一種無磷脂納米盤的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種無憐脂納米盤的制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 膜蛋白是指能夠結(jié)合或整合到細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上的蛋白質(zhì)的總稱。在所有已知 蛋白中，膜蛋白差不多占據(jù)了 40%。包括受體，通道蛋白，信號(hào)分子，是細(xì)胞通信所必需的， 其在細(xì)胞中含量豐富，膜蛋白是生物膜功能的主要執(zhí)行者，在物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞信息識(shí)別等方 面行使重要功能；如果膜蛋白功能失效，則會(huì)導(dǎo)致很多疾病。目前已知的藥物祀點(diǎn)蛋白中， 60%為膜蛋白[WallinE,VonHeijneG.Genome-wideanalysisofintegralmembrane proteinsfromeubacterial，archaean，andeukaryoticorganisms.ProteinSci.1998 ; 7:1029 - 1038;CzerskiL，SandersC.R.Anal.Biochem. 2000 :284:327. ;Hu,Y.，Y.Li,X. Zhang,X.Guo,B.Xia,andC.Jin. 2006.Solutionstructuresandbackbonedynamicsof aflavodoxinMioCfromEscherichiacoliinbothapo-andholo-forms.J.Biol. Chem. 281:35454 - 35466.]。
[0003] 在體外，膜蛋白需要維持脂雙層膜或類脂環(huán)境才可W保持其活性狀態(tài)，運(yùn)對(duì)于膜 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究，藥物的開發(fā)和篩選都是及其重要的。但在體外很難模擬運(yùn)種環(huán)境。
[0004] 憐脂納米盤（NanodiSC)是由高密度脂蛋白發(fā)展而來的用于膜蛋白研究的新型類 膜結(jié)構(gòu)，該體系采用雙親性蛋白在水相中穩(wěn)定憐脂分子，從而形成憐脂雙層膜的類細(xì)胞膜 結(jié)構(gòu)，整合進(jìn)入其中的膜蛋白可W在近似天然膜環(huán)境中保持生物活性，從而為進(jìn)一步研究 提供了平臺(tái)。組裝憐脂納米盤（Nanodisc)時(shí)，首先將膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafTold Protein,MS巧按照比例與預(yù)先溶解在去污劑（通常是膽酸鋼）中的憐脂混合。經(jīng)一定時(shí) 間解育，利用透析或疏水吸附劑，如Bio-BeadsSM-2度io-Rad，Hercules,CA)去除去污劑， 自組裝形成憐脂納米盤（Nanodisc)陽athA.,AtkinsW.M.,SligarS.G.Applicationsof phospholipidbilayernanodiscsinthestudyofmembranesandmembraneproteins. Biochemistry. 2007 :46:2059 - 2069. ]D組裝包含膜蛋白的5葬脂納米盤（Nanodisc)只需在 體系中再加入適量膜蛋白。離子通道蛋白，GPCRs，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞色素P450等膜蛋白已 成功的與憐脂納米盤（Nanodisc)組裝起來該體系還具有可溶，穩(wěn)定和尺寸可控等優(yōu)點(diǎn)。因 此，憐脂納米盤（Nanodisc)體系將會(huì)成為膜蛋白研究的重要載體。 陽〇化]然而傳統(tǒng)的制備方法組裝步驟比較繁瑣，并且會(huì)造成蛋白質(zhì)的損失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種無憐脂納米盤的制備方法，W解決上述問題。
[0007] 本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0008] 一種無憐脂納米盤的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
[0009] 步驟一、在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑；
[0010] 步驟二、在完成膜蛋白純化后，加入膜蛋白骨架蛋白，用混勻器混勻，恒溫解育預(yù) 定時(shí)間；
[0011] 步驟=、經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明的無憐脂納米盤的制備方法，還可W具有運(yùn)樣的特征：其中，所述 膜蛋白骨架蛋白為ApolipoproteinA-1，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，其編碼基因序 列如沈QIDNO. 2所示。
[0013] 進(jìn)一步，本發(fā)明的無憐脂納米盤的制備方法，還可W具有運(yùn)樣的特征：其中，所述 類憐脂去污劑為FOS-CHOLI肥，其C鏈含有8-16個(gè)C。
[0014] 進(jìn)一步，本發(fā)明的無憐脂納米盤的制備方法，還可W具有運(yùn)樣的特征：其中，所述 膜蛋白和所述膜蛋白骨架蛋白的摩爾比為1:2-1:20。
