專(zhuān)利名稱(chēng)：抗hiv-1外膜嵌合蛋白的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到抗HIV-1外膜蛋白的單克隆抗體及其制備。
背景技術(shù)：
艾滋病(AIDS)目前已成為威脅人類(lèi)健康和社會(huì)穩(wěn)定發(fā)展最重要的感染性疾病之一。自從 20世紀(jì)80年代早期首次報(bào)道該病例以來(lái)，人們對(duì)于它的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)進(jìn)行了相當(dāng)深入的研 究。自從AIDS發(fā)現(xiàn)迄今已有20年仍沒(méi)有一種有效預(yù)防性疫苗，HIV對(duì)研制疫苗不利的特點(diǎn) 最主要是無(wú)法刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的中和抗體和特異的細(xì)胞免疫，所以，HIV-1感染的預(yù)防和 控制對(duì)人類(lèi)來(lái)說(shuō)仍然是一個(gè)未解的難題。HIV-1為單鏈RNA病毒，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科 (Retroviridae)，慢病毒亞科(Lentivirus)。該病毒為圓形或橢圓形，直徑約90-140nm，外 層為類(lèi)脂包膜，表面有鋸齒樣突起，內(nèi)有圓柱狀核心，病毒的包膜是糖蛋白gpl60(由gpl20 和gp41組成)，為該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其中g(shù)pl20為外膜蛋白，gp41為跨膜蛋白 (trans-membran印rotein) 。 gpl20與CD4結(jié)合后相互作用，引起gpl20發(fā)生一系列構(gòu)象變化， 進(jìn)而形成高親和力的CCR5/CXCR4結(jié)合位點(diǎn)，協(xié)助HIV-1進(jìn)入宿主細(xì)胞。目前的許多研究表明， 針對(duì)該病毒的中和表位主要存在于gpl60。血液中存在HIV的抗體是機(jī)體被HIV感染的標(biāo)志， 也是目前血清學(xué)檢測(cè)HIV感染的依據(jù)。研究表明主要針對(duì)包膜蛋白前體(HIV-lgpl60)及 其后加工產(chǎn)物一外膜 唐蛋白(HIV-lgp120)和跨膜糖蛋白(HIV-lgp41)產(chǎn)生的抗體在人體感 染后不久便可以出現(xiàn)并可維持終生，而且?guī)缀醭霈F(xiàn)在所有感染者的血清中，Erw蛋白成為免 疫學(xué)診斷的首選抗原。由于Erw蛋白較大，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)會(huì)比較困難，因此我們打 算選擇幾段抗原區(qū)進(jìn)行嵌合表達(dá)，以提高免疫原性。另外，單克隆抗體的制備所需要抗原的 純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。
gpl20上有細(xì)胞病毒受體CD4分子的結(jié)合位點(diǎn)及多個(gè)免疫反應(yīng)決定簇，其中V1、 V2、 V3， 尤其是V3區(qū)的頂端轉(zhuǎn)角區(qū)域，含有主要的抗原決定簇，可誘導(dǎo)中和抗體和CTL反應(yīng)。V4與 V5環(huán)之間的C4區(qū)是結(jié)合CD4分子的主要區(qū)域，這是外膜蛋白上另一個(gè)重要的中和部位，由 其誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能與大多數(shù)毒株具有交叉中和作用。其它保守區(qū)(如C2、 C3、 C5甚至C1) 均含有與CD4結(jié)合作用有關(guān)的區(qū)域。從氨基酸序列比對(duì)可知469-511aa位于印12Q的C4區(qū)，
3因此我們選擇了這一段保守性和抗原性都很強(qiáng)的區(qū)域。包膜蛋白上的C5區(qū)(538-576)，是 gpl20蛋白的C-末端區(qū)，此處氨基酸序列相對(duì)保守，577-600aa屬于gp41 N-端區(qū)域，在gpl20
和gp4i的交界區(qū)含有的46個(gè)氨基酸殘基不僅含有大量的e轉(zhuǎn)角，而且親水性相當(dāng)好，加之
保守程度高，因而被認(rèn)為是高免疫原性區(qū)，針對(duì)該區(qū)域的抗體代表了免疫印跡所能檢測(cè)的幾 乎所有g(shù)pl20的抗體，而且與感染者的臨床癥狀無(wú)關(guān)，根據(jù)該區(qū)段設(shè)計(jì)合成的多肽能檢測(cè)出 高達(dá)90%的HIV-1陽(yáng)性血清。鑒于gp41的序列保守性比gpl20強(qiáng)，含有多個(gè)B細(xì)胞抗原表 位，針對(duì)gp41的基因序列可以具有更廣泛的特異性，在HV檢測(cè)中也作為一項(xiàng)指標(biāo)。
