一種用于改變牛乳過敏原蛋白免疫特性的脈沖電場(chǎng)加工方法
【專利摘要】一種用于改變牛乳過敏原蛋白免疫特性的脈沖電場(chǎng)加工方法，按以下步驟：（1）制備蛋白溶液：用20mM，pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β-乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的均勻蛋白溶液；（2）將步驟（1）的β-乳球蛋溶液進(jìn)行高壓脈沖處理，條件為高壓脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度為13.33kV/cm，脈沖個(gè)數(shù)為80，樣品收到的總電脈沖處理時(shí)間為3200μs。本發(fā)明通過脈沖電場(chǎng)可以用于改變牛乳過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，以獲取特殊的或期望達(dá)到的功能性，對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)和過敏原性的影響，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，操作方便。
【專利說明】—種用于改變牛乳過敏原蛋白免疫特性的脈沖電場(chǎng)加工方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及物理加工領(lǐng)域，特別涉及一種通過非熱加工技術(shù)改變牛乳過敏原β-乳球蛋白抗原性和過敏原性方法。
【背景技術(shù)】
[0002]牛乳具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是嬰幼兒的主要食物蛋白來源。其中，β_乳球蛋白是乳清中最主要的蛋白質(zhì)之一，其含量占乳清蛋白的50%。但是，β-乳球蛋白具有耐酸和耐蛋白酶水解等特性，消化后仍有完整的β_乳球蛋白及其肽段殘存于人體內(nèi)，容易引起過敏反應(yīng)。因此，對(duì)β_乳球蛋白進(jìn)行加工處理以達(dá)到降低其致敏性具有重要意義。
[0003]牛乳是人們攝入蛋白的主要來源。鮮奶及乳制品必須經(jīng)過加工才能食用。目前用于改變牛乳過敏原蛋白β_乳球蛋白的加工方法包括生物加工、化學(xué)加工、物理加工等技術(shù)。其中，生物加工是利用基因工程技術(shù)改變過敏蛋白的基因序列；化學(xué)加工則通過酶改性和糖基化等方式改變過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到改變其致敏性的目的。然而這些技術(shù)均存在一定的局限性:β_乳球蛋白主要是以構(gòu)象性表位為主，難以通過序列變化大幅度改變構(gòu)象性表位；而β_乳球蛋白具有耐酶解特性，導(dǎo)致酶改性的效果不佳，且糖基化過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，會(huì)引起人們對(duì)食物安全性的考量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是建立一種用于改變牛乳過敏原蛋白免疫特性的脈沖電場(chǎng)加工方法，處理。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。
[0006](I)制備蛋白溶液:用20mM，pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β -乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的均勻蛋白溶液。
[0007](2)將步驟(I)的β -乳球蛋溶液進(jìn)行高壓脈沖處理，條件為高壓脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度為13.33kV/cm，脈沖個(gè)數(shù)為80，樣品收到的總電脈沖處理時(shí)間為3200 μ S。
[0008]本發(fā)明通過SDS-PAGE電泳分析其分子量的變化，并采用競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA可以判斷出過敏蛋白的抗原性和過敏原性變化。
[0009]本發(fā)明通過脈沖電場(chǎng)可以用于改變牛乳過敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，以獲取特殊的或期望達(dá)到的功能性，對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)和過敏原性的影響，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，操作方便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為電場(chǎng)強(qiáng)度為13.33kV/cm條件下，不同脈沖處理個(gè)數(shù)對(duì)β-乳球蛋白IgE結(jié)合能力的影響。
