一種經(jīng)改性的蛋白及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種經(jīng)改性的蛋白及其制備方法和應(yīng)用。具體地，所述經(jīng)改性的蛋白包括：可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有經(jīng)修飾的賴氨酸殘基和/或經(jīng)修飾的N端氨基。本發(fā)明還公開了所述經(jīng)改性的蛋白的制備方法和應(yīng)用。所述經(jīng)改性的蛋白具有更優(yōu)的親水/疏水結(jié)構(gòu)比例，進而能更有效地負(fù)載所述脂溶性活性成分，因此是一種負(fù)載性能優(yōu)異的脂溶性活性成分納米載體。所述經(jīng)改性的蛋白的制備方法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、工藝簡單、產(chǎn)物易分離、無有害化學(xué)物殘留、無安全問題等特點，可廣泛應(yīng)用于各種蛋白(特別是可食用蛋白)的改性中。
【專利說明】
一種經(jīng)改性的蛋白及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及食品和材料領(lǐng)域，具體地涉及一種經(jīng)改性的蛋白及其制備方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)化學(xué)改性主要是針對蛋白多肽中一些氨基、羥基、羧基以及巰基基團進行 化學(xué)改性反應(yīng)，包括酰化、脫酰胺、磷酸化、糖基化（即美拉德反應(yīng)）、共價交聯(lián)、水解及氧化 等反應(yīng)。目前針對化學(xué)改性后蛋白質(zhì)的研究主要集中在改性對蛋白理化和功能性的影響， 如溶解性、乳化性、吸水性、起泡性、熱穩(wěn)定性及凝膠性等。然而，改性對蛋白質(zhì)自組裝性能 以及用作載運體系中載體材料性質(zhì)的影響卻鮮有研究。此外，由于大多數(shù)化學(xué)合成方法可 能會對蛋白質(zhì)本身結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，且存在潛在的安全性問題。因此，經(jīng)改性的蛋白在諸多領(lǐng) 域，特別是食品領(lǐng)域中的應(yīng)用也存在一定限制。
[0003] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種反應(yīng)條件溫和、工藝簡單、無安全問題等特點的蛋 白化學(xué)改性方法，應(yīng)用于各種蛋白（特別是可食用蛋白）的改性中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種具有優(yōu)異自組裝性能和負(fù)載脂溶性活性成分性能的 經(jīng)改性的蛋白及其制備方法。
[0005] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種經(jīng)改性的蛋白或其鹽，所述經(jīng)改性的蛋白包括：
[0006] 可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有經(jīng)修飾的賴氨酸殘基和/或經(jīng) 修飾的N端氨基；
[0007] 其中所述的"經(jīng)修飾的"指賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε_氨基或所述蛋白的N端氨基NH2中的氫原子被非極性烷基鏈取代基修飾，所述非極性烷基鏈為直鏈或支鏈的C12-C30的烷 基。
[0008] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈共價輒合于所述賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε_氨基 和/或蛋白質(zhì)的Ν端的氨基。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的可食用蛋白為水溶性蛋白。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的水溶性蛋白指在25°C時，在水中的溶解度2 5000mg/L，優(yōu) 選為6000-10000mg/L。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白的分子量為75000-375000Da，較佳地為 15000-25000Da〇
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述可食用蛋白選自下組:酪蛋白、大豆蛋白、乳清蛋白、或其組 合。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述可食用蛋白的鹽選自下組:鈉鹽、鈣鹽、鉀鹽、或其組合。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，lmol所述可食用蛋白含有8_16mol賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基， 較佳地10-14mo 1，更佳地12.14mo 1。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈為直鏈或支鏈的C14-C26的烷基，較佳地為直 鏈或支鏈的C16-C22的烷基。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈為飽和的或不飽和的烷基，優(yōu)選為飽和的烷 基。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈中烷基為經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述取代指所述烷基中的氫原子被選自下組的基團取代:羥基、 CN、羧基、-NH2、或其組合。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白中，所述非極性烷基鏈的輒合度為5-15%，且 所述輒合度C的計算公式如下式F1或F2:
[0020] C=(Kl+Nl)/(Kaii+l) X100% (F1)
[0021] 式中，
[0022] K1為可食用蛋白中所述經(jīng)修飾的賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基的數(shù)目；
[0023] Ν1為可食用蛋白中所述經(jīng)修飾的Ν端氨基的數(shù)目；
[0024] Kaii為可食用蛋白中賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基的總數(shù)；
[0025] C = y/((Miysine+l) ·χ)Χ100% (F2)
[0026] 式中，y是輒合到可食用蛋白中非極性烷基鏈的摩爾數(shù)，Mlysine是每摩爾可食用蛋 白中賴氨酸殘基的摩爾數(shù)，X是經(jīng)改性的可食用蛋白的摩爾數(shù)。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白中，所述非極性烷基鏈的輒合度為5.5-13%， 較佳地為6-12 %，更佳地為6.5-10 %。
[0028] 亦另一優(yōu)詵例由.所怵經(jīng)改性的蛋白具有式I所示結(jié)構(gòu)：
[0029]
[0030] 式中，
[0031] R為非極性烷基鏈取代基
[0032] Pr為可食用蛋白；
[0033] 其中，一個Pr上可連接有一個或多個R-C0-NH-基團。
[0034]在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白的疏水性指數(shù)大于未經(jīng)改性的可食用蛋白的 疏水性指數(shù)。
[0035]在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白的疏水性指數(shù)為20-150,較佳地20-70,更佳 地為20-50。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述可食用蛋白（即未經(jīng)改性的可食用蛋白）的疏水性指數(shù)為 10-22〇
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述疏水性指數(shù)是采用ANS熒光檢測法測定得到。
[0038] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種納米粒子，所述納米粒子由本發(fā)明第一方面所述 的經(jīng)改性的蛋白或其鹽自組裝形成，且所述納米粒子中任選地包含裝載于其中的脂溶性活 性成分。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述脂溶性活性成分選自下組:黃酮類化合物、ω -3脂肪酸、植 物甾醇、或其組合。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述黃酮類化合物選自下組：姜黃素、橙皮苷、黃芩素、或其組 合。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子具有選自下組的一個或多個特征：
[0042] 1)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的水分散性好；
[0043] 2)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的粒徑為10-1000nm;
[0044] 3)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的多分散指數(shù)PDI < 0.25;
[0045] 4)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的ζ電位為-40mV~+40mV。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的"水分散性好"指將0.2-5g(較佳地0.5-3g)所述納米粒子 與100ml水混合，可形成溶液，且無肉眼可見的團聚物。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，按所述納米粒子的總重量計，所述脂溶性活性成分的裝載量為 l-10wt%，較佳地為2_8wt%，更佳地為3_6wt%。
