一種bmp-3蛋白及其作為骨修復(fù)注射劑的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種BMP?3的提取及含BMP?3的注射劑的制備方法。通過提取部分純化的BMP?3與膠原蛋白及PEG 2000，泊洛沙姆和PVP制得注射劑。本發(fā)明提供了一種以天然提取、部分純化的BMP為基礎(chǔ)并具有緩釋作用的最佳載體的注射劑及制備方法，通過優(yōu)化提取過程中的工藝條件，獲得的BMP純度高、活性高、利用率高，并優(yōu)化注射劑載體組分及比例，制得的骨修復(fù)注射劑具有需用量少、效果顯著、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種BMP-3蛋白及其作為骨修復(fù)注射劑的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種醫(yī)用材料及其制備方法，具體講涉及一種BMP-3蛋白及其骨修復(fù)注射劑的制備方法及應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]骨形態(tài)發(fā)生蛋白即Bone Morphogenetic Protein，縮寫為BMP，是一種對(duì)骨生長和修復(fù)具有明顯生物活性的細(xì)胞因子，具有突出的誘導(dǎo)成骨活性，因而在基礎(chǔ)及臨床應(yīng)用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)二十種BMP，對(duì)其中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bonemorphogenetic protein-2，BMP_2)的研究較多c^BMP-2可從動(dòng)物組織內(nèi)提純，也可用基因工程構(gòu)建重組細(xì)胞表達(dá)合成。1979年Urist領(lǐng)導(dǎo)的科研小組率先從兔脫鈣骨中成功地分離純化了兔的BMP-2，于1982年從牛骨中提取出牛骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bBMP)，并在1987年建立了一套從人及牛骨中提取BMP的標(biāo)準(zhǔn)流程。
[0003]經(jīng)皮注射的骨生長因子，可直接將高效的骨誘導(dǎo)劑輸送至骨折、骨缺損及骨不連接部位，具有創(chuàng)傷小，適應(yīng)癥廣等優(yōu)點(diǎn)。針對(duì)臨床中大段粉碎性骨折患者，在閉合復(fù)位后向骨折部位注入骨生長因子能夠大大提高骨折愈合率;而對(duì)于骨不連患者，在內(nèi)固定或外固定完善的情況下，采取局部注射骨生長因子，可進(jìn)一步擴(kuò)大了非手術(shù)治療的適應(yīng)范圍。如王登虎在《注射型BMP的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究及初步臨床應(yīng)用研究》一文中將bBMP、bFGF與PVP復(fù)合在一起，制成注射型BMP(IBMP)用于治療骨折延遲連接、不連接及骨缺損。將BMP與具有熱力學(xué)可逆性的泊洛沙姆(poloxamer)結(jié)合，在溫度較低時(shí)，泊洛沙姆能溶于水形成溶膠，在體內(nèi)由于溫度較高，能夠形成粘性凝膠，有利于BMP和生長因子的緩慢釋放，提高了骨的誘導(dǎo)能力。但BMP在骨中含量少，且提取量有限，使用高純化的BMP又易被組織吸收，難以發(fā)揮作用。因此，應(yīng)用時(shí)必須同時(shí)考慮BMP和搭配載體的問題?，F(xiàn)有技術(shù)中常用的載體有脫鈣骨基質(zhì)(DBM)、多空磷酸鈣(TCP)、羥基磷灰石(HA)、生物活性玻璃陶瓷及纖維蛋白等，但是這些載體都或多或少地存在這樣或那樣的問題。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004]為克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明提供了一種以天然提取、部分純化的BMP為基礎(chǔ)并搭配有最佳載體的具有緩釋作用的最佳載體的注射劑及其制備方法，通過優(yōu)化提取過程中的工藝條件，獲得的BMP純度高、活性高、利用率高，并優(yōu)化注射劑載體組分及比例，制得的骨修復(fù)注射劑具有需用量少、效果顯著、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明提供了一種BMP-3的提取方法，包括下述步驟:
