抗cd19單克隆抗體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種抗CD19單克隆抗體、其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的抗CD19的單克隆抗體不僅能夠有效識別高表達CD19蛋白的細胞，而且能夠成功用于Western Blot檢測，親和力檢測表明，該單克隆抗體具有極高的與靶蛋白的親和力。
【專利說明】
抗CD19單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及抗⑶19單克隆抗體及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] ⑶19在正常及惡性B淋巴細胞中均有表達，被視為B細胞發(fā)育過程中一個涵蓋階 段較長的最為可靠的表面標(biāo)記物。在正常淋巴組織中，CD19表達于生發(fā)中心的B細胞和濾 泡樹突狀細胞、套細胞、濾泡間T細胞區(qū)的樹突狀大細胞。事實上⑶19分子主要表達于早 期的B細胞，是一個95KDa左右的B細胞系特有的跨膜糖蛋白。
[0003] 作為B細胞在其分化和增殖期間表達的細胞表面分子。CD19通常被認為是治療B 細胞失調(diào)或疾病如B細胞惡性腫瘤，自身免疫病和移植排斥的治療靶點，其在B細胞系惡性 腫瘤上表達,Β細胞系惡性腫瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病和急性 成淋巴細胞性白血病。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)了與CD19特異性結(jié)合的抗體。
[0004] 然而，目前的針對CD19蛋白的抗體性能尚難以令人滿意。因此本領(lǐng)域需要開發(fā)新 的、性能優(yōu)異針對上述靶點的CD19蛋白抗體試劑或抗體藥物，以滿足臨床上的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種抗CD19單克隆抗體、其制備方法及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗體的重鏈可變區(qū)，所述的重鏈可變區(qū)包括以下 三個互補決定區(qū)⑶R :
[0007] SEQ ID Ν0:5 所示的 CDR1，
[0008] SEQ ID NO:6 所示的 CDR2,和
[0009] SEQ ID N0:7 所示的 CDR3。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述重鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0011] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗體的重鏈，所述的重鏈具有本發(fā)明第一方面所 述的重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的重鏈恒定區(qū)為人源或鼠源的。
[0013] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種抗體的輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)具有選自下 組的互補決定區(qū)⑶R :
[0014] SEQ ID N0:11 所示的 CDR1'，
[0015] SEQ ID NO: 12 所示的 CDR2'，和
[0016] SEQ ID NO: 13 所示的 CDR3'。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的輕鏈可變區(qū)具有SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列。
[0018] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種抗體的輕鏈，所述的輕鏈具有本發(fā)明第四方面所 述的輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述輕鏈的恒定區(qū)為人源或鼠源的。
[0020] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有：
[0021] (1)如本發(fā)明第一方面所述的重鏈可變區(qū)；和/或
[0022] (2)如本發(fā)明第三方面所述的輕鏈可變區(qū)。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述抗體具有：如本發(fā)明第二方面所述的重鏈；和/或如本發(fā)明 第四方面所述的輕鏈。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗體為特異性抗CD19蛋白的抗體。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗體包括：單鏈抗體、雙鏈抗體、單克隆抗體、嵌合抗體 (如人鼠嵌合抗體）、鼠源抗體、人源化抗體、雙特異性抗體（BiTE)以及嵌合抗原受體抗體 (CAR) 〇
[0026] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白具有：
[0027] (i)如本發(fā)明第一方面所述的重鏈可變區(qū)的序列、如本發(fā)明第二方面所述的重鏈 的序列、如本發(fā)明第三方面所述的輕鏈可變區(qū)的序列、如本發(fā)明第四方面所述的輕鏈的序 列、或如本發(fā)明第五方面所述的抗體的序列；以及
[0028] (ii)任選的協(xié)助表達和/或純化的標(biāo)簽序列。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的標(biāo)簽序列包括6His標(biāo)簽。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的重組蛋白特異性地與⑶19蛋白結(jié)合。
[0031] 本發(fā)明的第七方面，提供了一種多核苷酸，它編碼選自下組的多肽：
[0032] (1)如本發(fā)明第一方面所述的重鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第二方面所述的重鏈、如本發(fā) 明第三方面所述的輕鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第四方面所述的的輕鏈、或如本發(fā)明第五方面所 述的抗體；或
[0033] (2)如本發(fā)明第六方面所述的重組蛋白。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID N0. :1、3、8、9、10、14、15、或16所示 的序列。
[0035] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第七方面所述的多核苷酸。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括：細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、 哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、或其他載體。
[0037] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，它含有本發(fā)明第八方面 所述的載體或基因組中整合有本發(fā)明第七方面所述的多核苷酸。
[0038] 本發(fā)明的第十方面，提供了一種免疫偶聯(lián)物，該免疫偶聯(lián)物含有：
[0039] (a)如本發(fā)明第一方面所述的重鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第二方面所述的重鏈、如本發(fā) 明第三方面所述的輕鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第四方面所述的輕鏈、如本發(fā)明第五方面所述的 抗體、或如本發(fā)明第六方面所述的重組蛋白；和
[0040] (b)選自下組的偶聯(lián)部分：可檢測標(biāo)記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、或 酶。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述偶聯(lián)物選自：熒光或發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、MRI (磁共 振成像）或CT (電子計算機X射線斷層掃描技術(shù)）造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物的酶、放 射性核素、生物毒素、細胞因子（如IL-2等）、抗體、抗體Fc片段、抗體scFv片段、金納米顆 粒/納米棒、病毒顆粒、脂質(zhì)體、納米磁粒、前藥激活酶（例如，DT-心肌黃酶（DTD)或聯(lián)苯 基水解酶-樣蛋白質(zhì)（BPHL))、化療劑（例如，順鉬）或任何形式的納米顆粒等。
[0042] 本發(fā)明的第十一方面，提供了一種藥物組合物，它含有：