[0015] 進(jìn)一步，本發(fā)明的無憐脂納米盤的制備方法，還可W具有運(yùn)樣的特征：其中，所述 恒溫解育的溫度為0-37°C。
[0016] 較佳的，本發(fā)明的無憐脂納米盤的制備方法，還可W具有運(yùn)樣的特征：其中，所述 恒溫解育的溫度為4-20°C。
[0017] 進(jìn)一步，本發(fā)明的無憐脂納米盤的制備方法，還可W具有運(yùn)樣的特征：其中，所述 預(yù)定時(shí)間為1-化。
[0018] 發(fā)明的有益效果
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的無憐脂納米盤的制備方法，由于直接采用類憐脂去污劑提純膜蛋 白，然后在膜蛋白純化后加入膜蛋白骨架蛋白，因此免去了憐脂納米盤（NanodiSC)制 備過程中預(yù)先將憐脂溶解在去污劑（通常是膽酸鋼）中，將膜蛋白骨架蛋白（Membrane ScafToldProtein,MS巧按照比例與預(yù)先溶解在去污劑（通常是膽酸鋼）中的憐脂混合W 及利用透析或疏水吸附劑，如Bio-BeadsSM-2度io-Rad，Hercules,CA)去除去污劑運(yùn)S個(gè) 步驟。使得無憐脂納米盤的制備步驟大大簡化，同時(shí)還避免了膜蛋白的損失。
【附圖說明】
[0020] 圖1是實(shí)施例S得到的無憐脂納米盤的電鏡照片。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 為了本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體 實(shí)施例進(jìn)行闡述。W下各實(shí)施例所用的試劑，如無特別說明，則均可通過公開的商業(yè)渠道購 買而獲取。W下各實(shí)施例所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，則均按照生物學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)方 法進(jìn)行。 W22] 實(shí)施例一
[0023] 在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑化S-化01ine-8，在完成膜蛋白純化后，加入 膜蛋白骨架蛋白MembraneScafToldProtein(MSP)。反應(yīng)溶液中膜蛋白和膜蛋白骨架蛋 白的摩爾比為1 :2,用混勻器混勻，4°C恒溫解育比，經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集 所得產(chǎn)物，通過透射電鏡觀察所得產(chǎn)物呈現(xiàn)圓盤狀結(jié)構(gòu)，直徑5-10皿?；疭-化oline-8的 碳鏈含有8個(gè)C。膜蛋白純化所述使用的細(xì)胞有兩類，分別是：昆蟲細(xì)胞：如S巧或者化曲 Five;或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞：如293F。運(yùn)幾種細(xì)胞均可通商業(yè)渠道購買得到。當(dāng)然，也可W使 用本領(lǐng)域常用的其它種類的細(xì)胞作為膜蛋白的來源。化S-化oline-14的碳鏈含有14個(gè)C。 W24] 實(shí)施例二
[00巧]在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑化S-化oline-10,在完成膜蛋白純化后， 加入膜蛋白骨架蛋白。摩爾比為1 :6,用混勻器混勻，8°C恒溫解育化，經(jīng)分子篩和親和層 析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物，通過透射電鏡觀察所得產(chǎn)物呈現(xiàn)圓盤狀結(jié)構(gòu)，直徑5-10皿。 化S-Choline-IO的碳鏈含有10個(gè)C。 陽0%] 實(shí)施例S
[0027] 在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑化S-化oline-14,在完成膜蛋白純化后，加 入膜蛋白骨架蛋白。膜蛋白和膜蛋白骨架蛋白的摩爾比為1 :8,用混勻器混勻，4°C恒溫解 育化，經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物。通過透射電鏡觀察所得產(chǎn)物呈現(xiàn)圓 盤狀結(jié)構(gòu)，直徑5-lOnm。如圖1所示，圖中箭頭A所指處即為使用本實(shí)施方式制備得到的納 米盤之一。 陽0測實(shí)施例四
[0029] 在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑化S-化oline-12,在完成膜蛋白純化后，加 入膜蛋白骨架蛋白。摩爾比為1 :1〇,用混勻器混勻，10°c恒溫解育化，經(jīng)分子篩和親和層 析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物，通過透射電鏡觀察所得產(chǎn)物呈現(xiàn)圓盤狀結(jié)構(gòu)，直徑5-lOnm。 化s-Choline-12的碳鏈含有12個(gè)Co W30] 實(shí)施例五
