一種降低牛乳蛋白βLG免疫反應(yīng)性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種降低牛乳蛋白0LG免疫反應(yīng)性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳品加工，熱處理的主要目的是通過(guò)滅菌延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。其主要參數(shù)工業(yè)：加 熱溫度和加熱時(shí)間。為了保持牛奶營(yíng)養(yǎng)，熱處理有不同的方法。因?yàn)榕Ｄ虖?fù)雜的組合物，不 同的熱處理牛奶的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的機(jī)制出性質(zhì)的變化熱處理的不同影響復(fù)雜。目前，如何 改變牛奶的致敏機(jī)制熱處理不是很清楚。
[0003]PLG具有熱穩(wěn)定性，熱治療期間的變化是非常復(fù)雜的，會(huì)加快蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在高 溫松動(dòng)，并可能導(dǎo)致內(nèi)部蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)暴露，琉可能發(fā)生硫醇基之間的二硫鍵和成彼 此的聚合物內(nèi)的分子和分子間的非共價(jià)鍵和共價(jià)鍵的相互作用 。運(yùn)種聚合物在一定程度上可能消除并覆蓋PLG蛋白質(zhì)過(guò)敏的表位，因此，它減少了 過(guò)敏性。同時(shí)，在牛奶系統(tǒng)中，加熱也可W使收集PLG和QLA和CNS-起發(fā)生，也可W收 集使蛋白質(zhì)的表位被掩蔽，從而降低過(guò)敏PLG。
[0004] 乳品加工己氏殺菌是必要的鏈接導(dǎo)致改變加熱0LG結(jié)構(gòu)，而其生理功能它也可 引起損壞：無(wú)行為能力的蛋白質(zhì)結(jié)合的疏水性分子，如維生素A;牛奶感官品質(zhì)也有不好的 影響(如"烹調(diào)味道")。因此，如果過(guò)度熱處理可能會(huì)導(dǎo)致奶PLG的變性而蛋白質(zhì)功能的喪 失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種降低牛乳蛋白0LG 免疫反應(yīng)性的方法的技術(shù)方案。
[0006] 所述的一種降低牛乳蛋白PLG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于在抑2-10條件 下，將PLG和EGCG結(jié)合。
[0007] 所述的一種降低牛乳蛋白0LG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于0LG在溫度120°C 預(yù)熱后，在抑2-10下將0LG和EGCG結(jié)合。
[0008] 所述的一種降低牛乳蛋白0LG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于用抑為2-10的 PBS溶劑，將0LG稀釋為1%，再與摩爾比為1 :50的EGCG在25°C下水浴比。
[0009] 所述的一種降低牛乳蛋白0LG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于用抑為2-10的 PBS溶劑，將0LG稀釋為1%，在120°C下油浴lOmin，再與摩爾比為1 :50的EGCG在25°C下 水浴比。
[0010] 所述的一種降低牛乳蛋白0LG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于抑為4. 5-6. 4。
[0011] 所述的一種降低牛乳蛋白PLG免疫反應(yīng)性的方法，其特征在于PLG和EGCG結(jié)合 后在4°C下用SkDa半透膜對(duì)反應(yīng)后樣品進(jìn)行透析過(guò)夜，除去沒(méi)有結(jié)合的EGCG。
[0012] 本發(fā)明為降低牛乳蛋白PLG免疫反應(yīng)提供了一種新的方法，其W更有效，更合理 地利用牛奶蛋白，為低過(guò)敏性的乳制品發(fā)展的新思路路和理論支持。

【具體實(shí)施方式】
[0014] W下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。 實(shí)施例