[0043] (i)如本發(fā)明第一方面所述的重鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第二方面所述的重鏈、如本發(fā) 明第三方面所述的輕鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第四方面所述的輕鏈、如本發(fā)明第五方面所述的 抗體、如本發(fā)明第六方面所述的重組蛋白、或如本發(fā)明第十方面所述的免疫偶聯(lián)物；以及 [0044] (ii)藥學(xué)上可接受的載體。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為注射劑型。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物用于制備治療腫瘤的藥物，所述的腫瘤選自 下組：胃癌、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小腸癌、骨癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、大腸 癌、前列腺癌、宮頸癌、腎上腺腫瘤、或膀胱腫瘤。
[0047] 本發(fā)明的第十二方面，提供了如本發(fā)明第一方面所述的重鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第 二方面所述的重鏈、如本發(fā)明第三方面所述的輕鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第四方面所述的輕鏈、 如本發(fā)明第五方面所述的抗體、如本發(fā)明第六方面所述的重組蛋白、或如本發(fā)明第十方面 所述的免疫偶聯(lián)物的用途，用于制備藥劑、試劑、檢測板或試劑盒；
[0048] 所述試劑、檢測板或試劑盒用于：檢測樣品中CD19蛋白；
[0049] 所述藥劑用于治療或預(yù)防表達⑶19蛋白的腫瘤。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤包括：胃癌、淋巴瘤、肝癌、白血病、腎臟腫瘤、肺癌、小 腸癌、骨癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、或腎上腺腫瘤。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤選自：胃癌和濾泡性淋巴瘤。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑包括芯片、包被抗體的免疫微粒。
[0053] 本發(fā)明的第十三方面，提供了一種檢測樣品中CD19蛋白的方法，所述方法包括步 驟：
[0054] (1)將樣品與本發(fā)明第五方面所述的抗體接觸；
[0055] (2)檢測是否形成抗原-抗體復(fù)合物，其中形成復(fù)合物就表示樣品中存在CD19蛋 白。
[0056] 本發(fā)明的第十四方面，提供了一種重組多肽的制備方法，該方法包含：
[0057] (a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第九方面所述的宿主細胞；
[0058] (b)從培養(yǎng)物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是本發(fā)明第五方面所述的抗體 或本發(fā)明第六方面所述的重組蛋白。
[0059] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0060] 圖1為抗CD19單克隆抗體（PGC3D6H10)的流式檢測圖。
[0061] 其中選用的目的細胞系是Ramos，抗⑶19單克隆抗體工作濃度為lug/ml，左圖是 不加抗CD19抗體的陰性對照，右圖為抗CD19的熒光檢測圖，陽性率83. 83%。
[0062] 圖2為抗CD19單克隆抗體（PGC3D6H10)的流式檢測圖。
[0063] 其中選用的目的細胞是人PBMC(外周血單核細胞），抗CD19單克隆抗體工作濃 度為lug/ml，左圖是不加抗CD19抗體的陰性對照，右圖為抗CD19的熒光檢測圖，陽性率 15. 44% 〇
[0064] 圖3為抗CD19單克隆抗體（PGC3D6H10)的流式檢測圖。
[0065] 其中選用的目的細胞是Jurkat，抗⑶19單克隆抗體工作濃度為lug/ml，左圖是不 加抗CD19抗體的陰性對照，右圖為抗CD19的熒光檢測圖，抗CD19抗體幾乎不會與Jurkat 細胞發(fā)生結(jié)合，陽性率為〇. 54%。
[0066] 圖4為抗CD19單克隆抗體（PGC3D6H10)的免疫印跡（WB)圖。
[0067] 其中抗⑶19單克隆抗體工作濃度為lug/ml，泳道1和2是兩個平行實驗組，上樣 蛋白為裂解Ramos細胞的總蛋白，泳道3是作為陰性對照的裂解Jurkat細胞的總蛋白。
[0068] 圖5為抗CD19單克隆抗體（PGA6E2D5)的流式檢測圖。
[0069] 其中選用的目的細胞系是Ramos，抗⑶19單克隆抗體工作濃度為lug/ml，左圖是 不加抗CD19抗體的陰性對照，右圖為抗CD19的熒光檢測圖，陽性率82. 65%。
[0070] 圖6為抗CD19單克隆抗體（PGA6E2D5)的流式檢測圖。
[0071] 其中選用的目的細胞是Jurkat，抗⑶19單克隆抗體工作濃度為lug/ml，左圖是不 加抗CD19抗體的陰性對照，右圖為抗CD19的熒光檢測圖，抗CD19抗體幾乎不會與Jurkat 細胞發(fā)生結(jié)合，陽性率為〇. 〇〇%。
[0072] 圖7為抗CD19單克隆抗體（PGB8D5C6)的流式檢測圖。
[0073] 其中選用的目的細胞系是Ramos，抗⑶19單克隆抗體工作濃度為lug/ml，左圖是 不加抗CD19抗體的陰性對照，右圖為抗CD19的熒光檢測圖，陽性率72. 33%。
[0074] 圖8為抗CD19單克隆抗體（PGB8D5C6)的流式檢測圖。
[0075] 其中選用的目的細胞是Jurkat，抗⑶19單克隆抗體工作濃度為lug/ml，左圖是不 加抗CD19抗體的陰性對照，右圖為抗CD19的熒光檢測圖，抗CD19抗體幾乎不會與Jurkat 細胞發(fā)生結(jié)合，陽性率為〇. 08%。
[0076] 圖9為抗CD19單克隆抗體（PGC3D6H10)的抗原親和力檢測圖。
[0077] 圖10為克隆抗CD19單克隆抗體（克隆號為PGC3D6H10)可變區(qū)VH和VL的RT-PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖分析結(jié)果圖。
[0078] 泳道1為DL5000DNA Marker ;泳道2為VH基因；泳道3為RT-PCR擴增VH基因陰 性對照；泳道4為VL基因；泳道5為RT-PCR擴增VL基因陰性對照。
[0079] 圖11為隨機的選取9個克隆做菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳圖（克隆號為 PGC3D6H10)。
[0080] 其中Marker左邊是對應(yīng)的隨機挑取的VH克隆進行的菌落PCR鑒定；Marker右邊 是對應(yīng)的隨機挑取的VL克隆進行的菌落PCR鑒定。
【具體實施方式】
[0081] 本發(fā)明人通過廣泛而深入的研究，經(jīng)過大量的篩選，獲得一種抗⑶19的單克隆抗 體，實驗結(jié)果表明，該抗CD19的單克隆抗體不僅能夠有效識別高表達CD19蛋白的細胞，而 且能夠成功用于Western Blot檢測。親和力檢測表明，該單克隆抗體與靶蛋白的親和力是 常規(guī)抗體的20倍以上。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
[0082] 本發(fā)明的抗⑶19單克隆抗體PGC3D6H10可特異性靶向腫瘤細胞表面的⑶19分子 表位，可用于抗體藥物制備，這些抗體藥物對B細胞系來源的腫瘤的診斷治療，病情進展， 轉(zhuǎn)移潛能以及預(yù)后的評價等方面具有巨大的潛能?；诒景l(fā)明的PGC3D6H10單克隆抗體所 能制備的抗體有重組抗體，ScFv抗體，人源化抗體，雙特異性抗體（BiTE)以及嵌合抗原受 體抗體（CAR)等。
[0083] CD 19 蛋白
[0084] ⑶19分子主要表達于早期的B細胞，是一個95KDa左右的B細胞系特有的跨膜糖 蛋白。⑶19在正常及惡性B淋巴細胞中均有表達，被視為B細胞發(fā)育過程中一個涵蓋階段 較長的最為可靠的表面標(biāo)記物。
[0085] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述CD19蛋白的氨基酸序列為：
[0086] MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEE⑶NAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLP GLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRffNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSS PSGKLMSPKLYVffAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPK SLLSLELKDDRPARDMffVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYL IFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPS YGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDS FSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSY ENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR(SEQ ID NO. :11)