[0048]在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子（或凍干再分散后的納米粒子）的粒徑為30- 800nm，較佳地為 50-600nm，更佳地為 100-500nm。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子）的多分散指數(shù)PDI < 0.4，較佳地< 0.3，更佳地< 0.2。
[0050]在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的ζ電位為_35mV~ +35mV〇
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物中被包載的脂溶性活性成分以無定形態(tài)分散在所述 載體材料(改性的蛋白或其鹽）中。
[0052]本發(fā)明的第三方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述經(jīng)改性的蛋白或其鹽的制備 方法，包括步驟：
[0053] 1)提供第一混合液，所述第一混合液包含未經(jīng)改性的可食用蛋白、N-琥珀酰亞胺 酯和任選的第一溶劑；
[0054] 2)在攪拌條件下，所述第一混合液反應(yīng)得到第二混合液；
[0055] 3)離心處理步驟2)所得第二混合液，取上清液；
[0056] 4)透析處理步驟3)所得上清液，得到本發(fā)明第一方面所述經(jīng)改性的蛋白。
[0057]在另一優(yōu)選例中，在步驟4)之后還任選地包括如下步驟：
[0058] 5)冷凍干燥前述步驟所得產(chǎn)物。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合液的pH為7.5-11，較佳地為9-10。
[0060]在另一優(yōu)選例中，所述N-琥珀酰亞胺酯為直鏈或支鏈的C13-C31的脂肪酸與N羥基 琥珀酰亞胺的縮合產(chǎn)物。
[0061]在另一優(yōu)選例中，所述N-琥珀酰亞胺酯選自下組:N-琥珀酰亞胺-辛酸酯、N-琥珀 酰亞胺-月桂酸酯、N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯、N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯、N-琥珀酰亞胺-硬 脂酸酯、N-琥珀酰亞胺-花生酸酯、或其組合。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述第一溶劑選自下組:水、DMS0、DMF或其組合。
[0063]在另一優(yōu)選例中，所述第一溶劑為(a)水與（b)DMS0和/或DMF的混合溶劑，其中體 積比為 70-99:30-1。
[0064] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一混合液中含有選自下組的緩沖劑:碳酸鈉 -碳酸氫 鈉、磷酸氫鈉-氫氧化鈉、或其組合。
[0065] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合液中，所述未經(jīng)改性的可食用蛋白和所述N-琥珀 酰亞胺酯的摩爾比為1:1.2-125，較佳地為1:2.4-100，更佳地為1:5-20。
[0066] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合液中，所述未經(jīng)改性的可食用蛋白中賴氨酸殘基 側(cè)鏈上的ε -氨基和所述N-琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:0.1 -10，較佳地為1:0.15-8，更佳地 1:0·2_5 〇
[0067] 在另一優(yōu)選例中，步驟2)所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為15-40°C。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，步驟2)所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為0.5_3h。
[0069] 在另一優(yōu)選例中，步驟3)所述離心處理的速度為5000-20000rpm，較佳地8000- 15000rpm〇
[0070] 在另一優(yōu)選例中，步驟3)所述離心處理的時間為3-20min。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，步驟4)所述透析處理所用透析袋的截留分子量為3000_5000Da。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，步驟4)所述透析處理的處理時間為10_60h。
[0073] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明第二方面所述納米粒子的制備方法，包括 步驟：
[0074] a)提供混合液A，所述混合液A包含本發(fā)明第一方面所述的經(jīng)改性的蛋白、任選的 脂溶性活性成分和任選的第二溶劑；
[0075] b)在攪拌條件下，所述混合液A自組裝反應(yīng)得到包含本發(fā)明第二方面所述納米粒 子的混合液B;
[0076] c)透析處理步驟b)所得混合液B，得到經(jīng)透析處理的混合液；
[0077] d)任選地離心處理步驟c)所得經(jīng)透析處理的混合液，取上清液，制得本發(fā)明第二 方面所述納米粒子。
[0078]在另一優(yōu)選例中，所述第二溶劑選自下組:水、乙醇、丙二醇、或其組合。
[0079]在另一優(yōu)選例中，步驟b)所述自組裝反應(yīng)的反應(yīng)時間為10-60min。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，步驟c)所述透析處理所用的透析袋的分子量為10_20kDa。
[0081 ] 在另一優(yōu)選例中，步驟d)所述離心處理的速度為3000_6000rpm。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，步驟d)所述離心處理的時間為l_30min，較佳地3_15min。
[0083] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種本發(fā)明第一方面所述的經(jīng)改性的蛋白的用途，用 于選自下組的用途：
[0084] 1)用于裝載脂溶性食品活性成分；
[0085] 2)用于裝載難溶性藥物。
[0086] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種制品，所述制品包含本發(fā)明第一方面所述改性蛋 白或本發(fā)明第二方面所述的納米粒子，或由本發(fā)明第一方面所述改性蛋白或本發(fā)明第二方 面所述的納米粒子制成。
[0087] 在另一優(yōu)選例中，所述制品選自下組:食品添加劑、載體、藥物、食物。
[0088]應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0089]圖1為N-羥基琥珀酰亞胺、辛酸與N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的1H-NMR譜圖。
[0090]圖2為N-羥基琥珀酰亞胺、辛酸與N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的13C-NMR譜圖。
[0091 ]圖3為N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的高效液相色譜圖。
[0092]圖4為N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的離子流圖。
[0093]圖5為N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的質(zhì)譜圖。
[0094]圖6為N-羥基琥珀酰亞胺、月桂酸與N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的1H-NMR譜圖。
[0095]圖7為N-羥基琥珀酰亞胺、月桂酸與N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的13C_NMR譜圖。
[0096]圖8為N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的高效液相色譜圖。
[0097]圖9為N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的離子流圖。
[0098]圖10為N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的質(zhì)譜圖。
[0099]圖11為N-羥基琥珀酰亞胺、肉豆蔻酸與N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的h-NMR譜圖。 [0100]圖12為N-羥基琥珀酰亞胺、肉豆蔻酸與N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的13C-NMR譜圖。
[0101] 圖13為N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的高效液相色譜圖。
[0102] 圖14為N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的離子流圖。
[0103] 圖15為N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的質(zhì)譜圖。
[0104]圖16為N-羥基琥珀酰亞胺、棕櫚酸與N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的1H-NMR譜圖。
[0105]圖17為N-羥基琥珀酰亞胺、棕櫚酸與N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的13C-NMR譜圖。
[0106] 圖18為N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的高效液相色譜圖。