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到抗HTV-1外膜蛋白的單克隆抗體，利用選定 的抗原表位，然后再根據(jù)抗原的免疫原性去誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生。用己經(jīng)確定的抗原位點(diǎn)制備單 克隆抗體， 一方面是操作簡(jiǎn)便，位點(diǎn)分析明確；另一方面是某些小抗原的抗原性很強(qiáng)，單獨(dú) 與抗體就會(huì)有很強(qiáng)的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。本發(fā)明通過(guò)原核表達(dá)體系，選擇469-511aa， 538-674aa， 700-734aa這三處抗原位點(diǎn)較多，免疫原性較強(qiáng)的區(qū)域，表達(dá)抗原，得到檢測(cè)靈 敏度高、特異性好優(yōu)勢(shì)抗原用于制備抗HIV-1外膜蛋白的單克隆抗體。構(gòu)建抗HIV-1單克隆 抗體，進(jìn)一步用于HIV-l感染的診斷和治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是編碼HIV—1外膜蛋白的二段基因和由此推斷的氨基酸序列；提供含有所 表述的HIV—1外膜基因的表達(dá)載體和利用該載體轉(zhuǎn)化的工程菌株；同時(shí)提供所表述的工程菌 制備重組HIV—1外膜蛋白的過(guò)程，提供制備抗HIV-1外膜蛋白的單克隆抗體的過(guò)程。
本發(fā)明的是編碼HIV—1外膜蛋白的469-511aa， 538-674aa， 700_734aa這三處抗原位點(diǎn) 較多，免疫原性較強(qiáng)的區(qū)域的基因，該基因由630個(gè)堿基組成。 HIV—1外膜蛋白的三段基因的核苷酸序列為
HIV—1外膜嵌合蛋白的三段基因的核苷酸序列為
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上述HIV--l外膜嵌合蛋白的三段基因的氨基酸序列為
MetArgAspAsnTrpArgSerGluCeuTyrCysTyrLysValValLys
TieGluProLeuGlyValAlaProThrLysAlaLysArgArgValVal
GinArgGlyLysArgAlaValGlylieGlySerArgGinLeuLeuSer
GlylieValGinVlnVlnAsnAsnLeuLeuArgAlalieGluAlaGin
GinHisLeuLeuGinLeuThrValTrpGlylieLysGinLeuGinAla
ArglieLeuAlaValGluArgTyrLeuLysAspGinGinLeuLeuGly
lieTrpGlyCysSerGlyLysLeulieCysThrThrAlaValProTrp
AsnAlaSerTrpSerAsnLysSerLeuGluGinlieTrpAsnHisThr
ThrTrpMetGluTrpAspArgGlulieAsnAsnTyrThrSerLeulie
HisSerLeulieGluGluSerGinAsnGinGinGluLysAsnGluGin
GluLeuLeuGluLeuAspLysTrpAlaSerCeuTrpAsnTrpPheAsn
lieThrAsnTrpLeuValAsnArgValArgGinGlyTyrSerProLeu
SerPheGinThrHisLeuProThrProArgGlyProAspArgProGlu
Gly *
(*終止密碼子) HIV—1外膜蛋白的制備方法包括以下步驟 第一步HIV—l外膜基因的獲得
選擇Env蛋白的組成氨基酸的疏水性、潛在的抗原表位以及與其它亞型的Env蛋白在氨 基酸組成上的保守性程度，選擇免疫原性較強(qiáng)的區(qū)域，該基因由630個(gè)堿基組成。三段基因 經(jīng)PCR引入的酶切位點(diǎn)后連接到T-easy載體中。
第二步HIV — l外膜基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建
T-easy經(jīng)酶切后回收外源基因片段，將外源基因片段與載體pRSET B在T4 DNA連接酶 的作用下連接。獲得重組質(zhì)粒pRSET B-朋y。 第三步HIV—l外膜蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
5將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pRSETB —朋y轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn) 化菌株為BL21-e/ K。
第四步HIV—1外膜蛋白的純化
pRSET B表達(dá)的融合蛋白N-端為6個(gè)連續(xù)的組氨酸(His)，利用多聚組氨酸與過(guò)渡態(tài)金 屬(M + 、 Zn十+ 、 Cu +十等)的高親和力結(jié)合，可使用金屬離子配體親和層析進(jìn)行快速純 化表達(dá)的蛋白。
第五步制備重組的單克隆抗體
選擇免疫8周齡的BALB/c健康小鼠，經(jīng)脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合獲得穩(wěn)定分泌抗Env蛋 白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
通過(guò)基因工程獲得的HIV-1外膜嵌和蛋白，具有良好的疫原性，在檢測(cè)HIV陽(yáng)性血清時(shí)， 特異性和準(zhǔn)確性均達(dá)到100%，說(shuō)明抗原在檢測(cè)陽(yáng)性樣品時(shí)結(jié)果比較好、抗原覆蓋率較高。 同目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上的HIV檢測(cè)產(chǎn)品比較，具有成本低，靈敏度高，檢測(cè)快的特點(diǎn)。由此抗 原制備的抗HIV-1外膜嵌和蛋白單克隆抗體，可以進(jìn)一步用于HIV-1感染的診斷和治療，特別 是HIV-1的導(dǎo)向治療，將HIV-1抗原的單克隆抗體與化療藥物，利用單克隆抗體的導(dǎo)向作用， 將藥物攜帶至靶器官，直接殺傷靶細(xì)胞因此，制備HIV-1單克隆抗體是一種極具應(yīng)用潛力的 抗體形式。
抗HIV-1外膜蛋白的單克隆抗體，可以用基因工程手段發(fā)酵生產(chǎn)，價(jià)格低，易于普及應(yīng) 用，可進(jìn)一步用于HIV-1感染的診斷和治療。