[0087] 如本文所用，術(shù)語"抗體"或"免疫球蛋白"是有相同結(jié)構(gòu)特征的約150000道爾頓 的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈（L)和兩個相同的重鏈（H)組成。每條輕鏈通過一 個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數(shù)目不同。每條重 鏈和輕鏈也有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(qū)（VH)，其后是多個恒定區(qū)。 每條輕鏈的一端有可變區(qū)（VL)，另一端有恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相 對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區(qū)之間形 成界面。
[0088] 如本文所用，術(shù)語"可變"表示抗體中可變區(qū)的某些部分在序列上有所不同，它形 成了各種特定抗體對其特定抗原的結(jié)合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗 體可變區(qū)中。它集中于輕鏈和重鏈可變區(qū)中稱為互補決定區(qū)（CDR)或超變區(qū)中的三個片段 中?？勺儏^(qū)中較保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)中各自包含四個FR 區(qū)，它們大致上呈β -折疊構(gòu)型，由形成連接環(huán)的三個CDR相連，在某些情況下可形成部分 β折疊結(jié)構(gòu)。每條鏈中的⑶R通過FR區(qū)緊密地靠在一起并與另一鏈的⑶R -起形成了抗 體的抗原結(jié)合部位（參見 Kabat 等，NIH Publ.No.91-3242,卷 1，647-669 頁（1991))。恒 定區(qū)不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但是它們表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，例如參與抗體的依 賴于抗體的細胞毒性。
[0089] 脊椎動物抗體（免疫球蛋白）的"輕鏈"可根據(jù)其恒定區(qū)的氨基酸序列歸為明顯 不同的兩類（稱為κ和λ)中的一類。根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列，免疫球蛋白可以 分為不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些還可進一步 分成亞類（同種型），如IgGl，IgG2, IgG3, IgG4, IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的 重鏈恒定區(qū)分別稱為a、S、ε、Y、和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是 本領(lǐng)域人員所熟知的。
[0090] 如本文所用，術(shù)語"單克隆抗體（單抗）"指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即 該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數(shù)可能存在的天然發(fā)生的突變外。單克隆抗體高 特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規(guī)多克隆抗體制劑（通常是具有針對不同決定簇 的不同抗體）不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克 隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養(yǎng)來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾 語"單克隆"表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應(yīng)被解釋成需要用 任何特殊方法來生產(chǎn)抗體。
[0091] 本發(fā)明還包括具有所述的抗CD19蛋白單克隆抗體的相應(yīng)氨基酸序列的單克隆抗 體、具有所述的抗CD19蛋白單克隆抗體可變區(qū)鏈的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋 白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)（互補決定區(qū)， CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物（即免疫偶聯(lián)物及融合 表達產(chǎn)物），只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳 地至少95%同源性。
[0092] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括：藥物、毒素、細胞因子 (cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與所述的抗CD19蛋白單克隆抗體或其 片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還包括與所述的抗CD19蛋白單克隆抗體或其片段結(jié) 合的細胞表面標(biāo)記物或抗原。
[0093] 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或 (Fab'）2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0094] 如本文所用，術(shù)語"重鏈可變區(qū)"與"VH"可互換使用。
[0095] 如本文所用，術(shù)語"可變區(qū)"與"互補決定區(qū)（complementarity determining region, CDR) "可互換使用。
[0096] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述抗體的重鏈可變區(qū)包括以下三個互補決 定區(qū)CDR :
[0097] CDR1，其氨基酸序列為GYSFTDYT (SEQ ID N0:5)，其編碼核苷酸序列為， GGTTACTCATTCACTGACTACACC(SEQ ID NO. :8)；
[0098] CDR2,其氨基酸序列為INPYTGGT (SEQ ID NO. : 6)，其編碼核苷酸序列為， ATTAATCCTTACACTGGTGGTACT(SEQ ID NO. :9)；
[0099] CDR3，其氨基酸序列為ARWDYRYDGGAMDY (SEQ ID NO. : 7)，其編碼核苷酸序列為，GC AAGATGGGACTATAGGTACGACGGGGGTGCTATGGACTAC(SEQ ID NO. :10)〇
[0100] 在另一優(yōu)選例中，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為：
[0101] EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTDYTMNWVKQNLGQNLEWIGLINPYTGGTRYNQNFKDKAT LTVDTSSTTAYMELLSLTSDDSAVYFCARWDYRYDGGAMDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO. :2)；
[0102] 其編碼核苷酸序列為：
[0103] GAGGTCCAGCTACAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAACTTCAATGAAGATTTCCTGCAAG GCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAACCTTGGGCAGAACCTTGAGTGGATTGG ACTTATTAATCCTTACACTGGTGGTACTAGGTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCACATTAACTGTAGACAC GTCATCCACCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGATGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGATG GGACTATAGGTACGACGGGGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO. : 1) 〇