[0107] 圖19為N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的離子流圖。
[0108] 圖20為N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的質(zhì)譜圖。
[0109] 圖21為具有不同烷基輒合度的烷基-酪蛋白酸鈉衍生物的疏水性指數(shù)結(jié)果。
[0110]圖22為姜黃素 (A)、荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子(B)和荷載姜黃素的棕櫚烷 基-酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38% ) (C)的水分散圖。
[0111]圖23為1.05mg荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子(A)和1.05mg荷載姜黃素的棕櫚 烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38% )(B)凍干再分別復(fù)溶于 0.5ml相同體積的雙蒸水中的水分散結(jié)果。
[0112]圖24A為荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子(磷鎢酸染色后）；圖24B為荷載姜黃素 的棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉納米粒子(未染色，棕櫚烷基鏈的輒合度為7.38%)的電鏡照片。
[0113] 圖25為姜黃素(a)、棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物(b)、姜黃素與棕櫚烷基輒 合的酪蛋白酸鈉衍生物(烷基鏈輒合度為7.38%)的物理混合物(c)和荷載姜黃素的棕櫚烷 基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38% ) (d)的DSC譜圖。
【具體實施方式】
[0114] 本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，通過在水溶性可食用蛋白表面改性輒合疏水性 的非極性烷基鏈，首次制備得到一種具有優(yōu)異自組裝性能和負(fù)載脂溶性活性成分性能的經(jīng) 改性的蛋白。具體地，本發(fā)明人通過改性調(diào)整所述水溶性可食用蛋白中的親水性和疏水性 基團的比例，得到一種可與脂溶性活性成分充分作用，進而可有效負(fù)載所述脂溶性活性成 分的經(jīng)改性的蛋白。所述經(jīng)改性的蛋白的制備方法具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、工藝簡 單、產(chǎn)物易分離、無有害化學(xué)物殘留、無安全問題等特點，可廣泛應(yīng)用于各種蛋白（特別是可 食用蛋白）的改性中。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。
[0115] 經(jīng)改性的蛋白
[0116] 具體地，本發(fā)明提供了一種經(jīng)改性的蛋白或其鹽，所述經(jīng)改性的蛋白包括：
[0117] 可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有經(jīng)修飾的賴氨酸殘基和/或經(jīng) 修飾的N端氨基；
[0118] 其中所述的"經(jīng)修飾的"指賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基或所述蛋白的N端氨基NH2中的氫原子被非極性烷基鏈取代基修飾，所述非極性烷基鏈為直鏈或支鏈的C12-C30的烷 基。
[0119] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈共價輒合于所述賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基 和/或蛋白質(zhì)的Ν端的氨基。
[0120] 在另一優(yōu)選例中，所述的可食用蛋白為水溶性蛋白。
[0121]在另一優(yōu)選例中，所述的水溶性蛋白指在25°C時，在水中的溶解度2 5000mg/L，優(yōu) 選為6000-10000mg/L。
[0122] 在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白的分子量為75000_375000Da，較佳地為 15000-25000Da〇
[0123] 在另一優(yōu)選例中，所述可食用蛋白包括(但并不限于）：酪蛋白、大豆蛋白、乳清蛋 白、或其組合。
[0124] 在另一優(yōu)選例中，所述可食用蛋白的鹽包括(但并不限于）：鈉鹽、鈣鹽、鉀鹽、或其 組合。
[0125] 在另一優(yōu)選例中，lmol所述可食用蛋白含有8_16mol賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基， 較佳地10-14mo 1，更佳地12.14mo 1。
[0126] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈為直鏈或支鏈的C14-C26的烷基，較佳地為直 鏈或支鏈的C16-C22的烷基。
[0127] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈為飽和的或不飽和的烷基，優(yōu)選為飽和的烷 基。
[0128] 在另一優(yōu)選例中，所述非極性烷基鏈中烷基為經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基。
[0129] 在另一優(yōu)選例中，所述取代指所述烷基中的氫原子被選自下組的基團取代:羥基、 CN、羧基、-NH2、或其組合。
[0130] 在本發(fā)明中，所述經(jīng)改性的蛋白中，所述非極性烷基鏈的輒合度為5-15%，且所述 輒合度C的計算公式如下式F1或F2:
[0131] C=(Kl+Nl)/(Kaii+l) X100% (F1)
[0132] 式中，
[0133] K1為可食用蛋白中所述經(jīng)修飾的賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε_氨基的數(shù)目；
[0134] Ν1為可食用蛋白中所述經(jīng)修飾的Ν端氨基的數(shù)目；
[0135] Kaii為可食用蛋白中賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基的總數(shù)。
[0136] C = y/((Miysine+l) ·χ)Χ100% (F2)
[0137] 式中，y是輒合到可食用蛋白中非極性烷基鏈的摩爾數(shù)，Mlysine是每摩爾可食用蛋 白中賴氨酸的摩爾數(shù)，X是經(jīng)改性的可食用蛋白的摩爾數(shù)。
[0138] 在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白中，所述非極性烷基鏈的輒合度為5.5-13%， 較佳地為6-12 %，更佳地為6.5-10 %。
[0139] 在本發(fā)明中，所述經(jīng)改性的蛋白具有式I所示結(jié)構(gòu)：
[0140]
[0141] 式中，
[0142] R為非極性烷基鏈取代基 [0143] Pr為可食用蛋白；
[0144] 其中，一個Pr上可連接有一個或多個R-C0-NH-基團。
[0145] 在本發(fā)明中，所述經(jīng)改性的蛋白的疏水性指數(shù)大于未經(jīng)改性的可食用蛋白的疏水 性指數(shù)。
[0146] 在另一優(yōu)選例中，所述經(jīng)改性的蛋白的疏水性指數(shù)為20-150，較佳地20-70，更佳 地為20-50。
[0147] 在另一優(yōu)選例中，所述可食用蛋白（即未經(jīng)改性的可食用蛋白）的疏水性指數(shù)為 10-22〇
[0148] 在另一優(yōu)選例中，所述疏水性指數(shù)是采用ANS熒光檢測法測定得到。
[0149] 典型地，在本發(fā)明中，首先將不同碳鏈鏈長的脂肪酸與N-羥基琥珀酰亞胺反應(yīng)，利 用二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的縮合作用，合成N-琥珀酰亞胺酯；隨后在一定的pH條件下，將 N-琥珀酰亞胺酯與市售的酪蛋白酸鈉反應(yīng)，得到烷基輒合的酪蛋白酸鈉。
[0150] 應(yīng)理解，在本發(fā)明中，通過在所述親水性強的水溶性蛋白表面改性輒合疏水性的 非極性烷基鏈，從而改變了蛋白結(jié)構(gòu)中親水性和疏水性基團的比例，進而直接影響蛋白的 自組裝性及其用作食品載運體系的可能性。
[0151]研究表明：本發(fā)明所得棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉的自組裝形成納米粒子并包載 疏水性姜黃素的能力明顯優(yōu)于未修飾的酪蛋白酸鈉，且其包封能力與烷基輒合度的大小有 關(guān)。
[0152]經(jīng)改性的蛋白的制備方法
[0153] 本發(fā)明還提供了一種所述經(jīng)改性的蛋白或其鹽的制備方法，包括步驟：
[0154] 1)提供第一混合液，所述第一混合液包含未經(jīng)改性的可食用蛋白、N-琥珀酰亞胺 酯和任選的第一溶劑；
[0155] 2)在攪拌條件下，所述第一混合液反應(yīng)得到第二混合液；
[0156] 3)離心處理步驟2)所得第二混合液，取上清液；
[0157] 4)透析處理步驟3)所得上清液，得到所述經(jīng)改性的蛋白。
[0158] 在另一優(yōu)選例中，在步驟4)之后還任選地包括如下步驟：
[0159] 5)冷凍干燥前述步驟所得產(chǎn)物。
[0160] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合液的pH為7.5-11，較佳地為9-10。
[0161 ]在另一優(yōu)選例中，所述N-琥珀酰亞胺酯為直鏈或支鏈的C13-C31的脂肪酸與N羥基 琥珀酰亞胺的縮合產(chǎn)物。
[0162] 在另一優(yōu)選例中，所述N-琥珀酰亞胺酯包括(但并不限于）：N-琥珀酰亞胺-辛酸 酯、N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯、N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯、N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯、N-琥珀 酰亞胺-硬脂酸酯、N-琥珀酰亞胺-花生酸酯、或其組合。