[0007]I)粗提:
[0008]將粉碎后的小牛腿皮質(zhì)骨依次經(jīng)1:1氯仿/甲醇處理10-15h，3_10%的H2O2處理10-15h，于室溫下用0.6mol/L的HCl處理3-6min，將離心得到的分離液于37 °C下調(diào)pH至7.2并加入其總重0.0006%的膠原酶浸提24h，減壓濃縮后溶于終濃度為6mol/L脲/0.5mol/L CaCl2中提取24h，分離液經(jīng)截留分子量為70KD的微孔濾膜過濾，透析、離心后得粗制BMP，將其復(fù)溶于4mol/L鹽酸胍/0.5mol/L CaCl2中，濾液再經(jīng)透析，離心得BMP粗品；
[0009]2)純化:
[0010]a)取160mg BMP粗品，復(fù)溶于1ml的Buffer A中，20，000g下離心30min，取上清液對(duì)160mm X 1mm的肝素親和層析柱加樣；
[0011]所述BufferA的組成為6mol/L脈/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaCl ,pH 7.0；
[0012]b)層析柱以120cm/h的速度依次用以下三種緩沖液洗脫處理:Buffer A、含有
0.15mol/L NaCl的Buffer A的Buffer B和含有0.5mol/L NaCl的Buffer A的Buffer C分別洗脫，收集Buffer C洗脫下來的蛋白質(zhì)，獲得BMP-3。
[0013]還提供了一種含有本發(fā)明提取獲得的BMP-3的骨修復(fù)注射劑，由BMP-3、膠原蛋白、磷脂及助劑組成，其中骨修復(fù)注射劑中BMP-3的濃度為1.0-2.0mg/ml，膠原蛋白的質(zhì)量百分濃度為2-5 %，磷脂的濃度為0.5-1.5mg/ml，余量為助劑。
[0014]本發(fā)明提供的骨修復(fù)注射劑中助劑包括PEG、泊洛沙姆或PVP。
[0015]泊洛沙姆(poloxamer)是聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物的非專利名，其商品名為普朗尼克(Pluronic)。
[0016]本發(fā)明提供的骨修復(fù)注射劑中PEG的質(zhì)量百分濃度為15%。
[0017]本發(fā)明提供的骨修復(fù)注射劑中泊洛沙姆的質(zhì)量百分濃度為15.25%。
[0018]本發(fā)明提供的骨修復(fù)注射劑中PVP的質(zhì)量百分濃度為15%。
[0019]本發(fā)明提供的骨修復(fù)注射劑中PEG為PEG 2000，泊洛沙姆為po1xamer 124、poloxamer 188、poloxamer 237、poloxamer 338或poloxamer 407。
[0020]本發(fā)明還提供了一種制備骨修復(fù)注射劑的制備方法，在無熱原水中依次加入BMP-
3、膠原蛋白后勻漿、過濾并洗脫，在洗脫液中加入磷脂及助劑，混勻后加入裝入安剖瓶內(nèi)，凍干后，得到骨修復(fù)注射劑。
[0021]本發(fā)明提供的骨修復(fù)注射劑的制備方法中，勻漿后，加入質(zhì)量百分濃度為10%的戊二醛溶液，于室溫下攪拌2-4h后，過截留分子量為10，000Da的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上BMP-3與交聯(lián)物用無熱原水沖洗得洗脫液。
[0022]與最接近的現(xiàn)有技術(shù)比，本發(fā)明提供的制備工藝條件優(yōu)化，提取的BMP純度高、活性高、利用率高;優(yōu)化骨修復(fù)注射劑的組分及比例，選擇最適載體制得的骨修復(fù)注射劑需用量少、效果顯著、使用方便。
