋倍數(shù)確定為抗體效價(jià)。結(jié)果表明，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液的抗體效價(jià)為1×10⁴，腹水的抗體效價(jià)為1×10⁶，腹水效價(jià)明顯高于上清效價(jià)。

為了研究7H8的適用范圍，用重組PCT蛋白、重組Cys蛋白、重組NGAL蛋白、P27蛋白、重組GAPDH蛋白、pp65蛋白和重組HFABP蛋白作為抗原，PBS緩沖液作為陰性對(duì)照，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，一抗7H8抗體孵育的最終濃度為100 ng/mL。結(jié)果顯示7H8單抗只與PCT蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而且反應(yīng)值特別明顯，說(shuō)明7H8具有高度的特異性。

（12）單抗相對(duì)親和力測(cè)定

以 PCT 抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合 7H8 抗體測(cè)定親和力常數(shù)（1） ①反應(yīng)系統(tǒng)中抗PCT單抗7H8 的初始濃度為1 ug/mL，PCT 抗原的初始濃度從 1 ug/mL往下倍比稀釋?zhuān)?形成8個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)，在 37 ℃反應(yīng)1 h； ②以每孔100 uL將反應(yīng)液以雙孔加入到包被了 PCT 抗原的免疫反應(yīng)板，37 ℃孵育1 h后洗板5次； ③加入100 uL羊抗鼠二抗酶結(jié)合物溶液37℃反應(yīng)1 h，洗板5次，加入底物顯色 10 min后加入終止液，測(cè)定OD = 450 nm/630 nm 計(jì)算各個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)的抗原結(jié)合率推算親和力常數(shù)。（2）改變條件重復(fù)（1）實(shí)驗(yàn)測(cè)定親和力常數(shù)。

將實(shí)驗(yàn)方法中的抗體初始濃度改成 2 ug/mL ，抗原的初始濃度從 10 ug/ml往下倍比稀釋?zhuān)?建立反應(yīng)系統(tǒng)，按照⑴中的步驟②、③檢測(cè)抗原結(jié)合率，并推算親和力常數(shù)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示需要抗原遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量才能對(duì)抗體形成競(jìng)爭(zhēng)抑制，可以直接用抗原初始濃度i0對(duì)B/(1-B)作圖求得斜率(親和力常數(shù))為 k = 1.43 ( r = 0.8702)，具有作為免疫診斷試劑原材料的潛力。改變條件按照形成反應(yīng)系列測(cè)得的結(jié)果，直接用抗原初始濃度i0對(duì)B/(1-B)作圖求得斜率（親和力常數(shù)），得出Kd值為0.4461，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比抗原、抗體濃度未提高時(shí)降低了近 4 倍。

（13）HRP酶標(biāo)抗體與雙抗夾心ELISA法檢測(cè)人PCT蛋白

① 7H8的HRP酶標(biāo)：純化后的單克隆抗體透析，4℃攪拌透析2h，換液2次；將HRP平衡到室溫，取HRP和NaIO4 分別加水溶解后，再將NaIO4溶液緩慢加入HRP溶液中，溶液由棕色轉(zhuǎn)變成綠色，置于4℃避光活化30 min；將乙二醇加入HRP和NaIO4 混合液中，室溫避光終止30 min，至溶液由綠色變?yōu)樽厣粚⒒罨腍RP加入透析的抗體中，4℃避光透析2h，換液2次；配制20mg/ml的硼酸氫鈉溶液，加入HRP酶體積1/10的NaBH4 溶液，4℃放置 2h，每隔30min混勻一次；用等體積的飽和硫酸銨沉淀HRP標(biāo)記抗體離心10min后瀝干； 50％甘油溶解沉淀蛋白，-20℃保存。間接 ELISA 法測(cè)定HRP標(biāo)記抗體活性。結(jié)果顯示：7H8抗體的酶標(biāo)效果很好，顯色明顯。

② 雙抗夾心ELISA法檢測(cè)人PCT蛋白：將Proteintech公司的PCT多克隆抗體作為捕獲抗體包被，HRP標(biāo)記7H8抗體作為二抗，檢測(cè)人重組PCT蛋白。每孔中加入100 ul多克隆抗體溶液(10ug/ml，溶于PBS)，將捕獲抗體包被在酶標(biāo)板表面。37℃孵育2h或4℃過(guò)夜。洗板 1 次；加入 200 μL ED封閉液（0.25% Casein），37 ℃放置2 h，洗板5次；加入純化的人PCT蛋白和臨床血清樣品，人PCT重組抗原用1×PBS（pH 7.45）稀釋至濃度為100 μg/mL，再按1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000梯度稀釋?zhuān)琍BS緩沖液為陰性對(duì)照，設(shè)置雙孔對(duì)照，每孔加入樣品100 μL，37 ℃放置2 h，洗板5次；用ED封閉液按 1: 5000稀釋HRP標(biāo)記7H8單抗，每孔加入100 μL稀釋后的HRP-7H8，37 ℃ 孵育30 min，洗板5次；加入100 μL TMB 底物顯色液，37 ℃避光顯色10 min；加入50μL終止液終止反應(yīng)；酶標(biāo)儀上使用450 nm/630 nm雙波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的OD值。結(jié)果顯示，雙抗夾心ELISA法檢測(cè)血清樣品中PCT陽(yáng)性與醫(yī)院檢測(cè)結(jié)果一致，且對(duì)純化的人PCT蛋白可達(dá)檢測(cè)到0.1μg/mL，陰性對(duì)照OD450低于0.1，表明7H8抗體對(duì)PCT有很好的識(shí)別作用，靈敏度高，為后續(xù)PCT診斷試劑盒的研究提供了很好的材料。