[001引1PLG多克隆抗體的制備與鑒定 1.1實(shí)驗(yàn)方法 1.1.1多克隆抗體制備： 將2只3個(gè)月、體重1. 5公斤的純種新西蘭大白兔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。連續(xù)=天確定正常身體 狀況后進(jìn)行免疫。在幾十微克到十微克每千克體重范圍內(nèi)設(shè)置免疫劑量，經(jīng)皮膚和肌肉注 射抗原。首次免疫時(shí)將抗原溶于弗氏不完全佐劑和生理鹽水乳化后免疫。分別在第3、4、5、 6次免疫后十天，通過(guò)兔子耳朵邊緣靜脈取血進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。血清抗體達(dá)到一定程度后由 頸動(dòng)脈取全血，離屯、取血清，抗血清的純化參照DEAE-Se地aroseEF陰離子交換層析柱說(shuō)明 書(shū)，于零下二十?dāng)z氏度保存。
[0016] 1. 1. 2間接ELISA方法的建立 W天然牛乳PLG作為包被抗原，通過(guò)棋盤(pán)法(縱向包被抗原，按10, 5. 0, 2. 5,1. 25， 0.625,0. 313,0. 156,0. 078,0. 039,0. 020yg血1的濃度包被，橫向抗血清按 1 :1000,1 : 2000,1 :4000,1 :8000,1 :16000,1 :32000倍數(shù)稀釋)建立化ISA方法，W免疫前新西蘭大白 兔血清為陰性對(duì)照。用酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)450nm出的吸光值OD，取陽(yáng)性/陰性（P/N值）最大時(shí) 的抗原、抗體稀釋度作為抗原、抗體的最佳工作濃度。檢測(cè)時(shí)WP/N〉2.1 (即多克隆抗體上 清的吸光值大于陰性血清值大的2倍)判定檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，P/N值<2.1(即多克隆抗體上 清的吸光值小于陰性血清的2倍）判定檢測(cè)結(jié)果為陰性。
[0017]1.1. 3抗體效價(jià)的檢測(cè) 抗體效價(jià)用建立的間接化ISA方法測(cè)定，同時(shí)WNS-I細(xì)胞融合細(xì)胞腹水為陰性對(duì)照， 多克隆抗體的效價(jià)為WP/N值>2.1最大稀釋度。包被天然牛乳PLGlOOng/孔，4°C包 被過(guò)夜，洗板，加封閉液200yL37°C封閉2小時(shí)，洗涂3次。分別W純化后的抗0LG多 抗為一抗，W免疫前新西蘭大白兔血清作陰性對(duì)照，將多克隆抗體對(duì)倍稀釋(從1:1000稀 釋到1 :102400)加入IOOiiL/孔，37°C培育比，洗板，加入稀釋的羊抗兔IgG-HRP為二抗 100^17孔，37°(：培育45111111，洗板；加11837°(：避光顯色1〇111111;顯色后加入濃度為12.5%硫 酸50yL/孔終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光值（OD值)?？贵w的稀釋度即為抗體的效 價(jià)。
[0018] 2不同抑下0LG熱處理后與EGCG相互結(jié)合對(duì)蛋白免疫反應(yīng)性的影響 2.1實(shí)驗(yàn)方法 2. 1. 1 0LG-EGCG常溫產(chǎn)物的制備及0LG熱處理后與EGCG結(jié)合 通常情況下，牛乳中的PLG是W非共價(jià)鍵連接成二聚體，并通過(guò)氨鍵使運(yùn)種結(jié)構(gòu)達(dá)到 穩(wěn)定。不同抑值下其存在形式不同，在抑為6~6.8時(shí)，其是W二聚體的形式存在，pH高 于7. 5,二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化形成膨脹的單體，當(dāng)抑低于3. 5時(shí)，二聚體解離成單體， 抑為3. 5~5.2時(shí)，二聚體四聚化成八聚體。
[0019] 故為研究不同pH值影響下0LG-EGCG的免疫反應(yīng)性，將四個(gè)不同構(gòu)象下pH范圍 的中間值作為本研究的抑值，即抑值為2、4. 5、6. 4、10。
[0020] 分別用抑為2、4. 5、6. 4、10的PBS為溶劑，將PLG稀釋為1%，與摩爾比為1 :50 的EGCG在25°C水浴Ih;W不加EGCG的0LG為空白對(duì)照；在4°C下用SkDa半透膜對(duì)反應(yīng) 后樣品進(jìn)行透析過(guò)夜，除去沒(méi)有結(jié)合的EGCG。
[0021] 分別用抑為2、4. 5、6. 4、10的PBS為溶劑，將0LG稀釋為1%，在120°C油浴lOmin， 與摩爾比為1 :50的EGCG在25°C水浴Ih 不加EGCG的PLG為空白對(duì)照；在4°C下用5kDa 半透膜對(duì)反應(yīng)后樣品進(jìn)行透析過(guò)夜，除去沒(méi)有結(jié)合的EGCG。
