一種轉(zhuǎn)移因子的制備方法及其注射劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體地指一種轉(zhuǎn)移因子的制備方法及其注射劑的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 轉(zhuǎn)移因子Transfer Factor (TF)，又稱傳輸因子，由具有細(xì)胞性免疫功能的淋巴細(xì) 胞產(chǎn)生，通過從凍融致敏的T細(xì)胞獲得的一種可透析的因子。能加強(qiáng)動(dòng)物的免疫力，可以將 延遲過敏反應(yīng)能力從一個(gè)個(gè)體（包括人和動(dòng)物）轉(zhuǎn)移到另一個(gè)體，它們運(yùn)送父淋巴細(xì)胞的 抗原特異細(xì)胞性免疫（遲發(fā)性過敏反應(yīng)）到未暴露或原生的淋巴細(xì)胞。轉(zhuǎn)移因子攜帶有致 敏淋巴細(xì)胞的特異性免疫信息，能夠?qū)⑻禺愋悦庖咝畔⑦f呈給受體淋巴細(xì)胞，使受體無活 性的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樘禺愋灾旅袅馨图?xì)胞，從而激發(fā)受體細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。轉(zhuǎn)移因子 具有廣泛的免疫學(xué)調(diào)節(jié)活性，一方面可誘導(dǎo)免疫細(xì)胞活化，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫能力。另 一方面能夠?qū)⑻禺愋悦庖吣芰鬟f到其他動(dòng)物，激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫。
[0003] 由于其特定的作用，轉(zhuǎn)移因子臨床用于治療某些抗生素難以控制的病毒性或霉菌 性細(xì)胞內(nèi)感染（如帶狀皰瘆，流行性乙型腦炎，白色念珠菌感染，病毒性心肌炎等）；對(duì)惡 性腫瘤可作為輔助治療劑（主要用于肺癌，鼻咽癌，乳腺癌，骨肉瘤等）；免疫缺陷?。ㄈ鐫?瘆，血小板減少，多次感染綜合癥及慢性皮膚粘膜真菌病有較好的療效）。目前，已公開的 關(guān)于轉(zhuǎn)移因子注射劑的制備工藝中，通常包括以下方法：（1)用絞肉機(jī)或勻漿器將豬脾（牛 脾）勻漿，凍融，或超聲以破碎細(xì)胞；（2)離心；（3)離心液經(jīng)10000分子量左右的超濾膜超 濾的轉(zhuǎn)移因子；(4)根據(jù)轉(zhuǎn)移因子的含量加注射用水配制注射制劑。
[0004] 中國(guó)專利申請(qǐng)"一種從牛脾臟中提取轉(zhuǎn)移因子的方法"（專利【申請(qǐng)?zhí)枴?200810154335. 3)公開生產(chǎn)方法：將冷凍牛脾臟破碎、絮凝、透析、過濾除菌，制成含有轉(zhuǎn)移 因子的原液；"一種豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的制備方法"（專利【申請(qǐng)?zhí)枴?01310136476. 3)公 開豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液的制備方法：將檢驗(yàn)合格后的豬脾臟進(jìn)行清洗、勻漿、甲醛滅活、凍 融破碎，經(jīng)過濾、超濾后獲得原液，加入注射用水得到注射液；"一種豬脾轉(zhuǎn)移因子注射液 的生產(chǎn)方法"（專利【申請(qǐng)?zhí)枴?01110126248.9)中使用勻漿、低溫超聲破碎、離心、超濾工藝 提取轉(zhuǎn)移因子；"一種轉(zhuǎn)移因子溶液及其制備方法"（專利【申請(qǐng)?zhí)枴?01410306339.4)中將 豬脾進(jìn)行清洗、勻漿、反復(fù)凍融、調(diào)節(jié)PH、過濾、超濾后得到轉(zhuǎn)移因子溶液；"一種轉(zhuǎn)移因子 的制備方法"（專利【申請(qǐng)?zhí)枴?01310640313.9)將新鮮雞脾進(jìn)行清洗、勻漿、凍融破碎，經(jīng) 離心加壓抽濾、超濾后獲得轉(zhuǎn)移因子溶液；"一種豬脾轉(zhuǎn)移因子制備方法"（專利【申請(qǐng)?zhí)枴?201310755932. 2)包括組織絞碎、均質(zhì)破碎、微濾、超濾等步驟，采用高壓均質(zhì)機(jī)快速破碎細(xì) 胞。