[0023]下面，通過本發(fā)明提供的制備工藝結(jié)合實(shí)際操作，做進(jìn)一步說明:
[0024]提取BMP-3:
[0025]選取新鮮小牛四肢骨，將牛腿皮質(zhì)骨用液氮遇冷后粉碎制成骨粉，依次經(jīng)1:1氯仿/甲醇處理12h，10%過氧化氫氧化處理12h，于室溫下0.6mol/L鹽酸處理5min，離心得到分離液調(diào)節(jié)PH 7.2，加入其總重0.0006%的膠原酶于37°C無菌條件下浸提24h后得到的液體于室溫減壓濃縮后溶于提取液使其終濃度為6mol/L脲/0.5mol/L CaCl2,提取24h，濾液經(jīng)截流分子量為70KD的微孔濾膜過濾，濾液經(jīng)透析、離心后得到粗制BMP，將其溶于純化液(4mol/L鹽酸胍/0.5mol/L CaCl2)中，上清液再經(jīng)透析、離心后得到BMP粗品。取160mg BMP粗品復(fù)溶于1mL的平衡緩沖液中(Buffer A:6mol/L脲/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/LNaCl，pH 7.0)，以20000g的速度離心30min，除去其中不溶物，取濾液用160_X 10mm的肝素親和層析柱加樣。層析柱以120cm/h的速度分別按次序用以下三種緩沖液洗脫處理，SPBuffer A溶液，Buffer B液(含有0.15mol/L NaCl的Buffer A)及用Buffer C液洗脫(含有
0.5mol/L NaCl的Buffer A)，分別收集洗脫下來的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析、離心、凍干后保存，測(cè)質(zhì)量。
[0026]蛋白相對(duì)分子量的測(cè)定:
[0027]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將純化后的蛋白質(zhì)溶于含有二硫蘇糖醇(DTT)或不含有DTT的樣品緩沖液中，90 °C加熱4min，離心后用上清液加樣。電泳凝膠為50ml/L的積層膠、125ml/L的分離膠。電泳完畢后，用考馬斯亮藍(lán)R 250染色，再測(cè)其相對(duì)分子量。
[0028]將部分純化的蛋白質(zhì)加人層析柱后，洗脫液以120cm/h的速度洗脫。用BufferA洗脫時(shí)，未吸附的蛋白質(zhì)基本都流出；改用Buffer B液(含有0.15mol/L NaCl)，洗脫吸附較弱的蛋白，PH值下降，離子濃度增加，且有較大量的雜蛋白流出，稱為B峰；用含有0.5mol/LNaCl的Buffer C液洗脫時(shí)，獲得C峰，此峰為我們主要收集的目的蛋白。A段蛋白與肝素親和層析無親和力，故棄去不用，將B峰、C峰收集的蛋白對(duì)四蒸水進(jìn)行透析約24h，其間換液3次。透析發(fā)現(xiàn)，C峰蛋白有白色絮狀沉積，表明不溶于水;而B峰蛋白透析液仍澄清透明，均溶于水。將C峰蛋白真空凍干后，測(cè)其質(zhì)量為8.23mg，純化近20倍。
[0029]純化后BMP電泳結(jié)果如圖2所示，純化后的蛋白成份較為單一，純度較高，蛋白Mr約為35X 103(圖2B)，經(jīng)還原處理后，蛋白Mr變?yōu)?2父103，也為單一的一條帶(圖20。
[0030]對(duì)蛋白進(jìn)行成分分析，已經(jīng)確認(rèn)是一種酸性混合蛋白，等電點(diǎn)為4左右，蛋白相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定:采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，它多用于蛋白質(zhì)及核酸的測(cè)定。將純化后的蛋白質(zhì)溶于含有二硫蘇糖醇(DTT)或不含有DTT的樣品緩沖液中，90 °C加熱3-5min，離心后用上清加樣.電泳凝膠為50mL/L的積層膠、125mL/L的分離膠。電泳完畢后，用考馬斯亮藍(lán)R250染色，再測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量。對(duì)含BMP的提取物進(jìn)行SDS凝膠電泳分析，其分子量從14X 13到44X 103。其中肝素親和層析純化及SDS凝膠電泳揭示的35X 13的電泳帶。依靠離子間作用力洗脫，經(jīng)洗脫得到3個(gè)峰，一個(gè)峰是分子量35 X 103，一個(gè)峰是水溶性的蛋白，一個(gè)峰被稱為非35X 13蛋白。該蛋白提取物活性物質(zhì)由3個(gè)部分組成；