[0104] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述抗體的重鏈包括上述重鏈可變區(qū)和重鏈 恒定區(qū)，所述重鏈恒定區(qū)可以為鼠源或人源。
[0105] 如本文所用，術(shù)語"輕鏈可變區(qū)"與"VL"可互換使用。
[0106] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的抗體的輕鏈可變區(qū)，具有選自 下組的互補決定區(qū)⑶R :
[0107] CDR1'，其氨基酸序列為KSVSTSGYSY(SEQ ID勵:11)，其編碼核苷酸序列為，六六八八6 TGTCAGTACATCTGGCTATAGTTAT(SEQ ID NO. :14)；
[0108] CDR2'，其氨基酸序列為LVS(SEQ ID NO: 12)，其編碼核苷酸序列為， CTTGTATCC(SEQ ID NO. :15)
[0109] CDR3'，其氨基酸序列為QHIRELTRSEGGPSWK(SEQIDN0:13)，其編碼核苷酸序列 為，CAGCACATTAGGGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAA(SEQ ID NO. :16)
[oho] 在另一優(yōu)選例中，所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為：
[0111] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKNGLMLHQL(SEQ ID NO. :4)；
[0112] 其編碼核苷酸序列為：
[0113] GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATAC AGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAG ACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT TCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGT TCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG(SEQ ID N0. :3)。
[0114] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述抗體的輕鏈包括上述輕鏈可變區(qū)和輕鏈 恒定區(qū)，所述輕鏈恒定區(qū)可以為鼠源或人源。
[0115] 在本發(fā)明中，術(shù)語"本發(fā)明抗體"、"本發(fā)明蛋白"、或"本發(fā)明多肽"可互換使用，都 指特異性結(jié)合⑶19蛋白的抗體，例如具有重鏈可變區(qū)（如SEQ ID N0. : 2的氨基酸序列） 和/或輕鏈可變區(qū)（如SEQ ID N0. :4的氨基酸序列）的蛋白或多肽。它們可含有或不含 起始甲硫氨酸。
[0116] 在另一優(yōu)選例中，所述的抗體為抗CD19蛋白的鼠或人鼠嵌合單克隆抗體，它的重 鏈恒定區(qū)和/或輕鏈恒定區(qū)可以是人源化的重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)。更優(yōu)選地，所述的 人源化的重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)為人IgGl、IgG2等的重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)。
[0117] 本發(fā)明還提供了具有本發(fā)明抗體的其他蛋白質(zhì)或融合表達產(chǎn)物。具體地，本發(fā)明 包括具有含可變區(qū)的重鏈和輕鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物（即免疫 偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物），只要該可變區(qū)與本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)相同或至少 90%同源性，較佳地至少95%同源性。
[0118] -般，抗體的抗原結(jié)合特性可由位于重鏈和輕鏈可變區(qū)的3個特定的區(qū)域來描 述，稱為可變區(qū)域（CDR)，將該段間隔成4個框架區(qū)域（FR)，4個FR的氨基酸序列相對比較 保守，不直接參與結(jié)合反應(yīng)。這些CDR形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過其間的FR形成的β折疊在空間 結(jié)構(gòu)上相互靠近，重鏈上的⑶R和相應(yīng)輕鏈上的⑶R構(gòu)成了抗體的抗原結(jié)合位點?？梢酝?過比較同類型的抗體的氨基酸序列來確定是哪些氨基酸構(gòu)成了 FR或CDR區(qū)域。
[0119] 本發(fā)明抗體的重鏈和/或輕鏈的可變區(qū)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉 及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些具有帶CDR的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的分子，只 要其⑶R與此處鑒定的⑶R具有90 %以上（較佳地95 %以上，最佳地98 %以上）的同源 性。
[0120] 本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與 其他序列形成的融合蛋白。因此，本發(fā)明還包括所述抗體的片段、衍生物和類似物。
[0121] 如本文所用，術(shù)語"片段"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明抗體相同 的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個或多 個保守或非保守性氨基酸殘基（優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的 氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個或多個氨基酸殘基中具 有取代基團的多肽，或（iii)成熟多肽與另一個化合物（比如延長多肽半衰期的化合物，例 如聚乙二醇）融合所形成的多肽，或（iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多 肽（如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與6His標(biāo)簽形成的 融合蛋白）。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的 范圍。
[0122] 本發(fā)明抗體指具有⑶19蛋白結(jié)合活性的、包括上述⑶R區(qū)的多肽。該術(shù)語還包 括具有與本發(fā)明抗體相同功能的、包含上述CDR區(qū)的多肽的變異形式。這些變異形式包括 (但并不限于）：一個或多個（通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10 個）氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個（通常為 20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi)）氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相 近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末 端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括本發(fā)明抗體的活性 片段和活性衍生物。
[0123] 該多肽的變異形式包括：同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo) 突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與本發(fā)明抗體的編碼DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以 及利用抗本發(fā)明抗體的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0124] 本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人抗體或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的 多肽外，本發(fā)明還包括了本發(fā)明抗體的片段。通常，該片段具有本發(fā)明抗體的至少約50個 連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少 約100個連續(xù)氨基酸。
[0125] 在本發(fā)明中，"本發(fā)明抗體的保守性變異體"指與本發(fā)明抗體的氨基酸序列相比， 有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近 的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產(chǎn)生。