[0163] 在另一優(yōu)選例中，所述第一溶劑包括(但并不限于）：水、DMS0、DMF或其組合。
[0164] 在另一優(yōu)選例中，所述第一溶劑為(a)水與（b)DMS0和/或DMF的混合溶劑，其中體 積比為 70-99:30-1。
[0165] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一混合液中含有包括(但并不限于）下組的緩沖劑:碳 酸鈉-碳酸氫鈉、磷酸氫鈉-氫氧化鈉、或其組合。
[0166] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合液中，所述未經(jīng)改性的可食用蛋白和所述N-琥珀 酰亞胺酯的摩爾比為1:1.2-125，較佳地為1:2.4-100，更佳地為1:5-20。
[0167] 在另一優(yōu)選例中，所述第一混合液中，所述未經(jīng)改性的可食用蛋白中賴氨酸殘基 側(cè)鏈上的ε -氨基和所述N-琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:0.1 -10，較佳地為1:0.15-8，更佳地 1:0·2_5 〇
[0168] 在另一優(yōu)選例中，步驟2)所述反應(yīng)的反應(yīng)溫度為15-40°C。
[0169] 在另一優(yōu)選例中，步驟2)所述反應(yīng)的反應(yīng)時間為0.5_3h。
[0170] 在另一優(yōu)選例中，步驟3)所述離心處理的速度為5000-20000rpm，較佳地8000- 15000rpm〇
[0171 ] 在另一優(yōu)選例中，步驟3)所述離心處理的時間為3-20min。
[0172] 在另一優(yōu)選例中，步驟4)所述透析處理所用透析袋的截留分子量為3000_5000Da。
[0173] 在另一優(yōu)選例中，步驟4)所述透析處理的處理時間為10_60h。
[0174] 在本發(fā)明中，通過控制酪蛋白酸鈉與N-琥珀酰亞胺酯的用量比，可以控制所得經(jīng) 改性的蛋白中烷基鏈輒合度的大小。
[0175] 在上述經(jīng)改性的蛋白的制備方法中，由于N-琥珀酰亞胺基團只與非質(zhì)子化的氨基 發(fā)生反應(yīng)，為了確保氨基處于非質(zhì)子化狀態(tài)，所述改性反應(yīng)在pH為7.5-11下進行。
[0176] 在上述經(jīng)改性的蛋白的制備方法中，所述離心處理的目的在于除去未反應(yīng)的N-琥 珀酰亞胺酯及其水解產(chǎn)物；所述透析處理的目的在于除去溶解N-琥珀酰亞胺酯的溶劑 (DMS0或DMF)、以及溶解蛋白的緩沖鹽。
[0177] 應(yīng)理解，本發(fā)明的改性方法雖然基于酪蛋白酸鈉，但本改性方法同樣適用于酪蛋 白的其它鹽和其它可食用蛋白或相應(yīng)的鹽。
[0178]應(yīng)理解，本發(fā)明的實驗結(jié)果主要是將非極性烷基鏈輒合到蛋白中，形成烷基輒合 的酪蛋白酸鈉，但是該改性方法同樣適用于將其它基團輒合到蛋白中。
[0179] 納米粒子及其制備方法
[0180] 本發(fā)明還提供了一種納米粒子，所述納米粒子由所述的經(jīng)改性的蛋白或其鹽自組 裝形成，且所述納米粒子中任選地包含裝載于其中的脂溶性活性成分。
[0181] 在另一優(yōu)選例中，所述脂溶性活性成分包括(但并不限于）：黃酮類化合物、ω-3脂 肪酸、植物留醇、或其組合。
[0182] 在另一優(yōu)選例中，所述黃酮類化合物包括(但并不限于）：姜黃素、橙皮苷、黃芩素、 或其組合。
[0183] 在本發(fā)明中，所述納米粒子具有選自下組的一個或多個特征：
[0184] 1)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的水分散性好；
[0185] 2)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的粒徑為10-1000nm;
[0186] 3)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的多分散指數(shù)PDIS 0.25;
[0187] 4)所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的ζ電位為_40mV~+40mV。
[0188] 在另一優(yōu)選例中，所述的"水分散性好"指將0.2_5g(較佳地0.5_3g)所述納米粒子 與100ml水混合，可形成溶液，且無肉眼可見的團聚物。
[0189] 在另一優(yōu)選例中，按所述納米粒子的總重量計，所述脂溶性活性成分的裝載量為 l-10wt%，較佳地為2_8wt%，更佳地為3_6wt%。
[0190] 在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子（或凍干再分散后的納米粒子）的粒徑為30- 800nm，較佳地為 50-600nm，更佳地為 100-500nm。
[0191] 在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子）的多分散指數(shù)PDI < 0.4，較佳地< 0.3，更佳地< 0.2。
[0192] 在另一優(yōu)選例中，所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的ζ電位為-35mV~ +35mV〇
[0193] 在另一優(yōu)選例中，所述復(fù)合物中被包載的脂溶性活性成分以無定形態(tài)分散在所述 載體材料(改性的蛋白或其鹽）中。
[0194] 本發(fā)明還提供了一種所述納米粒子的制備方法，包括步驟：
[0195] a)提供混合液A，所述混合液A包含所述的經(jīng)改性的蛋白、任選的脂溶性活性成分 和任選的第二溶劑；
[0196] b)在攪拌條件下，所述混合液A自組裝反應(yīng)得到包含所述納米粒子的混合液B;
[0197] c)透析處理步驟b)所得混合液B，得到經(jīng)透析處理的混合液；
[0198] d)任選地離心處理步驟c)所得經(jīng)透析處理的混合液，取上清液，制得所述納米粒 子。
[0199] 在另一優(yōu)選例中，所述第二溶劑包括(但并不限于）：水、乙醇、丙二醇、或其組合。 [0200]在另一優(yōu)選例中，步驟b)所述自組裝反應(yīng)的反應(yīng)時間為10-60min。
[0201] 在另一優(yōu)選例中，步驟c)所述透析處理所用的透析袋的分子量為10_20kDa。
[0202] 在另一優(yōu)選例中，步驟d)所述離心處理的速度為3000-6000rpm。
[0203] 在另一優(yōu)選例中，步驟d)所述離心處理的時間為l-30min，較佳地3-15min。
[0204] 在上述制備納米粒子的方法中，所述透析處理的目的在于去除所得反應(yīng)混合液中 的所含的脂溶性溶劑;所述離心處理的目的在于去除未被負(fù)載的脂溶性活性成分。
[0205] 應(yīng)用
[0206] 本發(fā)明還提供了一種所述的經(jīng)改性的蛋白的用途，用于選自下組的用途：
[0207] 1)用于裝載脂溶性食品活性成分；
[0208] 2)用于裝載難溶性藥物。
[0209] 本發(fā)明還提供了一種制品，所述制品包含所述改性蛋白或所述的納米粒子，或由 所述改性蛋白或所述的納米粒子制成。
[0210] 在另一優(yōu)選例中，所述制品包括(但并不限于）：食品添加劑、載體、藥物、食物。
[0211] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下主要優(yōu)點：
[0212] (1)所述經(jīng)改性的蛋白具有更優(yōu)的親水/疏水結(jié)構(gòu)比例，進而能更有效地負(fù)載所述 脂溶性活性成分；
[0213] ⑵所述經(jīng)改性的蛋白具有優(yōu)異的自組裝性和負(fù)載脂溶性活性成分的能力；
[0214] (3)所述經(jīng)改性的蛋白的制備方法具有反應(yīng)條件溫和(不會對蛋白有任何破壞）、 反應(yīng)效率高、工藝簡單、產(chǎn)物易分離、無有害化學(xué)物殘留等特點，可廣泛應(yīng)用于各種蛋白（特 別是可食用蛋白）的改性中；
[0215] ⑷所述納米粒子凍干后復(fù)溶性良好，負(fù)載脂溶性活性成分能力強；
[0216] (5)所述納米粒子的制備方法簡單，且低能耗。
[0217] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0218] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中 所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0219] 通用測試方法 [0220]核磁共振
[0221]用d6-DMS0配置2mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺、脂肪酸（辛酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕 櫚酸)與N-琥珀酰亞胺酯溶液，分別進行1H-NMR與13C-NMR測定。
[0222]超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用
[0223]用乙腈配置0.1mg/mL的N-琥珀酰亞胺酯溶液，進行超高效液相色譜-質(zhì)譜測定。
[0224] 色譜條件如下:Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100X2.1mm，1.7ym)，柱溫為30 °C，流動相為27%水/乙腈，流速為0.3mL/min，進樣量為2yL，Waters Acquity PDA檢測器在 205nm處進行檢測。
[0225] 質(zhì)譜條件如下：正離子模式，ESI源;毛細(xì)管電壓，3. OkV;錐孔電壓，10.0 kV;離子源 溫度，120°C ;脫溶劑溫度，450°C ;脫溶劑氣流速，800.0 L/h;錐孔氣流速，50.0 L/h;掃描范 圍，m/z 200-600;掃描時間，0.2s。
[0226]所得數(shù)據(jù)用MassLynx 4.1軟件進行分析。
[0227] 輒合度測量