[0022] 2.1.2免疫反應(yīng)性檢測(cè) 用競(jìng)爭(zhēng)法化ISA檢測(cè)不同抑下的PLG和PLG-EGCG與兔抗多克隆抗體（IgG)結(jié)合的免 疫反應(yīng)性。用碳酸鹽緩沖抗原（蛋白質(zhì)）稀釋到1yg/mL。加入100y1抗原至化ISA板上 的每個(gè)孔。在4"C下解化過(guò)夜。通過(guò)快速去掉盤(pán)中的液體來(lái)去除未結(jié)合的抗原，將離子水加 入孔中，，再次用離子水填充，洗去，重復(fù)兩次，洗緩沖區(qū)。添加200 阻斷緩沖區(qū)。在室溫 下解化（RT) 2小時(shí)。去除阻塞緩沖液，用緩沖水洗板S次。分別添加IOOrt(1:1000, 1:4000、 1:16000 1:64000,稀釋在阻止緩沖區(qū)）樣本，控制（pre-immune血清1:1000) 50Jil至孔 中，在RT解化30-60分鐘。洗板S次洗緩沖區(qū)。增加IOOWHRP-I油eled羊抗兔免疫球 蛋白g(l:5000,稀釋在阻止緩沖區(qū)）和解化為30分鐘37"C。用PBST洗緩沖區(qū)S次。將IOOrtTMB添加到每個(gè)孔，在黑暗中解化60分鐘。顯色后加入濃度為12. 5%的硫酸50yL 每孔終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光值（OD)，用化ISA儀器讀數(shù)，計(jì)算抑制率。
[0023] 抑制率=(OD未抑制一OD抑制）/ (OD未抑制一0抓Uffer)X100% 2. 1. 3圓二色光譜 參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行圓二色光譜的測(cè)定，分別將PBS調(diào)pH為2、4. 5、6. 4、10,將相應(yīng)pH的樣品稀釋為蛋白濃度為1. 5X106HiolL1的溶液，在25°C下遠(yuǎn)紫外區(qū)（190-250皿)處測(cè)定 其圓二色光譜。每個(gè)樣品重復(fù)掃描=次，獲得累計(jì)的色譜圖。圖譜經(jīng)過(guò)儀器溶液空白差減 和本底消除，數(shù)據(jù)通過(guò)在線服務(wù)器DICHROW邸分析，使用Selcon3算法計(jì)算蛋白質(zhì)的a螺 旋、P折疊、P轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比含量。
[0024] 3結(jié)果分析 3. 1多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定結(jié)果及分析 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定 通過(guò)間接化ISA法檢測(cè)所獲得的多克隆抗體的效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖1。
[00巧]
陰性血清：1 :1000兔1&兔2 <0. 2,陰性值低于0. 2,說(shuō)明整個(gè)數(shù)據(jù)具有參考性。OD值 大于1. 0,同時(shí)效價(jià)值高于陰性值的=倍W上為合格。
[0026] 抗體稀釋兔1&兔2〉1 :64000,結(jié)果表明，二者多克隆抗體的效價(jià)在1 :64000。
[0027] 棋盤(pán)法結(jié)果 表1棋盤(pán)法測(cè)試結(jié)果
取吸光值為1左右的抗原和抗體濃度比例作為最佳反應(yīng)濃度，即抗原包被濃度為 0. 313yg血1，抗血清稀釋倍數(shù)為1 :32000。
[0028] 3. 2免疫反應(yīng)性檢測(cè)結(jié)果分析 如圖2-5所示，整體而言，當(dāng)0LG與EGCG結(jié)合后，與IgG的結(jié)合活力均明顯下降，其免 疫反應(yīng)性均降低，且經(jīng)過(guò)120°C高溫加熱處理后的0LG再與EGCG反應(yīng)結(jié)合后的產(chǎn)物比沒(méi)有 經(jīng)過(guò)預(yù)熱處理的0LG和EGCG的結(jié)合產(chǎn)物大大降低其免疫反應(yīng)性。0LG和EGCG結(jié)合產(chǎn)物 與IgG結(jié)合活力比純蛋白低。
[0029] EGCG與預(yù)熱處理的PLG相互結(jié)合的結(jié)合常數(shù)
根據(jù)PLG與EGCG的熱力學(xué)分析，EGCG與eLG的結(jié)合主要疏水作用。高溫作用下蛋 白的結(jié)構(gòu)趨于松散，所W使得內(nèi)部的疏水集團(tuán)外露，可能增強(qiáng)了蛋白與EGCG的疏水作用， 從而使蛋白與EGCG的結(jié)合能力提高。
[0030] 0LG經(jīng)120°C高溫處理后，蛋白聚集發(fā)生的同時(shí)發(fā)生了蛋白構(gòu)想被