自1982年Fukushi H首次制備了AIV亞型單克隆抗體以來(lái)，單克隆抗體技術(shù)以其特有的高靈敏性和特異性而得到了廣泛的應(yīng)用。單克隆抗體技術(shù)中影響細(xì)胞融合的因素有很多，免疫效果尤為重要。將純化后的人PCT蛋白用皮下多位點(diǎn)免疫刺激小鼠的免疫系統(tǒng)。三次皮下免疫后，小鼠血清稀釋百萬(wàn)倍的效價(jià)仍可明顯檢測(cè)為陽(yáng)性，隨后進(jìn)行脾臟注射免疫和尾靜脈注射免疫，這樣就使得小鼠體內(nèi)的B淋巴細(xì)胞保持一種高度活躍的狀態(tài)。本發(fā)明通過(guò)動(dòng)物免疫這一關(guān)鍵步驟的把握，保證了較好的陽(yáng)性克隆率。細(xì)胞融合后生長(zhǎng)到孔底面積的1/2~1/3時(shí)進(jìn)行亞克隆，避免了陽(yáng)性細(xì)胞漏檢和染色體丟失情況的發(fā)生。采用操作簡(jiǎn)便的有限稀釋法，確保了雜交瘤細(xì)胞系的穩(wěn)定性和抗體分泌效價(jià)高的特點(diǎn)。經(jīng)過(guò)4次克隆化后，獲得的雜交瘤細(xì)胞陽(yáng)性率均為100%。在進(jìn)行細(xì)胞亞克隆時(shí)最好在HT-1640培養(yǎng)基中添加飼養(yǎng)細(xì)胞或細(xì)胞生長(zhǎng)因子，以防雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中因狀態(tài)不好而死亡。

目前，單克隆抗體的純化方法有很多，如辛酸-硫酸銨法、親和層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾法及高效液相層析法等。本發(fā)明采用先飽和硫酸銨分級(jí)沉淀初步純化再用Protein A柱純化抗體，純化后的單抗腹水抗體效價(jià)達(dá)1×10⁶。而雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清經(jīng)硫酸銨沉淀后就可以達(dá)到很高的純度，完全可以滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室使用要求和商品化要求，因?yàn)榧?xì)胞分泌的主要是單克隆抗體。由于細(xì)胞培養(yǎng)血清價(jià)格比較高，產(chǎn)生的抗體效價(jià)又比較低，因此在生產(chǎn)抗體的過(guò)程中，可以采取先培養(yǎng)一定量的雜交瘤細(xì)胞，然后利用小鼠誘導(dǎo)腹水生產(chǎn)抗體，這樣生產(chǎn)抗體不但效價(jià)高，而且生產(chǎn)成本可以大大降低。本實(shí)驗(yàn)篩選得到的7H8單克隆抗體能特異性識(shí)別人PCT蛋白N末端4-18aa序列，且能捕獲血清樣品中天然PCT蛋白，這為后續(xù)臨床炎癥感染中PCT的檢測(cè)提供了一個(gè)新的材料。雜交瘤細(xì)胞系及單抗穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明，單抗的雜交瘤細(xì)胞系和單抗的穩(wěn)定性好，長(zhǎng)期保存不會(huì)使抗體效價(jià)降低。多項(xiàng)數(shù)據(jù)表明7H8分泌的單克隆抗體能廣泛應(yīng)用于多種生物和組織的細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)試驗(yàn)，具有良好應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。

<110>湖南師范大學(xué)

<120>一種抗人降鈣素原蛋白N末端抗原表位的單克隆抗體7H8的制備

<160> 2

<210> 1

<211> 378

<212> DNA

<400> 1

ATGCACCACCACCCCCACCACGGATCTGCACCATTCCGTTCTGCCCTGGAGAGCTCTCCAGCAGATCCGGCAA

CACTGAGTGAAGACGAAGCGCGCCTTCTGCTGGCTGCACTGGTGCAGGACTATGTGCAGATGAAGGCCAGTGA

GCTGGAGCAGGAGCAAGAGCGTGAGGGTTCCAGCCTGGATAGCCCACGTTCTAAGCGTTGCGGTAATCTGAGT

ACCTGCATGCTGGGCACCTACACGCAGGACTTCAACAAGTTCCACACGTTCCCACAAACTGCAATCGGTGTTG

GTGCACCTGGTAAGAAGCGTGACATGTCCAGCGACCTGGAGCGTGACCATCGCCCTCATGTTAGCATGCCACA

GAATGCCAACTAA

<210> 2

<211> 15

<212> 多肽

<400> 2

PFRSA LESSP ADPAT