[0126] 表 1
[0127]
[0128]
[0129] 本發(fā)明還提供了編碼上述抗體或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本發(fā)明的 多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。 DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列 可以與SEQ ID N0. :1、3、8、9、10、14、15、16所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如 本文所用，"簡并的變異體"在本發(fā)明中是指編碼具有與本發(fā)明的多肽相同的氨基酸序列， 但與SEQ ID N0. :1、3、8、9、10、14、15、16所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
[0130] 編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸包括：只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽 的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列（和任選的附加編碼序列）以及非 編碼序列。
[0131] 術(shù)語"編碼多肽的多核苷酸"可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括 附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0132] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多 核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴格條件"是指：（1)在較低離子強度和較高溫度 下的雜交和洗脫，如〇. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C ;或（2)雜交時加有變性劑，如50% (v/v) 甲酰胺，0. 1 %小牛血清/0. 1% Ficoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的相同性至少在 90%以上，更好是95%以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO. :2和/或SEQ ID NO. :4所示的成熟多肽有相同的生物學(xué)功能和活性。
[0133] 本發(fā)明的抗體的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工 合成的方法獲得。一種可行的方法是用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度 較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。此外，還 可將重鏈的編碼序列和表達標(biāo)簽（如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
[0134] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。 本發(fā)明所涉及的生物分子（核酸、蛋白等）包括以分離的形式存在的生物分子。
[0135] 目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載 體）和細胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0136] 本發(fā)明還涉及包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷毎允蛊淠軌虮磉_蛋白質(zhì)。
[0137] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細 菌細胞；真菌細胞如酵母；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、C0S7、293細胞的動物細胞等。
[0138] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用0&(：12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方 法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
[0139] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下 進行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細胞生長到適當(dāng)?shù)募毎芏群?，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
[0140] 在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié) 合。
[0141] 本發(fā)明的抗體可以單獨使用，也可與可檢測標(biāo)記物（為診斷目的）、治療劑、PK(蛋 白激酶）修飾部分或任何以上這些物質(zhì)的組合結(jié)合或偶聯(lián)。
[0142] 用于診斷目的的可檢測標(biāo)記物包括但不限于：突光或發(fā)光標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、 MRI (磁共振成像）或CT (電子計算機X射線斷層掃描技術(shù)）造影劑、或能夠產(chǎn)生可檢測產(chǎn) 物的酶。
[0143] 可與本發(fā)明抗體結(jié)合或偶聯(lián)的治療劑包括但不限于：1.放射性核素（Koppe等， 2005,癌轉(zhuǎn)移評論（Cancer metastasi s reviews)24,539) ;2·生物毒（Chaudhary 等， 1989，自然（Nature) 339, 394 ;Epel 等，2002,癌癥免疫學(xué)和免疫治療（Cancer Immunology and Immunotherapy)51，565) ;3·細胞因子如 IL-2 等（Gi 11 ies 等，1992,美國國家科學(xué) 院院刊（PNAS)89,1428 ;Card 等，2004,癌癥免疫學(xué)和免疫治療（Cancer Immunology and Immunotherapy) 53, 345 ;Hal in 等，2003,癌癥研究（Cancer Research) 63, 3202) ;4·金納 米顆粒 / 納米棒（Lapotko 等，2005,癌癥通信（Cancer letters) 239, 36 ;Huang 等，2006,美 國化學(xué)學(xué)會雜志（Journal of the American Chemical Society) 128,2115) ;5·病毒顆粒 (Peng 等，2004,基因治療（Gene therapy) 11，1234) ;6.脂質(zhì)體（Mamot 等，2005,癌癥研究 (Cancer research)65，11631) ;7.納米磁粒；8.前藥激活酶（例如，DT-心肌黃酶（DTD)或 聯(lián)苯基水解酶-樣蛋白質(zhì)（BPHL)) ;10.化療劑（例如，順鉬）或任何形式的納米顆粒等。
[0144] 本發(fā)明還提供了一種組合物。在優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物，它含有上 述的抗體或其活性片段或其融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將這些物質(zhì)配制 于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為 6-8,盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合 物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括（但并不限于）：瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給 藥。
[0145] 本發(fā)明的藥物組合物可直接用于結(jié)合CD19蛋白分子，因而可用于預(yù)防和治療腫 瘤。此外,還可同時使用其他治療劑。
[0146] 本發(fā)明的藥物組合物含有安全有效量（如0· 001_99wt%，較佳地0· 01_90wt%， 更佳地0. l-80wt%)的本發(fā)明上述的單克隆抗體（或其偶聯(lián)物）以及藥學(xué)上可接受的載體 或賦形劑。這類載體包括（但并不限于）：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。 藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽 水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液宜 在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約 5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