[0228] 用D20配置10mg/mL的蛋白樣品溶液，進行匪R測定。通過核磁譜圖中甲基（0- 0.9ppm，標(biāo)注為峰A)和亞甲基（1.3ppm，標(biāo)注為峰B)的積分面積，定量計算出不同烷基-酪蛋 白酸鈉衍生物中烷基的輒合度。
[0229] I peak A -(Misoleucine · Nisoleucine+Mleucine · Nleucine+Mvaline · Nvaline+y · Nalkyl-CH3) · X
[0230] Ipeak B = y · Nalkyl-CH2
[0231 ] SD( % ) =y/( (Miysine+1) · x) X 100
[0232] 其中Ipeak A與Ipeak B分別為核磁譜圖中甲基和亞甲基的積分面積，x為經(jīng)改性蛋白 的摩爾數(shù)，y為非極性烷基鏈的摩爾數(shù)，Nisolwine，Nl_ine，Nvaiine分別為異亮氨酸(6H)，亮氨 酸(6H)，纈氨酸(6H)與非極性烷基鏈(3H)中甲基的質(zhì)子數(shù)，分別為非極性烷基鏈中亞甲基 的質(zhì)子數(shù)，Misoleucine ,Μ?θ?ι。^，Mvaline and Mlysine分別為1摩爾酪蛋白酸鈉中異亮氨酸 (11.73)、亮氨酸（18.39)、纈氨酸（14.61)、賴氨酸（12.14)的摩爾數(shù)。
[0233] ANS熒光檢測法
[0234] ANS熒光探針的熒光量子產(chǎn)率及最大發(fā)射波長取決于所處環(huán)境的極性。在水溶液 中，熒光探針單獨存在時，熒光量子產(chǎn)率很低，當(dāng)結(jié)合到蛋白質(zhì)等物質(zhì)的疏水部位上時，熒 光強度將顯著提高，從而可用于表征蛋白質(zhì)的疏水性。
[0235] 分別稱取10mg待測蛋白樣品，將其溶于lmL磷酸緩沖液中（濃度為0.1mol/L，pH 7.0)，過夜攪拌保證樣品充分溶解，然后在20000g下離心15min，得到蛋白上清液作為儲備 原液，并利用Bradford法測定儲備原液中蛋白的濃度。將蛋白儲備液分別稀釋10、20、50、 80、100倍，得到一系列稀釋的蛋白樣品，待用。用上述磷酸緩沖液配置100yg/mL的ANS染液， 并用0.22μπι的濾膜進行過濾。將等體積的ANS染液和一系列稀釋的蛋白樣品加入96孔板，25 °C下混合孵育lh。孵育結(jié)束后，利用酶標(biāo)儀檢測樣品的熒光強度值(FI)，激發(fā)波長設(shè)為 355nm，發(fā)射波長設(shè)為460nm。將樣品的FI值與蛋白濃度做線性回歸，得到線性回歸方程，線 性方程的斜率即為樣品的疏水性指數(shù)。
[0236] 粒徑、多分散性和ζ電位的測定
[0237] 基于動態(tài)光散射技術(shù)，采用馬爾文粒度儀測定新鮮制得和凍干復(fù)溶后的荷載姜黃 素的烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子的水合直徑、多分散性分布指數(shù)和ζ電位值。
[0238] 實驗光源為4.0mW He-Ne激光，激光波長為633nm，測定角度為90°。所有測量溫度 設(shè)定為25°C，在此溫度下介質(zhì)水的折射率和粘度分別設(shè)定為1.590和0.8904cP。每個樣品重 復(fù)測定3次，取平均值。
[0239] 形貌研究
[0240] 采用透射電鏡(??Μ)觀察荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子和荷載姜黃素的棕櫚 烷基-酪蛋白酸鈉納米粒子的形貌。
[0241 ]常規(guī)樣品的制備方法如下:將一滴樣品滴置于200目碳包覆的銅網(wǎng)上，自然干燥過 夜，然后置于透射電鏡下用不同放大倍率觀察其形貌。
[0242] 對于部分樣品，采用磷鎢酸染色后再在透射電鏡下觀察。染色的具體方法如下:將 樣品先滴置于銅網(wǎng)上，自然干燥，然后將樣品銅網(wǎng)反扣在一滴磷鎢酸染液上，染色2min，待 取出干燥，即可透射電鏡下觀察。
[0243] DSC 研究
[0244] 采用示差掃描量熱法(DSC)分析姜黃素、棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物、姜黃 素與棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物(烷基鏈輒合度為7.38%)的物理混合物和荷載姜 黃素的棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38%)的熱行為。
[0245] 分別精確稱量2mg樣品放入標(biāo)準(zhǔn)鋁盤中，保證良好的傳熱接觸，采用銦用來校正儀 器參數(shù)，并用空的鋁盤校準(zhǔn)基線。測試時加入氮氣為保護氣體(流速20mL/min)，加熱速率為 10°C/min，掃描溫度范圍為室溫-200°C。
[0246] 實施例1N-琥珀酰亞胺酯的合成
[0247]
[0248] N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的合成
[0249] 將3.6克（25mmol)辛酸加入250mL圓底三頸瓶中，用75mL無水1，4_二氧六環(huán)溶解， 然后加入2.9克（26mmol)N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和7.6克（37mmol)二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)，在室溫下，N2保護下反應(yīng)4h。反應(yīng)完畢后，加石油醚促沉，過濾除去白色沉淀N，N-二 環(huán)己基脲(DCU)，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮，得到無色油狀粗酯。利用硅膠柱層析法 (洗脫液為12%乙酸乙酯/正己烷)純化粗酯，真空干燥樣品至恒重，得到3.38克無色N-琥珀 酰亞胺-辛酸酯固體。
[0250] N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的合成
[0251] 將5 · 0克（25mmol)月桂酸加入250mL圓底三頸瓶中，用75mL無水1，4-二氧六環(huán)溶 解，然后加入2.9克（26mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和7.6克（37mmol)二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)，在室溫下，N2保護下反應(yīng)4h。反應(yīng)完畢后，加石油醚促沉，過濾除去白色沉淀N，N-二 環(huán)己基脲(DCU)，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮，得到無色油狀粗酯。利用硅膠柱層析法 (洗脫液為12%乙酸乙酯/正己烷)純化粗酯，真空干燥樣品至恒重，得到3.65克無色N-琥珀 酰亞胺-月桂酸酯固體。
[0252] N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的合成
[0253] 將5.7克（25mmol)肉豆蔻酸加入250mL圓底三頸瓶中，用75mL無水1，4_二氧六環(huán)溶 解，然后加入2.9克（26mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和7.6克（37mmol)二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)，在室溫下，N2保護下反應(yīng)4h。反應(yīng)完畢后，加石油醚促沉，過濾除去白色沉淀N，N-二 環(huán)己基脲(DCU)，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮，得到無色油狀粗酯。利用硅膠柱層析法 (洗脫液為12%乙酸乙酯/正己烷)純化粗酯，真空干燥樣品至恒重，得到4.31克無色N-琥珀 酰亞胺-肉豆蔻酸酯固體。
[0254] N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的合成
[0255] 將6.4克（25mmol)棕櫚酸加入250mL圓底三頸瓶中，用75mL無水1，4_二氧六環(huán)溶 解，然后加入2.9克（26mmol)N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和7.6克（37mmol)二環(huán)己基碳二亞胺 (DCC)，在室溫下，N2保護下反應(yīng)4h。反應(yīng)完畢后，加石油醚促沉，過濾除去白色沉淀N，N-二 環(huán)己基脲(DCU)，然后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮，得到無色油狀粗酯。利用硅膠柱層析法 (洗脫液為12%乙酸乙酯/正己烷)純化粗酯，真空干燥樣品至恒重，得到4.32克無色N-琥珀 酰亞胺-棕櫚酸酯固體。
[0256] 結(jié)果
[0257] 分別采用核磁共振儀、超高效液相色譜-質(zhì)譜儀對合成后的酯進行結(jié)構(gòu)表征，以確 定通過上述方法是否成功合成了 N-琥珀酰亞胺酯。
[0258] 圖1為N-羥基琥珀酰亞胺、辛酸與N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的1H-NMR譜圖，圖2為N-羥 基琥珀酰亞胺、辛酸與N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的13C-NMR譜圖，圖3為N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的 高效液相色譜圖，圖4為N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的離子流圖，圖5為N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的 質(zhì)譜圖。
[0259] 從圖1和圖2可知:N-羥基琥珀酰亞胺、辛酸與N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的1H-NMR與13c-nmr的峰歸屬如下：
[0260] N-羥基琥珀酰亞胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0261] 辛酸,0.86 (t，3H) .13C-匪R(d6-DMS0)S174.96,34.12,31.63,29.04-28.83(2 XCH2) ,24.97,22.52, 14.40.