[0031](I)被鑒別出的35X 103蛋白BMP-3
[0032](2)—種水溶性的蛋白系被降解的膠原蛋白。
[0033](3)非35 X 13蛋白，系幾種蛋白的混合物。
[0034]其中有大于14X 13至小于22X 13的蛋白。這些蛋白是BMP的單鏈，30X 13蛋白是BMP-2o
[0035]B峰蛋白透析液澄清透明，溶于水，系被降解的膠原蛋白。C峰四蒸水進(jìn)行透析液，呈白色絮狀沉積，蛋白Mr約為35 X 103，經(jīng)還原處理后，蛋白Mr變?yōu)?2 X 103，為單一的一條帶。按肝素親和層析純化及SDS凝膠電泳分析，蛋白提取物中骨形態(tài)發(fā)生蛋白為BMP-3。該30mg部分純化的BMP蛋白中含有BMP-3 1.5mg，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有1.5mg骨修復(fù)蛋白BMP-3。
[0036]制備骨修復(fù)注射劑:
[0037]1.取BMP-3的蛋白加入無熱原水，使BMP-3蛋白濃度為1.0mg_2.0mg/ml，其膠原蛋白的重量濃度為2-5%即20mg-50mg/ml，勾楽，加入終濃度為15.25%的poloxamer 407混合，罐裝于2ml安剖瓶內(nèi)，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有1.5mg骨修復(fù)蛋白BMP-3。經(jīng)冷凍干燥后得成品。
[0038]2.取含有BMP-3蛋白加入無熱原水，使的BMP-3蛋白濃度為1.0mg-2.0mg/ml，其膠原的重量濃度為2-5 %，勻漿，加入終濃度為15 %的PEG 2000混合，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有骨修復(fù)蛋白BMP-3 1.5mg。罐裝于2ml安剖瓶內(nèi)，冷凍干燥后得成品。
[0039]3.取含有BMP-3蛋白加入無熱原水1ml，使BMP-3蛋白濃度為1.0mg-2.0mg/ml，其膠原的重量濃度為2-5 %，勻漿，加入1 %的戊二醛溶液5ml混合，攪拌3h后，過截留分子量為10，000Da的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上的BMP-3蛋白與膠原的交聯(lián)物用無熱原水洗下來，加入終濃度為15 %的PEG 2000混合，罐裝于4支2ml安剖瓶內(nèi)，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有骨修復(fù)蛋白BMP-3 1.5mg。冷凍干燥后得成品。
[0040]4.取含有BMP-3蛋白加入無熱原水1ml，使BMP-3蛋白濃度為1.0mg-2.0mg/ml，其膠原的重量濃度為2-5%，勻漿，加入10%濃度的戊二醛溶液5ml混合，攪拌3小時(shí)后，過截留分子量為10，000Da的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上的BMP-3蛋白與膠原的交聯(lián)物用無熱原水洗下來，加入終濃度為15.25 %的poloxamer 407混合后，分別罐裝于4支2ml安剖瓶內(nèi)，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有骨修復(fù)蛋白BMP-3 1.5mg。凍干得成品。