[0031] 在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑化S-化oline-14,在完成膜蛋白純化后，加 入膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafToldProtein,MSP)。摩爾比為1:12,用混勻器混勻， 12°C恒溫解育化，經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物，通過透射電鏡觀察所得 產(chǎn)物呈現(xiàn)圓盤狀結(jié)構(gòu)，直徑5-10皿?；疭-化oline-14的碳鏈含有14個(gè)C。 陽0巧 實(shí)施例六
[0033] 在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑化S-化oline-16,在完成膜蛋白純化后，加 入膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafToldProtein,MSP)。摩爾比為1:16,用混勻器混勻， 16°C恒溫解育化，經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物，通過透射電鏡觀察所得 產(chǎn)物呈現(xiàn)圓盤狀結(jié)構(gòu)，直徑5-10皿。化S-化oline-16的碳鏈含有16個(gè)C。 W34] 實(shí)施例屯
[0035] 在膜蛋白純化階段加入類憐脂去污劑化S-化oline-14,在完成膜蛋白純化后，加 入膜蛋白骨架蛋白（MembraneScafToldProtein,MSP)。摩爾比為1:20,用混勻器混勻， 20°C恒溫解育地，經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物，通過透射電鏡觀察所得 產(chǎn)物呈現(xiàn)圓盤狀結(jié)構(gòu)，直徑5-10皿?；疭-化oline-14的碳鏈含有14個(gè)C。
[0036]W上各實(shí)施例中，ApolipoproteinA-I是指：載脂蛋白A-I。
[0037] FOS-CHOLI肥是指：F0S-CH0LIN是個(gè)商品名，是運(yùn)一類去污劑的統(tǒng)稱。其中，F(xiàn)OS-CHOLI肥-12 :十二烷基憐酸膽堿；FOS-CHOLI肥-8:辛基憐酸膽堿；FOS-CHOLI肥-14: 十四烷基憐酸膽堿；FOS-CHOLI肥-10癸基憐酸膽堿。
[0038]


【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 步驟一、在膜蛋白純化階段加入類磷脂去污劑； 步驟二、在完成膜蛋白純化后，加入膜蛋白骨架蛋白，用混勻器混勻，恒溫孵育預(yù)定時(shí) 間； 步驟三、經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物。2. 如權(quán)利要求1所述的無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于： 其中，所述膜蛋白骨架蛋白為ApolipoproteinA-Ι，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示， 其編碼基因序列如SEQIDNO. 2所示。3. 如權(quán)利要求1所述的無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于： 其中，所述類磷脂去污劑為F0S-CH0LINE，其C鏈含有8-16個(gè)C。4. 如權(quán)利要求1所述的無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于： 其中，所述膜蛋白和所述膜蛋白骨架蛋白的摩爾比為1:2-1:20。5. 如權(quán)利要求1所述的無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于： 其中，所述恒溫孵育的溫度為0-37 °C。6. 如權(quán)利要求5所述的無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于： 其中，所述恒溫孵育的溫度為4-20°C。7. 如權(quán)利要求1所述的無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于： 其中，所述預(yù)定時(shí)間為l-6h。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種無磷脂納米盤的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟一、在膜蛋白純化階段加入類磷脂去污劑；步驟二、在完成膜蛋白純化后，加入膜蛋白骨架蛋白，用混勻器混勻，恒溫孵育預(yù)定時(shí)間；步驟三、經(jīng)分子篩和親和層析純化后濃縮，收集所得產(chǎn)物。本發(fā)明的方法省去了傳統(tǒng)方法中，將磷脂溶解在去污劑中、將膜蛋白骨架蛋白按照比例與預(yù)先溶解在去污劑中的磷脂混合以及利用透析或疏水吸附劑去除去污劑這三個(gè)步驟。使得無磷脂納米盤的制備步驟大大簡化，同時(shí)還避免了膜蛋白的損失。
【IPC分類】C07K14/705, C07K1/22
【公開號(hào)】CN105294855
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510824261
【發(fā)明人】沈堅(jiān), 郭政, 李衛(wèi)華, 金美辰, 蘇曉燕, 韓敏, 李子娟, 錢冬明, 蔡建華, 任德林, 毛晨
【申請(qǐng)人】維亞生物科技(上海)有限公司
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月24日