[0262] N-琥珀酰亞胺-辛酸酯：h-NMlK d6-DMS0) δ2 · 81 (s，4H)，2 · 65 (t，2H)，1 · 61 (m，2H)， 1.27(m，8H)，0.86(t，3H) .13C-匪R(d6-DMS0)S170.73(2 XC = 0) ,169.46,31.53,30.65， 28.69-28.38(2 XCH2), 25.90(2 XCH2), 24.76,22.46,14.39.
[0263] 從圖3和圖4可知:UPLC的譜圖中只有一個明顯的主峰，此外，我們還提取到了 N-琥 珀酰亞胺-辛酸酯的特征離子[M+Na] +峰，且相應(yīng)的出峰時間與UPLC圖譜中的一致。
[0264] 從圖5的質(zhì)譜圖中，我們也可以看到N-琥珀酰亞胺-辛酸酯的[M+Na]+和[M+H]+峰。
[0265] 圖6為N-羥基琥珀酰亞胺、月桂酸與N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的1H-NMR譜圖，圖7為 N-羥基琥珀酰亞胺、月桂酸與N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的13C-NMR譜圖，圖8為N-琥珀酰亞胺- 月桂酸酯的高效液相色譜圖，圖9為N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的離子流圖，圖10為N-琥珀酰 亞胺-月桂酸酯的質(zhì)譜圖。
[0266] 從圖6和圖7可知:N-羥基琥珀酰亞胺、月桂酸與N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的1H-NMR 與13c-nmr的峰歸屬如下：
[0267] N-羥基琥珀酰亞胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0268] 月桂酸,2.18(t，2H)，1.48(m，2H)，1.26(m，16H)， 0.86 (t, 3H) ,13C-NMR(d6-DMS0)5174.93,34.12,31.79,29.70-28.90(6 XCH2) ,24.97, 22.59.14.40.
[0269] N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯 2H) ,1.31 (m,16H) ,0.86( t,3H) ,13C-NMR(d6-DMS0) 5170.23( 2 XC = 0) ,168.96,31.30, 30.17,29.13-28.62(4XCH2),28.52,28.00,25.42(2XCH2),24.28,22.11,13.94.
[0270] 從圖8和圖9可知:UPLC的譜圖中只有一個明顯的主峰，此外，我們還提取到了 N-琥 珀酰亞胺-月桂酸酯的特征離子[M+Na] +峰，且相應(yīng)的出峰時間與UPLC圖譜中的一致。
[0271] 從圖10的質(zhì)譜圖中，我們也可以看到N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯的[M+Na]+峰。
[0272] 圖11為N-羥基琥珀酰亞胺、肉豆蔻酸與N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的匪R譜圖， 圖12為N-羥基琥珀酰亞胺、肉豆蔻酸與N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的13C-NMR譜圖，圖13為N- 琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的高效液相色譜圖，圖14為N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的離子流 圖。圖15為N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的質(zhì)譜圖。
[0273] 從圖11和圖12可知：N-羥基琥珀酰亞胺、肉豆蔻酸與N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯 的1H-NMR與13C-NMR的峰歸屬如下：
[0274] N-羥基琥珀酰亞胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0275] 肉豆蔻酸：1!1-匪1?((16-0150)311.96(8，1!1)，2.18(七，2!1)，1.48(111，2!1)，1.26(111， 20H)，0.85(t，3H).13C-NMR(d6-DMS0)Sl74.92,34.12,31.80,29.68-29.00(8XCH 2) ,24.97， 22.59.14.40.
[0276] N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯：七-匪以d6-DMS0)δ2 · 81 (s，4H)，2 · 65(t，2H)，1 · 59(m， 2H) ,1.29(m,20H) ,0.85( t,3H). 13C-NMR(d6-DMS0)5l70.71(2 XC = 0) ,169.44,31.79, 30.65,29.60-29.15(6XCH2),29.00,28.49,25.90(2XCH2),24.76,22.59,14.42.
[0277] 從圖13和圖14可知:UPLC的譜圖中只有一個明顯的主峰，此外，我們還提取到了 N- 琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的特征離子[M+Na] +峰，且相應(yīng)的出峰時間與UPLC圖譜中的一致。
[0278] 從圖15的質(zhì)譜圖中，我們也可以看到N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯的[M+Na]+峰。
[0279] 圖16為N-羥基琥珀酰亞胺、棕櫚酸與N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的1H-NMR譜圖，圖17 為N-羥基琥珀酰亞胺、棕櫚酸與N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的13C-NMR譜圖，圖18為N-琥珀酰亞 胺-棕櫚酸酯的高效液相色譜圖，圖19為N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的離子流圖。圖20為N-琥 珀酰亞胺-棕櫚酸酯的質(zhì)譜圖。
[0280] 從圖16和圖17可知:N-羥基琥珀酰亞胺、棕櫚酸與N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的1H- NMR與13C-NMR的峰歸屬如下：
[0281 ] N-羥基琥珀酰亞胺：MMR(d6-DMSO)Sl〇.54(s，lH)，2.59(s，4H).13C-NMR(d 6- DMS0)5172.86(2 XC = 0), 25.27(2 XCH2).
[0282] 棕櫚酸,2.18(t，2H)，1.47(m，2H)，1.25(m，24H)， 0.85(t，3H).13C-Mffi(d6-DMS0)Sl74.90,34.12,31.81，29.7h28.99(10XCH2)，24.97， 22.60,14.39.
[0283] N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯：4-^^((16-01^0)52.80(8,411),2.65(1211),1.61(111, 2H) ,1.29(m,24H) ,0.85( t,3H). 13C-NMR(d6-DMS0) 5170.74(2 XC = 0) ,169.47,31.78, 30.65,30.01-28.28( 10 XCH2), 25.91 (2 XCH2), 24.76,22.58,14.44.