[0041 ] 5.取BMP-3蛋白加入無熱原水1ml，使BMP-3蛋白濃度為1.5mg/ml，其膠原的重量濃度為3 %，勻漿，加入10%濃度的戊二醛溶液5ml混合，攪拌3小時(shí)后，過截留分子量為10，OOODa的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上的BMP-3蛋白與膠原的交聯(lián)物用無熱原水洗下來，加入終濃度為15 %的PVP混合，冷凍干燥后裝入4支2ml安剖瓶里，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有骨修復(fù)蛋白BMP-3 1.5mg得成品。
[0042]6.取含有BMP-3蛋白加入無熱原水10ml，使BMP-3蛋白濃度為1.00mg/ml，其膠原的重量濃度為2%，加入注射劑用磷脂10mg勻漿，加入終濃度在15%PVP混合，罐裝于4支2ml安剖瓶內(nèi)，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有骨修復(fù)蛋白BMP-3 1.5mg冷凍干燥后得成品。
[0043]7.取BMP-3蛋白加入無熱原水，使BMP-3蛋白濃度為2.0mg/ml，其膠原的重量濃度為5 %，加入注射劑用磷脂10mg，勻漿，加入終濃度為15.25 %的poloxamer 407混合，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有骨修復(fù)蛋白BMP-3 1.5mg，冷凍干燥后得成品。
[0044]8.取BMP-3蛋白加入無熱原水，使BMP-3蛋白濃度為1.0mg_2.0mg/ml，其膠原的重量濃度為2-5 %，加入注射劑用磷脂10mg，勻漿，加入終濃度在15%的PEG 2000，混合，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有骨修復(fù)蛋白BMP-3 1.5mg，冷凍干燥后得成品。
【【附圖說明】】
[0045]圖1為BMP的Heparin Sepharose C1-6B層析圖；
[0046]圖2為純化后BMP的電泳結(jié)果。
【【具體實(shí)施方式】】
[0047]實(shí)施例1提取活性蛋白BMP-3:
[0048]選取新鮮小牛四肢骨，將牛的腿皮質(zhì)骨用液氮遇冷后粉碎骨干制成骨粉，經(jīng)1:1氯仿/甲醇處理12h，10%過氧化氫氧化處理12h，室溫下0.6mol/L鹽酸處理5min，離心后得到的分離液調(diào)節(jié)PH 7.2，加入0.0006%膠原酶于37°(:無菌條件下浸提24h后得到的液體于室溫減壓濃縮后溶于提取液使其終濃度6mol/L脲/0.5mol/L CaCl2,提取24h，濾液經(jīng)截流分子量為70KD的微孔濾膜過濾得濾液，經(jīng)透析、離心后得到粗制BMP，將其復(fù)溶于純化液(4mol/L鹽酸胍/0.5mol/L CaCl2)，上清再經(jīng)透析、離心后得到了部分純化的BMP。取160mg部分純化的BMP蛋白復(fù)溶于1ml的平衡緩沖液中(Buffer A:6mol/L脲/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaClpH 7.0)，以20000g的速度離心30min，除去其中不溶的物質(zhì)。用上清對(duì)160mmX 1mm的肝素親和層析柱加樣。層析柱分別按次序用以下三種緩沖液洗脫，即含有
0.1，0.15，0.5mol/L NaCl 的 Buffer A 溶液，Buffer B液(含有 0.15mol/L NaCl)及用含有
0.5mol/L NaCl的Buffer C液洗脫，B峰蛋白透析液澄清透明，溶于水，系被降解的膠原蛋白。C峰四蒸水進(jìn)行透析液，呈白色絮狀沉積，蛋白Mr約為35 X 103，經(jīng)還原處理后，蛋白Mr變?yōu)?2X 103，為單一的一條帶。按肝素親和層析純化及SDS凝膠電泳分析，蛋白提取物中骨形態(tài)發(fā)生蛋白為BMP-3。該30mg部分純化的BMP蛋白中含有BMP-3 1.5mg，每份供注射用骨修復(fù)劑中含有1.5mg骨修復(fù)蛋白BMP-3。
[0049]實(shí)施例2
[0050]取BMP-3的蛋白加入無熱原水，使BMP-3蛋白濃度為2.0mg/ml，其膠原的重量濃度為4%即40mg/ml，勻漿，加入終濃度為15.25%的poloxamer 407混合，經(jīng)冷凍干燥后得成品。實(shí)施例3