[0147] 使用藥物組合物時，是將安全有效量的免疫偶聯(lián)物施用于哺乳動物，其中該安全 有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重， 較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給 藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
[0148] 雜交瘤細胞株
[0149] 本發(fā)明還提供了可生產(chǎn)本發(fā)明針對CD19蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株；優(yōu)選 的，本發(fā)明提供了高效價的針對CD19蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0150] 在獲得生產(chǎn)本發(fā)明的CD19蛋白單克隆抗體的雜交瘤之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以 方便地利用該雜交瘤細胞株制備抗體。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員還可很方便地獲知本發(fā)明的 抗體的結(jié)構(gòu)（比如抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)），然后可通過重組方法來制備本發(fā)明 的單克隆抗體。
[0151] 單克隆抗體的制備
[0152] 本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進行制備。例如，本發(fā) 明抗原，可被施用于動物以誘導(dǎo)單克隆抗體的產(chǎn)生。對于單克隆抗體，可利用雜交瘤技術(shù)來 制備（見 Kohler 等人，Nature 256 ;495, 1975 ;Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6:511, 1976 ； Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6:292, 1976 ;Hammerl ing 等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier，N· Y. , 1981)或可用重組 DNA 法（美國專利號 4,816,567)制備。
[0153] 代表性的骨髓瘤細胞是有效融合、通過選擇的抗體產(chǎn)生細胞支持抗體的穩(wěn)定高水 平產(chǎn)生、且對培養(yǎng)基（HAT培養(yǎng)基基質(zhì)）敏感的那些骨髓瘤細胞，包括骨髓瘤細胞株，例如 鼠類的骨髓瘤細胞株，包括衍生自M0PC-21和MPC-11小鼠腫瘤的骨髓瘤細胞株（可購自 Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亞哥，加利福尼亞，美國）以及 SP_2、NZ0 或 X63_Ag8_653 細胞（可購自 American Type Culture Collection，洛克維爾，馬里蘭，美 國）。人骨髓瘤和小鼠-人雜合骨髓瘤細胞株也已被描述用于產(chǎn)生人單克隆抗體[Kozbor， J. Immunol. , 133 :3001 (1984) ;Brodeur 等，單克隆抗體的生產(chǎn)技術(shù)和應(yīng)用（Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications),51-63 頁(Marcel Dekker, Inc.，紐約，1987)]。
[0154] 對雜交瘤細胞生長于其中的培養(yǎng)基進行分析以檢測具有所需特異性的單克隆 抗體的產(chǎn)生，如，通過體外結(jié)合分析例如，酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA)或放射免疫分析 (RIA)。表達抗體的細胞的位置可用FACS進行檢測。然后，可將雜交瘤克隆通過有限稀 釋步驟形成亞克?。╯ubcloned)，并通過標(biāo)準方法生長（Goding，單克隆抗體（Monoclonal Antibodies):原則和實踐（Principles and Practice)，Academic Press (1986) 59-103 頁）。為了達到這一目的而使用的適合的培養(yǎng)基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。此 外，雜交瘤細胞可在動物體內(nèi)作為腹水瘤生長。
[0155] 由亞克隆分泌的單克隆抗體從培養(yǎng)基、腹水或血清中通過常規(guī)的免疫球蛋白純化 工藝適當(dāng)?shù)氐玫椒蛛x，這些純化工藝為例如，蛋白A-瓊脂糖法（protein A-Sepharose)、輕 基磷灰石層析、凝膠電泳、透析或親和層析。
[0156] 本發(fā)明提供了一種針對CD19蛋白的單克隆抗體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中， 單克隆抗體采用培養(yǎng)雜交瘤細胞方法制備。取雜交瘤細胞培養(yǎng)的上清液，經(jīng)飽和硫酸銨沉 淀法粗提出IgG,再將粗提的抗體經(jīng)親和層析柱（Protein G-Sephrose)純化。
[0157] 本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案中，單克隆抗體采用Balb/C小鼠腹水生產(chǎn)單克隆抗體 的方法制備。將約雜交瘤細胞接種到致敏的小鼠腹腔內(nèi)，10天左右可見腹部明顯脹大。抽取 腹水，經(jīng)飽和硫酸銨沉淀法粗提后，再將粗提的抗體經(jīng)親和層析柱（Protein G-Sephrose) 純化。
[0158] 可以通過鼠源單抗來制備高親和力，低免疫源性，高效的重組或人源化抗體。對鼠 源抗體進行人源化改造，可保留抗體可變區(qū)與人源抗體恒定區(qū)融合，提高抗體親和力；或改 造抗體結(jié)構(gòu)，構(gòu)建只保留抗體可變區(qū)的ScFv或含抗體可變區(qū)和部分恒定區(qū)的Fab，可提高 抗體在體內(nèi)的吸收百分比和半衰期。
[0159] 標(biāo)記的免疫球蛋白
[0160] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述免疫球蛋白帶有可檢測標(biāo)記物。更佳地，所述的標(biāo) 記物選自下組：膠體金標(biāo)記物、有色標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物。
[0161] 膠體金標(biāo)記可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進行。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的方案 中，CD19蛋白的單克隆抗體用膠體金標(biāo)記，得到膠體金標(biāo)記的單克隆抗體。
[0162] 本發(fā)明的CD19蛋白單克隆抗體具有很好的特異性，很高的效價和親和力。
[0163] 檢測板及其材料
[0164] 本發(fā)明的檢測板可采用本領(lǐng)域常用的檢測板材料，采用常規(guī)的檢測板制備方法制 成。
[0165] 本發(fā)明檢測CD19蛋白的免疫檢測板，包括測試條和支撐測試條的支撐板，如可采 用PVC聚脂膠板等；所述的測試條由濾樣紙、層析材料、硝酸纖維素膜和吸水紙依次搭接組 成，搭接部位可以采用常規(guī)的方法，如膠帶等固定連接；其中：層析材料預(yù)包被膠體金標(biāo)記 或有色標(biāo)記的CD19蛋白單克隆抗體或多克隆抗體，優(yōu)選被膠體金標(biāo)記的CD19蛋白單克隆 抗體，硝酸纖維素膜上吸附檢測線和質(zhì)控線；
[0166] 在一個優(yōu)選的方案中：層析材料上預(yù)包被膠體金標(biāo)記的CD19蛋白單克隆抗體是 采用濃度為〇. 5-1. 5mg/ml膠體金標(biāo)記的⑶19蛋白單克隆抗體溶液進行預(yù)包被的，包被量 為 50μ Ι/cm2;優(yōu)選的濃度為 0· 5 或 1. 5mg/ml，50y 1/cm2;
[0167] 檢測方法與結(jié)果判定
[0168] 平放檢測板，將試樣滴在濾樣紙上，試樣約120 μ 1，3~5min內(nèi)觀察層析結(jié)果。根 據(jù)出現(xiàn)的條紋位置來判斷結(jié)果。
[0169] 陰性：質(zhì)控區(qū)、檢測區(qū)均出現(xiàn)明顯的色帶，示為陰性；
[0170] 陽性：只在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)明顯色帶，而在檢測區(qū)無色帶，示為陽性；
[0171] 無效：質(zhì)控區(qū)、檢測區(qū)無任何色帶或在質(zhì)控區(qū)未出現(xiàn)色帶而在檢測區(qū)出現(xiàn)色帶，表 明檢測方法錯誤或檢測板變質(zhì)或失效，應(yīng)重新?lián)Q取檢測板檢測。
[0172] 方法和樣本