[0284] 從圖18和圖19可知:UPLC的譜圖中只有一個明顯的主峰，此外，我們還提取到了 N- 琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的特征離子[M+Na] +峰，且相應(yīng)的出峰時間與UPLC圖譜中的一致。
[0285] 從圖20的質(zhì)譜圖中，我們也可以看到N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯的[M+Na]+峰。
[0286] 實施例2烷基-酪蛋白酸鈉衍生物的合成
[0287]
[0288] 用0.2M碳酸鹽緩沖液(pH9.0)配置5mg/mL酪蛋白酸鈉溶液，過夜磁力攪拌，制得酪 蛋白酸鈉溶液。用DMS0分別溶解N-琥珀酰亞胺-辛酸酯和N-琥珀酰亞胺-月桂酸酯，用DMF分 別溶解N-琥珀酰亞胺-肉豆蔻酸酯和N-琥珀酰亞胺-棕櫚酸酯，分別配置濃度為0.084mol/ mL的N-琥珀酰亞胺酯溶液。將酪蛋白酸鈉中賴氨酸ε-ΝΗ2與N-琥珀酰亞胺酯按照不同摩爾 比（1:0.25、1:0.5、1:1、1:2、1 :4、1:5)進行投料，以58/滴的滴速，分別將^琥珀酰亞胺酯溶 液滴加到酪蛋白酸鈉溶液體系中，25 °C下攪拌lh。反應(yīng)結(jié)束后，將體系在lOOOOrpm離心速度 下離心10min，取上清，再用透析袋(截留分子量3500Da)在雙蒸水中透析48h去除DMS0或DMF 與緩沖鹽后，冷凍干燥，得到辛烷基-酪蛋白酸鈉(C8-NaCas)、月桂烷基-酪蛋白酸鈉(C12- NaCas)、肉豆蔻烷基-酪蛋白酸鈉(C14-NaCas)和棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉(C16_NaCas)樣品， 并保存于4°C待用。
[0289] 結(jié)果
[0290] 計算不同投料比下合成得到的烷基-酪蛋白酸鈉衍生物中烷基鏈的輒合度，結(jié)果 如表1所示。
[0291] 表1
[0292]
[0293] 從表1可以看出，隨著酪蛋白酸鈉中賴氨酸殘基ε-ΝΗ2/Ν_琥珀酰亞胺酯摩爾投料 比的提尚，烷基輒合度整體呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，可是當(dāng)投料比從1:4提尚至1:5時，烷基輒 合度值變化不大。
[0294] 此外，我們還發(fā)現(xiàn)烷基鏈長對于烷基輒合度有明顯影響。在相同投料比情況下，短 烷基鏈明顯更容易輒合到蛋白分子中，相應(yīng)的烷基輒合度值也更大。這可能是由于烷基鏈 越短，相應(yīng)的空間位阻也較小，越容易進攻蛋白賴氨酸殘基中的氨基的原因。
[0295] 采用ANS熒光檢測法測定未修飾的酪蛋白酸鈉 (NaCas)和改性的酪蛋白酸鈉衍生 物的疏水性指數(shù)(surface hydrophobicity index)。
[0296] 圖21為具有不同烷基輒合度的烷基-酪蛋白酸鈉衍生物的疏水性指數(shù)結(jié)果。
[0297] 表2為未修飾的酪蛋白酸鈉(NaCas)和不同投料比下合成得到的烷基-酪蛋白酸鈉 衍生物的疏水性指數(shù)結(jié)果。
[0298] 表 2
[0299]
[?-υ」 從團ζι珀甘衣zb」以有m日權(quán)丁木修τ巾tw酣繭η阪土佰雙，阮番-酣繭 白酸鈉衍生物的疏水性指數(shù)均有提高，而且隨著烷基輒合度的提高，烷基-酪蛋白酸鈉衍生 物的疏水性指數(shù)也呈統(tǒng)計學(xué)意義上的增大。
[0301] 實施例3納米粒子的制備
[0302]用雙蒸水分別配置2mg/mL酪蛋白酸鈉和棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物(烷基 鏈輒合度為7.38%)溶液。用100%乙醇溶解姜黃素，配置11^/1^的姜黃素醇溶液。將0.2 1^ 上述姜黃素醇溶液滴加至2mL蛋白溶液中，磁力攪拌30min后，裝入透析袋（截留分子量 15000Da)，置于雙蒸水中透析過夜去除乙醇。觀察透析后袋中樣品的狀態(tài)，并在4500rpm下 離心5min，取上清液，制得荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子和荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉 衍生物納米粒子。
[0303] 結(jié)果 [0304]水分散結(jié)果
[0305]在攪拌條件下，將0.25mg姜黃素、5. lmg荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子或荷載 姜黃素的棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38%)分別溶于5ml水 中，攪拌2h。
[0306]圖22為攪拌后所得姜黃素 (A)、荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子(B)和荷載姜黃 素的棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38% ) (C)的水分散圖。 [0307]從圖22可以看出，將姜黃素加入水中后，大多數(shù)的姜黃素都沉于瓶底(如A所示）， 這主要是由于姜黃素水溶解性很差導(dǎo)致的；而酪蛋白酸鈉 (NaCas)和棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉 衍生物(C16-NaCas，以輒合度為7.38%的樣品為例)納米粒子則均可有效地包封姜黃素，形 成均一的黃色納米粒體系(如B和C所示）。
[0308] 凍干復(fù)溶
[0309] 將新鮮制得的荷載姜黃素的棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉納米粒子（烷基鏈輒合度為 7.38%)放置于-80°C超低溫冰箱中過夜預(yù)凍，然后迅速放入凍干機中凍干48h，得到凍干粉 末狀樣品。將凍干粉末狀樣品再次復(fù)溶到相同體積的雙蒸水中，用渦旋振蕩儀振蕩2min后 室溫靜置、觀察體系的狀態(tài)，并用數(shù)碼相機拍照。
[0310] 凍干復(fù)溶后的水分散結(jié)果
[0311] 圖23為0.51mg荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子(A)和0.51mg荷載姜黃素的棕櫚 烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38% ) (B)分別凍干再分別復(fù)溶 于0.5ml相同體積的雙蒸水中的水分散結(jié)果。
[0312] 從圖23可以看出，荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子的復(fù)溶性不太好，管底和管 壁上均出現(xiàn)了明顯的黃色聚集體，而荷載姜黃素的棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子 卻能在水中復(fù)溶的很好，形成均一的黃色體系，肉眼未見明顯的聚集體。荷載姜黃素的酪蛋 白酸鈉納米粒子復(fù)溶性不好的原因可能是由于酪蛋白酸鈉分子結(jié)構(gòu)中親水基團較多，其與 疏水性姜黃素的疏水作用不夠強導(dǎo)致的。
[0313] 水合直徑、多分散性指數(shù)和ζ-電位值結(jié)果
[0314] 表3為新鮮制得和凍干復(fù)溶后的荷載姜黃素的烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物納米 粒子的水合直徑、多分散性指數(shù)和ζ_電位值結(jié)果。
[0315] 表3
[0316]
[0317] 從表3可以看出：荷載姜黃素的NaCas納米粒子的粒徑大小為210.73nm，粒徑分布 呈單分散分布(PDI = 0.13)，納米粒子表面電位為-30.56mV。與之相比，荷載姜黃素的C16- NaCas納米粒子粒徑值卻稍有增大，且隨著棕櫚烷基輒合度的增加，粒徑值不斷增加，從 234· 20nm(C16-NaCas-5 · 94% )增加至274· 57nm(C16-NaCas-l 1 · 84% )，粒徑分布未發(fā)生很 大的改變，仍呈單分散分布(PDI 2 0.25)。粒徑增大的現(xiàn)象可能是由于烷基鏈的輒合度增大 使蛋白納米粒子的疏水核增大導(dǎo)致的，而且粒徑增大趨勢與烷基鏈輒合度增大的趨勢相 關(guān)。C16_NaCas納米粒的ζ-電位值也在_30mV左右，并未與NaCas納米粒子有較大差異。