[0005] 上述的工藝方法僅用凍融后離心，一方面不能充分有效的去除各類雜蛋白，這樣 使得產(chǎn)品容易引起過敏反應(yīng)，不能有效去除各類動(dòng)物源性病毒，使制劑存在病毒污染和異 常毒性不合格的風(fēng)險(xiǎn)；另一方面就是現(xiàn)有的制備方法均使用微濾膜、超濾膜進(jìn)行過濾，濾膜 負(fù)荷大，壽命短，成本高，限制了醫(yī)學(xué)上的進(jìn)一步使用。滅活過程中采用加入甲醛或進(jìn)行升 溫處理，甲醛為致癌物，殘留的游離甲醛注入人體后產(chǎn)生制激性反應(yīng)；升溫則易使轉(zhuǎn)移因子 的活性降低而影響使用效果。注射液中氨基酸、小肽類物質(zhì)易發(fā)生聚合為大分子物質(zhì)而析 出致使制劑不穩(wěn)定，也易引起相關(guān)的副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的就是要解決上述【背景技術(shù)】的不足，提供一種轉(zhuǎn)移因子的制備方法及 其注射劑的制備方法，來減少轉(zhuǎn)移因子中的雜蛋白過敏源，有效去除各類動(dòng)物源性病毒及 延長(zhǎng)超濾膜的使用壽命。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種轉(zhuǎn)移因子的制備方法：
[0008] (1)預(yù)處理：將動(dòng)物脾臟剝離其附著脂肪，用水洗凈；
[0009] (2)勻漿：加入動(dòng)物脾臟重量1. 5~2倍的注射用水混合后，置于膠體磨內(nèi)反復(fù)絞 磨4~6次，制成勻漿，移入-16°C下存放3天以上；
[0010] (3)反復(fù)凍融：將勻漿反復(fù)凍融3~5次；
[0011] (4)離心：將勻漿化凍后離心，取勻漿上清液；
[0012] (5)乙醇沉淀：在不斷攪拌下將勻漿上清液按1 : 2的體積比加入無水乙醇，在 〇~5°C靜置12小時(shí)以上，離心取上清液減壓真空濃縮至原體積的1/5~1/10,回收乙醇；
[0013] (6) -次超濾：調(diào)節(jié)濃縮液pH值至6.0~7.0,分別經(jīng)50K分子量和IOk超濾膜超 濾后得轉(zhuǎn)移因子一次溶液；
[0014] (7)病毒滅活：在轉(zhuǎn)移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白質(zhì)量分 數(shù)為1~2%。，經(jīng)60°C保溫10小時(shí)后，迅速將溫度降至20°C以下；
[0015] (8)二次超濾：經(jīng)3K~5K分子量的超濾膜超濾后得轉(zhuǎn)移因子溶液。
[0016] 優(yōu)選的，所述反復(fù)凍融步驟中將已凝固的勻漿取出置于33~37°C水浴，不斷攪拌 使其快速融化，待勻漿全部融為液態(tài)時(shí)，再放入低溫冷凍，如此反復(fù)3~5次。
[0017] 優(yōu)選的，所述離心步驟中，將勻漿化凍后在4°C、轉(zhuǎn)速3000r/min下離心30分鐘，取 勻漿上清液。
[0018] 優(yōu)選的，所述乙醇沉淀步驟中無水乙醇與勻漿混合物在4°C、轉(zhuǎn)速3000r/min下離 心30分鐘。
[0019] 優(yōu)選的，所述乙醇沉淀步驟中減壓真空濃縮的真空度為-0. 03~-0. 08MPa。
[0020] 優(yōu)選的，所述動(dòng)物脾臟為豬脾或牛脾。
[0021] 本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)移因子注射劑的制備方法，步驟為：測(cè)定所述轉(zhuǎn)移因子溶液 內(nèi)多肽和核酸的含量，加入注射用水調(diào)節(jié)至每2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯 化鈉使溶液中氯化鈉的濃度為〇. 9g/ml，加入穩(wěn)定劑吐溫-80至溶液中的吐溫-80質(zhì)量濃度 為1~2%。，除菌過濾后無菌分裝即得轉(zhuǎn)移因子注射劑。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為：