附圖為SDS-PAGE分析Env蛋白的蛋白的表達(dá)
1. 通過(guò)Ni-sepharose 4B金屬M(fèi)螯合層析柱分離純化目的蛋白；
2. 分子量標(biāo)準(zhǔn).
具體實(shí)施方案
本發(fā)明的實(shí)施包括以下內(nèi)容
第一步HIV—1外膜嵌合基因的獲得
我們用計(jì)算機(jī)分析了 Env蛋白的組成氨基酸的疏水性、潛在的抗原表位以及與其它亞型 的Env蛋白在氨基酸組成上的保守性程度，以此作為選擇三段抗原的理論依據(jù)。選擇HIV—1 外膜蛋白的469-511aa， 538-674aa， 700-734aa這三處抗原位點(diǎn)較多，免疫原性較強(qiáng)的區(qū)域，該基因由630個(gè)堿基組成。
第二步HIV—1外膜基因的原核表達(dá)載體的構(gòu)建
連入T-easy載體上的三段抗原通過(guò)PCR引入酶切位點(diǎn)，以T-easy-e/7K質(zhì)粒 為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增出630bp左右的目的片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連入pGEM—Teasy 載體，藍(lán)白斑篩選，挑白斑提質(zhì)粒后用5"s7I/vTp/7l雙酶切鑒定。質(zhì)粒經(jīng)作用后回 收外源基因片段，pRSET B用Sacl和7TpM雙酶切，在T4 DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。得 到正確的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pRSET B —朋k,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。
第三步HIV—1外膜蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
含有pRSETB—e/ F重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (star)，經(jīng)工PTG (終濃度為lmM)誘導(dǎo)后， 上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量的目的蛋白是以不可溶的包涵體形式存 在，只有少量的目的蛋白是以可溶的形式存在于菌體破碎離心后的上清液里,蛋白的分子量約 為33KD。為了進(jìn)一步確定蛋白的特異性，以HIV-1陽(yáng)性病人血清為一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記 的羊抗人抗體為二抗，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western Blot分析，得到的特異性蛋白的分子量約 為33kD的蛋白，從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嵌合抗原是可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，表達(dá)量高且 蛋白具有特異性。
第四步HIV—1外膜蛋白的純化
pRSET B表達(dá)的融合蛋白N-端為6個(gè)連續(xù)的組氨酸(His)，利用多聚組氨酸與過(guò)渡態(tài)金 屬(Ni + 、 Zn+ + 、 Cu +十等)的高親和力結(jié)合，可使用金屬離子配體親和層析進(jìn)行快速純 化。應(yīng)用Ni-NTA s印harose金屬Ni螯合層析介質(zhì)，對(duì)其目的蛋白進(jìn)行純化，純化后的蛋白 用考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果表明蛋白表達(dá)量高，純化效果好。附圖見(jiàn)附頁(yè)。
第五步制備抗人erw的單克隆抗體
純化的重組Env蛋白30ng免疫8周齡雌性的BALB/c健康小鼠，分別在14天、35天以 等量抗原免疫，第48天用間接ELISA法檢測(cè)鼠尾血，對(duì)免疫好的鼠在第56天加強(qiáng)免疫，三 天后取其脾細(xì)胞進(jìn)行融合，首次使用弗氏完全佐劑，其余使用不完全佐劑。
將免疫鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞按5: l混合，1200rpm離心5min，棄上清，置37"水 浴中，加入lml PEG使細(xì)胞彼此融合。隨后用50ml預(yù)熱RPMI1640不完全培養(yǎng)稀釋。8Q0rpm 離心5min，棄上清，加入足量的HAT培養(yǎng)基重新懸浮，置37。C培養(yǎng)，IO天換新鮮的HAT培養(yǎng) 基，12天改用HT培養(yǎng)基，15天改用完全培養(yǎng)基，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測(cè)抗體含量。首 先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，爾后進(jìn)行抗原特異的 ELISA測(cè)定，選高分泌特異性細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存。
權(quán)利要求