[0173] 本發(fā)明涉及用于在以細胞和/或組織溶解的樣本檢測腫瘤的方法。該方法步驟大 致如下：獲得細胞和/或組織樣本；將樣本溶解在介質(zhì)中；檢測在所述溶解的樣本中CD19 蛋白的水平。本發(fā)明方法所使用的樣本可以是存在于細胞保存液中的包括細胞的任何樣 本,正如在液基細胞檢測法中所使用的。優(yōu)選地使用Western Blot方法進行檢測。
[0174] 試劑盒
[0175] 本發(fā)明還提供了一種指含有本發(fā)明的抗體（或其片段）或本發(fā)明的檢測板的試劑 盒，在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒還包括容器、使用說明書、緩沖劑等。
[0176] 本發(fā)明進一步設(shè)計用于檢測CD19蛋白水平的檢測試劑盒，該試劑盒包括識別 CD19蛋白的抗體，用于溶解樣本的裂解介質(zhì)，檢測所需的通用試劑和緩沖液，如各種緩沖 液、檢測標(biāo)記、檢測底物等。該檢測試劑盒可以是體外診斷裝置。
[0177] 本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：
[0178] (1)本發(fā)明中經(jīng)過大量篩選獲得的抗⑶19單克隆抗體PGC3D6H10能夠有效識別高 表達⑶19蛋白的細胞；
[0179] (2)本發(fā)明PGC3D6H10單克隆抗體能夠識別細胞表面的天然⑶19分子。
[0180] (3)本發(fā)明PGC3D6H10單克隆抗體能夠成功用于Western Blot檢測。
[0181] (4)本發(fā)明PGC3D6H10單克隆抗體具有極高的親和力，與靶蛋白的親和力是常規(guī) 抗體的20倍以上。
[0182] 下面結(jié)合具體實施例，進一步詳陳本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明詳細條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩嶒炇沂謨裕∟ew York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。以下實施例中所用的實驗材料和試劑如無特別說明均可從市售渠道獲 得。
[0183] 實施例1
[0184] 步驟一：雜交瘤細胞的制備
[0185] 用B細胞系腫瘤細胞或CD19真核重組蛋白抗原分別免疫雌性健康的BALB/c小 鼠，挑選出血清ELISA，WB，F(xiàn)C檢測呈陽性的小鼠，對其提取脾臟細胞，與骨髓瘤細胞融合， 形成雜交瘤細胞；將雜交瘤細胞在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對高通量流式篩選呈陽性的單克隆 細胞進行ELISA復(fù)篩，獲得陽性克隆36株，再進行WB復(fù)篩，獲得陽性克隆9株，對WB陽性 細胞進行亞克隆，經(jīng)過2次亞克隆，排除亞克隆過程中返陰細胞株6株，最終篩選出能夠穩(wěn) 定分泌CD19抗體的單克隆細胞3株（包括：PGC3D6H10單克隆抗體細胞株、PGA6E2D5單克 隆抗體細胞株、PGA6D5C6單克隆抗體細胞株）；運用亞型鑒定試劑盒，鑒定單克隆抗體的亞 型。
[0186] 步驟二：抗⑶19單克隆抗體的制備
[0187] (1)單克隆抗體的生物學(xué)鑒定
[0188] 將步驟一鑒定合格的陽性的單克隆細胞注射到小鼠體內(nèi)進行腹水生產(chǎn)，將產(chǎn)生的 腹水通過Prote in A層析純化后得到抗CD19單克隆抗體。采用流式細胞術(shù)，免疫熒光術(shù) 和Western Blot鑒定抗體的特異性。具體操作如下：
[0189] (1. 1)流式細胞術(shù)檢測抗體的特異性
[0190] 收集高表達⑶19的淋巴瘤細胞系Ramos (購自美國ATCC)，以及Ficol法分離的人 PBMC(外周血單核細胞）以及陰性對照Jurkat細胞系（購自美國ATCC)，4%多聚甲醛室溫 固定20min，PBS配制的3% BSA封閉液中室溫放置30min，用抗⑶19單克隆抗體（lug/ml) 室溫孵育lh，PBST離心洗滌2次，F(xiàn)ITC或Alexa Fluor 647-羊抗鼠 IgG(H+L)二抗避光共 孵育lh，PBST離心洗滌3次，去掉未結(jié)合上的熒光二抗，流式細胞儀檢測⑶19陽性率。
[0191] (1. 2)免疫熒光術(shù)檢測抗體的特異性
[0192] 收集高表達⑶19的淋巴瘤細胞系Ramos，以及Ficol法分離的人PBMC(外周血單 核細胞）以及陰性對照Jurkat細胞系，4 %多聚甲醛室溫固定20min，PBS配制的3 % BSA封 閉液中室溫放置30min，用抗⑶19單克隆抗體（lug/ml)室溫孵育lh，PBST離心洗滌2次， FITC或Alexa Fluor 488-羊抗鼠 IgG(H+L)二抗避光共孵育lh，PBST離心洗滌2次，DAPI 室溫核染l〇min，PBST離心洗滌3次，去掉未結(jié)合上的染料，Confocal檢測⑶19染色情況。
[0193] (1. 3) Western Blot檢測抗體的特異性
[0194] 收集高表達⑶19的淋巴瘤細胞系Ramos，T淋巴白血病細胞系Jurkat，蛋白裂 解液冰上裂解30min，離心取上清，BSA法測定上清蛋白濃度，加入loading BufTer，10% SDS-PAGE，120V 凝膠電泳 90min，轉(zhuǎn)膜 400mA，90min。5%脫脂牛奶室溫封閉 lh，anti-CD19 單克隆抗體（lug/ml) 4°C孵育過夜，PBST (含0. 1 % Tween-20的PBS)洗滌3次，HRP-羊抗 鼠 IgG (H+L)二抗室溫孵育lh，PBST洗滌3次，ECL法顯影，曝光2min。
[0195] 實驗結(jié)果：
[0196] 對所獲得的3株陽性單克隆抗體（編號：PGC3D6H10、PGA6E2D5、PGB8D5C6)分別進 行流式檢測和Western Blot實驗的應(yīng)用，結(jié)果如圖1-8示（圖1-4,克隆號PGC3D6H10 ;圖 5-6，PGA6E2D5 ;圖7-8，PGB8D5C6)。從這些應(yīng)用數(shù)據(jù)可以看出，克隆號為PGC3D6H10的單克 隆抗體應(yīng)用效果最佳，流式細胞術(shù)分析中，Ramos的CD19染色陽性率達到83. 83% (圖1)， 而且PGC3D6H10單克隆抗體的Western Blot應(yīng)用結(jié)果為陽性，說明PGC3D6H10單克隆抗體 能夠成功用于Western Blot中進行相關(guān)抗原的檢測，而PGA6E2D5單克隆抗體和PGB8D5C6 單克隆抗體的Western Blot應(yīng)用結(jié)果為陰性，無法用于Western Blot檢測。
[0197] 通過進一步的抗體親和力分析，克隆號為PGC3D6H10的鼠抗人⑶19單克隆抗體與 真核重組r⑶19蛋白的KD親和力常數(shù)為434. 6pM(圖9)，較于常規(guī)的親和力常數(shù)為納摩爾 級的抗體（如，本發(fā)明中其它單克隆抗體）親和力常數(shù)高出20倍以上。
[0198] 結(jié)合上述流式檢測和Western Blot實驗的應(yīng)用結(jié)果，以及親和力測定分析，本發(fā) 明篩選到了一株可以分泌有效結(jié)合CD19表面蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株（克隆號 PGC3D6H10)，并制備出了抗CD19的單克隆抗體，這一抗體具有較強的抗原親和力和抗原特 異性。
[0199] 實施例2抗CD19單克隆抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的克隆
[0200] 所用細胞株為采用上述方法獲得的能分泌高親和力、高特異性的抗CD19單克隆 抗體的雜交瘤細胞株，對應(yīng)的編號為PGC3D6H10,所對應(yīng)的抗體分子亞型為：重鏈IgGl型， 輕鏈κ型。
[0201] 取對數(shù)生長期的雜交瘤細胞2X 106, Tri zol法提取細胞總RNA，
[0202] 取少量用Nanodrop定量及1 %非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，隨后用Superscript. I II First-StrandSynthesis System for RT-PCR 試劑盒（K1622，Thermo)反轉(zhuǎn)錄 cDNA, 用特異性引物擴增抗CD19抗體基因的重鏈或輕鏈可變區(qū)。將含有相應(yīng)重鏈可變區(qū)或輕鏈 可變區(qū)片段的PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收。將回收得到的相應(yīng)重鏈可變區(qū) 和輕鏈可變區(qū)克隆至測序載體PCR2. 1，并進行測序，對測序結(jié)果進行同源性和結(jié)構(gòu)分析。
[0203] 具體操作步驟：
[0204] (1) RT-PCR擴增CD19抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)
[0205] 引物設(shè)計：本發(fā)明人選用mouse_IgG(Mouse Ig-Primer Set，Novagen)引物進行重 鏈可變區(qū)克隆，mouse-IgGK (Mouse Ig-Primer Set，Novagen)通用引物進行輕鏈可變區(qū)克 隆。
[0206] 1. 1雜交瘤細胞總RNA提?。篢rizol法；