[0051 ] 取含有BMP-3蛋白加入無熱原水，使的BMP-3蛋白濃度為1.0mg/ml，其膠原的重量濃度為3%，勻漿，加入終濃度為15%的PEG 2000混合，冷凍干燥后得成品。
[0052]實(shí)施例4
[0053]取含有BMP-3蛋白加入無熱原水10ml，使BMP-3蛋白濃度為1.5mg/ml，其膠原的重量濃度為2.5%，勻漿，加入10%的戊二醛溶液5ml混合，攪拌3小時(shí)后，過截留10，OOODa的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上的BMP-3蛋白與膠原的交聯(lián)物用無熱原水洗下來，加入終濃度為15%的PEG 2000混合，冷凍干燥后得成品。
[0054]實(shí)施例5
[0055]取含有BMP-3蛋白加入無熱原水1ml，使BMP-3蛋白濃度為2mg/ml，其膠原的重量濃度為3.5%，勾漿，加入10%濃度的戊二醛溶液5ml混合，攪拌3小時(shí)后，過截留10，OOODa的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上的BMP-3蛋白與膠原的交聯(lián)物用無熱原水洗下來，加入終濃度為15.25%的poloxamer 407混合后，冷凍干燥。
[0056]實(shí)施例6
[0057]取BMP-3蛋白加入無熱原水10ml，使BMP-3蛋白濃度為1.0mg/ml，其膠原的重量濃度為4.5%，勾漿，加入10%濃度的戊二醛溶液5ml混合，攪拌3小時(shí)后，過截留10，000道爾頓的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上的BMP-3蛋白與膠原的交聯(lián)物用無熱原水洗下來，加入終濃度為15 %的PVP混合，冷凍干燥得成品。
[0058]實(shí)施例7
[0059]取含有BMP-3蛋白加入無熱原水10ml，使BMP-3蛋白濃度為1.5mg/ml，其膠原的重量濃度為2.5%,加入注射劑用磷脂I OOmg勻漿，加入終濃度在15 % PVP混合，冷凍干燥后得成品。
[0060]實(shí)施例8
[0061 ] 取BMP-3蛋白加入無熱原水，使BMP-3蛋白濃度為1.5mg/ml，其膠原的重量濃度為2-5%，加入注射劑用磷脂10mg，勻漿，加入終濃度為15.25%的poloxamer 407混合，冷凍干燥后得成品。
[0062]實(shí)施例9
[0063]取BMP-3蛋白加入無熱原水，使BMP-3蛋白濃度為1.5mg/ml，其膠原的重量濃度為3 %，加入注射劑用磷脂10mg，勻漿，加入終濃度在15 %的PEG 2000混合，冷凍干燥后得成品。實(shí)施例10提取BMP-3
[0064]將牛的腿皮質(zhì)骨5kg，將牛的腿皮質(zhì)骨用液氮遇冷后粉碎骨干制成骨粉，經(jīng)1:1氯仿/甲醇處理12h，10%過氧化氫氧化處理12h，室溫下0.6mol/L鹽酸處理5min，離心后得到的骨粉調(diào)節(jié)PH 7.2加入0.0006%膠原酶于37°C無菌條件下浸提24h后的液體于室溫減壓濃縮將其連同骨粒形成的骨基質(zhì)明膠溶于提取液使終濃度6mol/L脲/0.5mol/L CaCl提取24h，上清液經(jīng)截流分子量70KD的微孔濾膜過濾得濾液，經(jīng)透析、離心后得到粗制BMP，將其復(fù)溶于純化液(4mol/L鹽酸胍/0.5mol/L CaCl)，上清再經(jīng)透析、離心后得到了部分純化的BMP。
[0065]取160mg部分純化的BMP蛋白復(fù)溶于1ml的平衡緩沖液中(Buffer A:6mol/L脲/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaCl pH 7.0)，以20，000g的速度離心30min，除去其中不溶的物質(zhì)。用上清對(duì)160mmX 1mm的肝素親和層析柱加樣。層析柱分別按次序用以下三種緩沖液洗脫，即含有0.1，0.15，0.5mol/L NaCI的Buffer A溶液，Buffer B液(含有0.15mol/LNaCl)及用含有0.5mol/L NaCl的Buff er C液洗脫，B峰蛋白透析液澄清透明，溶于水，系被降解的膠原蛋白。C峰四蒸水進(jìn)行透析液，呈白色絮狀沉積，蛋白Mr約為35X 103，經(jīng)還原處理后，蛋白Mr變?yōu)?2X 103，為單一的一條帶。按肝素親和層析純化及SDS凝膠電泳分析，蛋白提取物中骨形態(tài)發(fā)生蛋白為BMP-3。該30mg部分純化的BMP蛋白中含有BMP-3 1.5mg。