[0318] 同時，從表3還可以看出：荷載姜黃素的三種C16_NaCas納米粒的粒徑值分別為 227 · 36nm(C16-NaCas-5 · 94% )、289 · 86nm(C16-NaCas-7 · 38% )和346.40腦（(：16-他〇&8- 11 · 84% )，相應(yīng)的粒徑分布值分別為0 · 18(C16-NaCas-5 · 94% )、0 · 23(C16-NaCas-7 · 38% ) 和0 · 45(C16-NaCas-l 1 · 84% )，相應(yīng)的ζ-電位值分別為-28.7〇11^((：16-他〇&8-5.94%)、- 25 · 90mV(C16-NaCas-7 · 38% )和-24· 36mV(C16-NaCas-l 1 · 84% )。
[0319] 對比復(fù)溶前納米粒子相應(yīng)的數(shù)據(jù)，可以看出：復(fù)溶后棕櫚烷基取代度為11.84%的 蛋白納米粒子的粒徑大小和分散性指數(shù)均有較大的增加，這可能是由于較多疏水烷基輒合 到蛋白結(jié)構(gòu)中，降低了蛋白形成納米粒子的水分散性。
[0320]形貌學(xué)結(jié)果
[0321]圖24A為荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子(磷鎢酸染色后）的電鏡照片；圖24B為 荷載姜黃素的棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉納米粒子(未染色，棕櫚烷基鏈的輒合度為7.38 % )的 電鏡照片。
[0322]當(dāng)按照常規(guī)樣品制備方法制樣后，電鏡下觀察上述兩種樣品后發(fā)現(xiàn)：電鏡下不能 很好地觀察到荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子，電鏡視野下僅觀察到一層蛋白膜;而對 于荷載姜黃素的棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉納米粒子，電鏡下卻能較方便地觀察到分散性較好、 具有球形形貌的蛋白納米粒子，且納米粒的粒徑大小與表3中馬爾文粒度儀測得的粒徑大 小相當(dāng)（如B所示）。這可能是由于酪蛋白酸鈉具有較好水溶性，易成膜，而其形成的納米粒 子與銅網(wǎng)表面蛋白膜的襯度不夠，因此無法直接觀察到納米粒子的形貌。隨后，我們采用負(fù) 染色技術(shù)，用磷鎢酸染色樣品，然后進行觀察，這次我們觀察到了荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉 納米粒子(如A所示），在荷載姜黃素的酪蛋白酸鈉納米粒子所形成的蛋白膜上隱約可見球 形的納米粒子，但納米粒子表面不太光滑，與膜有些相容。
[0323]對比例1姜黃素與棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物(烷基鏈輒合度為7.38%)的 物理混合物
[0324] 同實施例3中姜黃素與棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉衍生物的混合質(zhì)量比，制備姜黃素與 棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉衍生物(烷基鏈輒合度為7.38 % )的干粉物理混合物。
[0325] 圖25為姜黃素(a)、棕櫚烷基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物(b)、姜黃素與棕櫚烷基輒 合的酪蛋白酸鈉衍生物(烷基鏈輒合度為7.38%)的物理混合物(c)和荷載姜黃素的棕櫚烷 基輒合的酪蛋白酸鈉衍生物納米粒子(烷基鏈輒合度為7.38% ) (d)的DSC譜圖。
[0326] 從圖25可以看出：簡單的物理混合并不會改變姜黃素晶體的存在狀態(tài)，而荷載到 蛋白納米粒中的姜黃素卻是以無定形狀態(tài)存在的。
[0327] 實施例4納米粒子的制備
[0328] 同實施例3,區(qū)別在于:所述納米粒子中荷載的脂溶性活性成分為橙皮苷。
[0329] 結(jié)果
[0330] 得到類似于實施例3中的結(jié)果。相比未改性的酪蛋白酸鈉，棕櫚烷基-酪蛋白酸鈉 衍生物具有更優(yōu)的復(fù)載脂溶性橙皮苷的能力。
[0331]在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一種經(jīng)改性的蛋白或其鹽，其特征在于，所述經(jīng)改性的蛋白包括： 可食用蛋白，所述可食用蛋白的氨基酸序列中含有經(jīng)修飾的賴氨酸殘基和/或經(jīng)修飾 的N端氨基； 其中所述的"經(jīng)修飾的"指賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基或所述蛋白的N端氨基N此中的氨 原子被非極性烷基鏈取代基修飾，所述非極性烷基鏈為直鏈或支鏈的C12-C30的烷基。2. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)改性的蛋白，其特征在于，所述經(jīng)改性的蛋白中，所述非極性 烷基鏈的輛合度為5-15%，且所述輛合度C的計算公式如下式F1或F2: C=化 l+Nl)/(Kaii+l)X100% 化 1) 式中， K1為可食用蛋白中所述經(jīng)修飾的賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基的數(shù)目； Ν1為可食用蛋白中所述經(jīng)修飾的Ν端氨基的數(shù)目； Kail為可食用蛋白中賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε-氨基的總數(shù)； C = y/((Miysine+l) · x)X100% (F2) 式中，y是輛合到可食用蛋白中非極性烷基鏈的摩爾數(shù)，Mlysine是每摩爾可食用蛋白中 賴氨酸殘基的摩爾數(shù)，X是經(jīng)改性的可食用蛋白的摩爾數(shù)。3. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)改性的蛋白，其特征在于，所述經(jīng)改性的蛋白具有式I所示結(jié) 構(gòu)：式中， R為非極性烷基鏈取代基 化為可食用蛋白； 其中，一個Pr上可連接有一個或多個R-CO-NH-基團。4. 如權(quán)利要求1所述的經(jīng)改性的蛋白，其特征在于，所述經(jīng)改性的蛋白的疏水性指數(shù)大 于未經(jīng)改性的可食用蛋白的疏水性指數(shù)。5. -種納米粒子，其特征在于，所述納米粒子由權(quán)利要求1所述的經(jīng)改性的蛋白或其鹽 自組裝形成，且所述納米粒子中任選地包含裝載于其中的脂溶性活性成分。6. 如權(quán)利要求5所述的納米粒子，其特征在于，所述納米粒子具有選自下組的一個或多 個特征： 1) 所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的水分散性好； 2) 所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的粒徑為lO-lOOOnm; 3) 所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的多分散指數(shù)PDI含0.25; 4) 所述納米粒子(或凍干再分散后的納米粒子)的ζ電位為-40mV~+40mV。7. -種權(quán)利要求1所述經(jīng)改性的蛋白或其鹽的制備方法，其特征在于，包括步驟： 1) 提供第一混合液，所述第一混合液包含未經(jīng)改性的可食用蛋白、N-班巧酷亞胺醋和 任選的第一溶劑； 2) 在攬拌條件下，所述第一混合液反應(yīng)得到第二混合液； 3) 離屯、處理步驟2)所得第二混合液，取上清液； 4)透析處理步驟3)所得上清液，得到權(quán)利要求1所述經(jīng)改性的蛋白。8. -種權(quán)利要求5所述納米粒子的制備方法，其特征在于，包括步驟： a) 提供混合液A，所述混合液A包含權(quán)利要求1所述的經(jīng)改性的蛋白、任選的脂溶性活性 成分和任選的第二溶劑； b) 在攬拌條件下，所述混合液A自組裝反應(yīng)得到包含權(quán)利要求5所述納米粒子的混合液 B； C)透析處理步驟b)所得混合液B，得到經(jīng)透析處理的混合液； d)任選地離屯、處理步驟C)所得經(jīng)透析處理的混合液，取上清液，制得權(quán)利要求5所述納 米粒子。9. 一種權(quán)利要求1所述的經(jīng)改性的蛋白的用途，其特征在于，用于選自下組的用途： 1) 用于裝載脂溶性食品活性成分； 2) 用于裝載難溶性藥物。10. -種制品，其特征在于，所述制品包含權(quán)利要求1所述改性蛋白或權(quán)利要求5所述的 納米粒子，或由權(quán)利要求1所述改性蛋白或權(quán)利要求5所述的納米粒子制成。
【文檔編號】A23L33/19GK105837677SQ201610237860
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】張亞瓊, 姚芳懿
【申請人】上海交通大學(xué)