[0207] 1. 2反轉(zhuǎn)錄PCR :以雜交瘤細胞總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄cDNA，具體操作如下：
[0208] 1. 2. 1按表1配成20ul體系，輕輕混勻，離心，42°C孵育60min，70°C終止反應(yīng) 5min，分裝，-20°C保存。
[0209] 表 1
[0210]

[0211] 1. 3抗體可變區(qū)特異引物PCR，具體操作如下：
[0212] 按表2,表3中的反應(yīng)體系，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用特異引物合成抗體重 鏈和輕鏈可變區(qū)。
[0213] 表 2
[0214]
[0217] 步驟四：PCR產(chǎn)物克隆和測序
[0218] 將PCR得到的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)核苷酸片段產(chǎn)物膠回收（09114KE1， AxyGEN)后，按表四中體系進行TA克隆，16°C連接過夜，分別構(gòu)建到測序載體上，按表五中 體系挑取單克隆菌落進行菌落PCR鑒定，1 %瓊脂糖凝膠電泳選取有陽性條帶的克隆，提質(zhì) 粒（07714KAl，AxyGEN)測序。
[0219] 表 4
[0220]
[0223] 本實施例通過單克隆雜交瘤細胞的抗體基因提?。▓D10-11，克隆號PGC3D6H10)， 來獲得可以分泌有效結(jié)合CD19表面蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株的抗體基因序列（SEQ ID N0. :1-4,克隆號PGC3D6H10)，PGC3D6H10單克隆抗體的測序結(jié)果如下。
[0224] PGC3D6H10單克隆抗體的VH核苷酸序列：
[0225] GAGGTCCAGCTACAACAGTCTGGACCTGAACTGGTGAAGCCTGGAACTTCAATGAAGATTTCCTGCAAG GCTTCTGGTTACTCATTCACTGACTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAACCTTGGGCAGAACCTTGAGTGGATTGG ACTTATTAATCCTTACACTGGTGGTACTAGGTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCACATTAACTGTAGACACGT CATCCACCACAGCCTACATGGAGCTCCTCAGTCTGACATCTGATGACTCTGCAGTCTATTTCTGTGCAAGATGGGAC TATAGGTACGACGGGGGTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO. :1)
[0226] PGC3D6H10單克隆抗體的VH編碼氨基酸序列：
[0227] EVQLQQSGPELVKPGTSMKISCKASGYSFTDYTMNVVKQNLGQNLEffIGLINPYTGGTRYNQNFKDKAT LTVDTSSTTAYMELLSLTSDDSAVYFCARffDYRYDGGAMDYffGQGTSVTVSS(SEQ ID NO. :2)
[0228] PGC3D6H10單克隆抗體的VL核苷酸序列：
[0229] GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATAC AGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAG ACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACT TCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGGGAGCTTACACGT TCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTG(SEQ ID NO. :3)
[0230] PGC3D6H10單克隆抗體的VL編碼氨基酸序列：
[0231] DIVLTQSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSffKNGLMLHQL(SEQ ID NO. :4)
[0232] 表6PGC3D6H10單克隆抗體的的重鏈可變區(qū)
[0233]
[0234] 表7PGC3D6H10單克隆抗體輕鏈可變區(qū)[0235]
[0236]
[0237] 本發(fā)明提及的所有文獻^在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種抗體的重鏈可變區(qū)，其特征在于，所述的重鏈可變區(qū)包括以下三個互補決定區(qū) CDR ： SEQ ID N0:5 所示的 CDR1， SEQ ID N0:6 所示的 CDR2,和 SEQ ID N0:7 所示的 CDR3。2. -種抗體的重鏈，其特征在于，所述的重鏈具有權(quán)利要求1所述的重鏈可變區(qū)和重 鏈恒定區(qū)。3. -種抗體的輕鏈可變區(qū)，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)具有選自下組的互補決定區(qū) CDR ： SEQ ID N0:11 所示的 CDR1'， SEQ ID NO: 12 所示的 CDR2'，和 SEQ ID NO: 13 所示的 CDR3'。4. 一種抗體的輕鏈，其特征在于，所述的輕鏈具有權(quán)利要求3所述的輕鏈可變區(qū)和輕 鏈恒定區(qū)。5. -種抗體，其特征在于，所述抗體具有： (1) 如權(quán)利要求1所述的重鏈可變區(qū)；和/或 (2) 如權(quán)利要求3所述的輕鏈可變區(qū)； 優(yōu)選地，所述抗體具有：如權(quán)利要求2所述的重鏈；和/或如權(quán)利要求4所述的輕鏈。6. -種重組蛋白，其特征在于，所述的重組蛋白具有： (i) 如權(quán)利要求1所述的重鏈可變區(qū)的序列、如權(quán)利要求2所述的重鏈的序列、如權(quán)利 要求3所述的輕鏈可變區(qū)的序列、如權(quán)利要求4所述的輕鏈的序列、或如權(quán)利要求5所述的 抗體的序列；以及 (ii) 任選的協(xié)助表達和/或純化的標(biāo)簽序列。7. -種多核苷酸，其特征在于，它編碼選自下組的多肽： (1) 如權(quán)利要求1所述的重鏈可變區(qū)、如權(quán)利要求2所述的重鏈、如權(quán)利要求3所述的 輕鏈可變區(qū)、如權(quán)利要求4所述的輕鏈、或如權(quán)利要求5所述的抗體；或 (2) 如權(quán)利要求6所述的重組蛋白。8. -種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求7所述的多核苷酸。9. 一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求8所述的載體或基因組 中整合有權(quán)利要求7所述的多核苷酸。10. -種免疫偶聯(lián)物，其特征在于，該免疫偶聯(lián)物含有： (a) 如本發(fā)明第一方面所述的重鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第二方面所述的重鏈、如本發(fā)明第 三方面所述的輕鏈可變區(qū)、如本發(fā)明第四方面所述的輕鏈、如本發(fā)明第五方面所述的抗體、 或如本發(fā)明第六方面所述的重組蛋白；和 (b) 選自下組的偶聯(lián)部分：可檢測標(biāo)記物、藥物、毒素、細胞因子、放射性核素、或酶。11. 一種藥物組合物，其特征在于，它含有： (i)如權(quán)利要求1所述的重鏈可變區(qū)、如權(quán)利要求2所述的重鏈、如權(quán)利要求3所述的 輕鏈可變區(qū)、如權(quán)利要求4所述的輕鏈、如權(quán)利要求5所述的抗體、如權(quán)利要求6所述的重 組蛋白、或如權(quán)利要求10所述的免疫偶聯(lián)物；以及 (ii)藥學(xué)上可接受的載體。12. 如權(quán)利要求1所述的重鏈可變區(qū)、如權(quán)利要求2所述的重鏈、如權(quán)利要求3所述 的輕鏈可變區(qū)、如權(quán)利要求4所述的輕鏈、如權(quán)利要求5所述的抗體、如權(quán)利要求6所述的 重組蛋白、或如權(quán)利要求10所述的免疫偶聯(lián)物的用途，用于制備藥劑、試劑、檢測板或試劑 盒； 所述試劑、檢測板或試劑盒用于：檢測樣品中CD19蛋白； 所述藥劑用于治療或預(yù)防表達CD19蛋白的腫瘤。13. -種重組多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含： (a) 在適合表達的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求9所述的宿主細胞； (b) 從培養(yǎng)物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是權(quán)利要求5所述的抗體或權(quán)利要 求6所述的重組蛋白。
【文檔編號】A61P35/00GK105837689SQ201510016959
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月13日
【發(fā)明人】楊林, 陳丹, 鄒建炫
【申請人】博生吉醫(yī)藥科技(蘇州)有限公司