[0066]以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種BMP-3的提取方法，包括下述步驟: 1)粗提: 將粉碎后的小牛腿皮質(zhì)骨依次經(jīng)1:1氯仿/甲醇處理10-15h，3-10%的H2O2處理10-15h，于室溫下用0.6mol/L的HCl處理3-6min，將離心得到的分離液于37°C下調(diào)pH至7.2并加入其總重0.0006%的膠原酶浸提2411，減壓濃縮后溶于終濃度為611101/1脲/0.511101/1 CaCl2中提取24h，分離液經(jīng)截留分子量為70KD的微孔濾膜過濾，經(jīng)透析、離心后得粗制BMP，將其復(fù)溶于4mol/L鹽酸胍/0.5mol/L CaCh中，濾液再經(jīng)透析，離心得BMP粗品； 2)純化: a)取160mgBMP粗品，溶于1ml的Buffer A中，20，000g下離心30min，取上清液對(duì)160mmX 1mm的肝素親和層析柱加樣； 所述Buffer A的組成為6mol/L脈/50mmol/L Tris.HC1/0.lmol/L NaCl ,pH 7.0； b)層析柱以120cm/h的速度依次用以下三種緩沖液處理:BufferA、含有0.15mol/LNaCl的Buffer A的Buffer B和含有0.5mol/L NaCl的Buffer A的Buffer C分別洗脫，收集Buffer C洗脫下來的蛋白質(zhì)，獲得所述BMP-3。2.一種含有如權(quán)利要求1所述提取方法獲得的BMP-3的骨修復(fù)注射劑，由BMP-3、膠原蛋白、磷脂及助劑組成，其特征在于:骨修復(fù)注射劑中所述BMP-3的濃度為1.0-2.0mg/ml，膠原蛋白的質(zhì)量百分濃度為2-5 %，磷脂的濃度為0.5-1.5mg/ml，余量為助劑。3.如權(quán)利要求2所述的骨修復(fù)注射劑，其特征在于所述助劑包括PEG、泊洛沙姆或PVP。4.如權(quán)利要求3所述的骨修復(fù)注射劑，其特征在于所述PEG的質(zhì)量百分濃度為15%。5.如權(quán)利要求4所述的骨修復(fù)注射劑，其特征在于所述PEG為PEG2000。6.如權(quán)利要求3所述的骨修復(fù)注射劑，其特征在于所述泊洛沙姆的質(zhì)量百分濃度為15.25%。7.如權(quán)利要求6所述的骨修復(fù)注射劑，其特征在于所述泊洛沙姆為po1xamer124、poloxamer 188、poloxamer 237、poloxamer 338或poloxamer 407。8.如權(quán)利要求3所述的骨修復(fù)注射劑，其特征在于所述PVP的質(zhì)量百分濃度為15%。9.一種如權(quán)利要求2所述的骨修復(fù)注射劑的制備方法，其特征在于:在無熱原水中依次加入BMP-3和膠原蛋白后勻漿，過濾并洗脫，在洗脫液中加入磷脂及助劑，混勻后加入裝入安It1J瓶內(nèi)，凍干后，得所述骨修復(fù)注射劑。10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于:勻漿后，加入質(zhì)量百分濃度為10%的戊二醛溶液，于室溫下攪拌2-4h后，過截留分子量為10，000Da的微孔濾膜，將留在微孔濾膜上BMP-3與交聯(lián)物用無熱原水沖洗得所述洗脫液。
【文檔編號(hào)】C07K1/34GK105837682SQ201610183898
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年3月28日
【發(fā)明人】宋富智, 梁世昌, 宋德順
【申請(qǐng)人】天津中津生物發(fā)展有限公司