[0023] 1.采用傳統(tǒng)工藝中均未使用的乙醇沉淀法去除各類雜蛋白，能有效保證產(chǎn)品的安 全性，減少過敏源，提高安全性；同時(shí)經(jīng)乙醇沉淀去除雜蛋白后可減少后續(xù)超濾膜超濾的負(fù) 荷，延長(zhǎng)超濾膜的使用壽命，降低成本，使其在生物上有進(jìn)一步的應(yīng)用。
[0024] 2.采用乙醇沉淀法去除雜蛋白，以及先后通過50KD、10KD，3~5KD超濾膜多級(jí)超 濾，既能保證雜蛋白的徹底去除，又能有效地控制高分子量物質(zhì)，制得產(chǎn)品高分子物質(zhì)少于 I. 0%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的少于5. 0%，能更有效地保證產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床安全性。
[0025] 3.制備方法中加入白蛋白保護(hù)劑后采用60°C，10小時(shí)能有效滅活病毒，再加上后 續(xù)的超濾工藝，能充分保證動(dòng)物源性病毒的滅活，保證制劑產(chǎn)品的安全性。同時(shí)白蛋白作為 保護(hù)劑，能保證在較高溫條件下轉(zhuǎn)移因子的活性不會(huì)降低。制得產(chǎn)品活力按T細(xì)胞活性測(cè) 定法一脫E受體法測(cè)定均不低于30 %，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的不低于10 %。
[0026] 4.將牛脾（或豬脾）勻漿液采用低溫反復(fù)凍融，能使細(xì)胞內(nèi)外的有效物質(zhì)充分釋 放，保證有效成分的充分提取。
[0027] 5.注射劑配料過程中加入吐溫-80作穩(wěn)定劑，能有效得避免制劑在儲(chǔ)存過程中有 機(jī)物類氨基酸、小肽、核苷酸、嘌呤等聚合為大分子物質(zhì)析出，影響制劑的澄明度，保證產(chǎn)品 長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存過程的穩(wěn)定，同時(shí)降低過敏反應(yīng)發(fā)生率。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 轉(zhuǎn)移因子的制備方法，包括如下步驟，
[0031] (1)預(yù)處理：將豬脾剝離其附著脂肪，用飲用水清洗2次，再用純化水清洗3次；
[0032] (2)勻漿：加入豬脾重量1. 5倍的注射用水混合后，置于膠體磨內(nèi)反復(fù)絞磨4次， 制成勻漿，移入-16°C下存放3天以上；
[0033] (3)反復(fù)凍融：將已凝固的勻漿取出放入33°C的水浴中，不斷攪拌使其快速融化， 待勻漿全部融為液態(tài)時(shí)，再放入低溫冷庫(kù)內(nèi)冷凍，如此反復(fù)3次；
[0034] (4)離心：將勻漿化凍后在4°C、轉(zhuǎn)速3000r/min下離心30分鐘，取勻漿上清液；
[0035] (5)乙醇沉淀：在不斷攪拌下將勻漿上清液按1 : 2的體積比加入無水乙醇，在 5°C靜置12小時(shí)以上，4°C、轉(zhuǎn)速3000r/min下離心30分鐘，取上清液在-0. 03MPa真空度下 減壓真空濃縮至原體積的1/5,回收乙醇；
[0036] (6) -次超濾：調(diào)節(jié)濃縮液pH值至6. 0,分別經(jīng)50K分子量和IOk超濾膜超濾后得 轉(zhuǎn)移因子一次溶液；
[0037] (7)病毒滅活：在轉(zhuǎn)移因子一次溶液中加入白蛋白至每毫升溶液中白蛋白質(zhì)量分 數(shù)為1%。，經(jīng)60°C保溫10小時(shí)后，迅速將溫度降至20°C以下；
[0038] (8)二次超濾：經(jīng)3K分子量的超濾膜超濾后得轉(zhuǎn)移因子溶液；
[0039] 將所得轉(zhuǎn)移因子溶液制備成轉(zhuǎn)移因子注射液。
[0040] 制備注射劑：測(cè)定轉(zhuǎn)移因子溶液中多肽和核酸的含量，加入注射用水調(diào)節(jié)至每 2ml溶液中含多肽3mg和核糖100 μ g，加入氯化鈉使溶液中氯化鈉的濃度為0. 9g/ml，加入 穩(wěn)定劑吐溫-80至溶液中的吐溫-80質(zhì)量濃度為1%。，除菌過濾后無菌分裝即得轉(zhuǎn)移因子注 射劑。
[0041] 實(shí)施例2
[0042] 轉(zhuǎn)移因子的制