1、抗HIV-1外膜嵌合蛋白的單克隆抗體，其特征是在HIV—1外膜蛋白的469-511aa，538-674aa，700-734aa這三處抗原位點(diǎn)較多，免疫原性較強(qiáng)的區(qū)域的基因，該基因由630個(gè)堿基組成，HIV—1外膜嵌合蛋白的三段基因的核苷酸序列為atg agg gac aat tgg aga agt gaa tta tat aaa tat aaa gta gta aaa 48att gaa cca tta gga gta gca ccc acc aag gca aag aga aga gtg gtg 96cag aga gga aaa aga gca gtg gga ata gga tct aga caa ttg ttg tct 144ggt ata gtg cag cag cag aac aat ttg ctg agg gct att gag gcg caa 192cag cat ctg ttg caa ctc aca gtc tgg ggc atc aag cag ctc cag gca 240aga atc ctg gct gtg gaa aga tac cta aag gat caa cag ctc ctg ggg 288att tgg ggt tgc tct gga aaa ctc att tgc acc act gct gtg cct tgg 336aat gct agt tgg agt aat aaa tct ctg gaa cag att tgg aat cac acg 384acc tgg atg gag tgg gac aga gaa att aac aat tac aca agc tta ata 432cac tcc tta att gaa gaa tcg caa aac cag caa gaa aag aat gaa caa 480gaa tta ttg gaa tta gat aaa tgg gca agt ttg tgg aat tgg ttt aac 528ata aca aat tgg ctg gtg aat aga gtt agg cag gga tat tca cca tta 576tcg ttt cag acc cac ctc cca acc ccg agg gga ccc gac agg ccc gaa 624gga tag 630上述HIV—1外膜嵌合蛋白的三段基因的氨基酸序列為Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val LysIle Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg Val ValGln Arg Gly Lys Arg Ala Val Gly Ile Gly Ser Arg Gln Leu Leu SerGly Ile Val Gln Vln Vln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala GlnGln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln AlaArg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu GlyIle Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro TrpAsn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His ThrThr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser LeuIleHis Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu GlnGlu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe AsnIle Thr Asn Trp Leu Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro LeuSer Phe Gln Thr His Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro GluGly**終止密碼子。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到抗HIV-1外膜嵌合蛋白的單克隆抗體及其制備。根據(jù)蛋白的疏水性和保守性分析選定抗原基因，再根據(jù)抗原的免疫原性去誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體，用已經(jīng)確定的抗原位點(diǎn)制備單克隆抗體。一是操作簡(jiǎn)便，位點(diǎn)分析明確；二是某些小抗原的抗原性很強(qiáng)，單獨(dú)與抗體就會(huì)有很強(qiáng)的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)。本發(fā)明選擇HIV-1外膜基因的三處抗原位點(diǎn)較多，免疫原性較強(qiáng)的區(qū)域，通過(guò)原核表達(dá)體系表達(dá)抗原蛋白，得到檢測(cè)靈敏度高、特異性好優(yōu)勢(shì)抗原用于制備抗HIV-1外膜嵌合蛋白的單克隆抗體?？笻IV-1外膜蛋白的單克隆抗體，可以用基因工程手段發(fā)酵生產(chǎn)，價(jià)格低，易于普及應(yīng)用，可進(jìn)一步用于HIV-1感染的診斷和治療。
文檔編號(hào)C07K16/08GK101440129SQ200810051640
公開(kāi)日2009年5月27日 申請(qǐng)日期2008年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月22日
發(fā)明者維 孔, 彬 王, 王會(huì)堂, 趙麗輝 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春理工大學(xué)