[0011 ] 圖2為脈沖個(gè)數(shù)為80條件下，不同電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)β -乳球蛋白IgE結(jié)合能力的影響?！揪唧w實(shí)施方式】
[0012]本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不受其限制。
[0013]實(shí)施例1。
[0014]1、高壓脈沖技術(shù)處理β -乳球蛋白，具體實(shí)施過程包括如下步驟。
[0015]I)配制緩沖液:稱取3.51 g磷酸氫二鈉，1.59 g磷酸二氫鈉，超純水溶解并定容至I L，配制成20 mM, pH 6.8的磷酸鹽緩沖液。
[0016]2)制備蛋白溶液:用20 mM,pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β -乳球蛋白稀釋成0.2 mg/ml的均勻蛋白溶液。
[0017]3)高壓脈沖處理:所用高壓脈沖的電場(chǎng)強(qiáng)度連續(xù)可調(diào)，雙極性方波，脈沖寬度為40 μ S，脈沖頻率為1kHz，設(shè)定電場(chǎng)強(qiáng)度為13.33kV/cm，改變樣液經(jīng)過處理腔的流速，使樣品接受處理的脈沖個(gè)數(shù)分別為40、80、120、160個(gè)；設(shè)定脈沖個(gè)數(shù)為80，然后改變電場(chǎng)強(qiáng)度為 6.67、10、13，33、16，67kV/cm。
[0018]2、SDS-PAGE分析高壓脈沖處理后的β -乳球蛋白。
[0019]采用SDS-PAGE電泳檢測(cè)高壓脈沖處理前后β _乳球蛋白分子量的變化，將脈沖處理后的β -乳球蛋白樣液與等量的上樣緩沖液相混勻，100°c水浴煮沸5min，取20uL進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳。具體實(shí)施過程包括如下步驟。
[0020]I)制備 12% 分離膠:1.2 mL 40% 凝膠貯液、1.5 mL 1.5M pH8.8 Tris-HCl,40 uL10% SDS,32 uL10% AP,400 uL 1% TEMED及1.03 mL超純水，混勻后移入制膠槽內(nèi)。然后
用超純水封口。
[0021]2)制備4%濃縮膠:分離膠凝固后，吸干上方超純水，加入150uL的40%凝膠貯液、375 uL 的 0.5M Ph6.8 Tris-HCl,15 uL 10% 的 SDS、12 uL10% 的 AP、150 uL 1% 的 TEMED 及800 uL超純水，混勻后加入槽內(nèi)，立即插入梳子。
[0022]3)上樣以及電泳:將預(yù)先準(zhǔn)備好的樣品加入上樣孔，同時(shí)加入Marker為對(duì)照。設(shè)定濃縮膠和分離膠的電流條件分別為6 mA和12 mA,時(shí)間分別為20 min和1.0 h。
[0023]4)固定與染色:電泳結(jié)束將凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染液中，時(shí)間為30min。
[0024]5)脫色:將凝膠移入脫色液中進(jìn)行脫色，蛋白條帶清晰即可停止。
[0025]6)凝膠成像:使用SQ-GS800光密度掃描儀進(jìn)行成像。
[0026]3、乳球蛋白抗原性和過敏原性變化的分析。
[0027]以高壓脈沖處理后的β -乳球蛋白溶液作為分析樣品，通過競(jìng)爭(zhēng)抑制性ELISA檢測(cè)其抗原性和過敏原性的變化。未處理蛋白作為對(duì)照，可以判斷出該過敏蛋白抗原性和過敏原性的改變，具體實(shí)施過程包括如下步驟。
[0028]I)構(gòu)建牛乳過敏患者血清池:選定11位符合既定條件的牛乳過敏患者的血清混合制備而成。這些患者的血清符合以下條件:對(duì)牛乳過敏呈陽性；總的IgE水平均>100 IU/mL ;特異性IgE水平均>1 IU/mL。
[0029]2)抗原包被:將高壓脈沖處理的β -乳球蛋白溶液稀釋至2.5 μ g /mL，在一塊酶標(biāo)板上分別包被上100 μ L，以未處理的β -乳球蛋白溶液為對(duì)照。4°C過夜后PBST洗板三次，每次5min。
[0030]3)明膠封阻:每孔加入250 μ L 3%明膠，37°C封阻lh。洗板三次。[0031]4) 一抗反應(yīng):另準(zhǔn)備一塊酶標(biāo)板以同樣的方式進(jìn)行封阻，洗滌之后，每孔加入1:20稀釋度的人血清100 μ L，37°C反應(yīng)Ih。反應(yīng)時(shí)間結(jié)束后，每孔吸取100 μ L轉(zhuǎn)移至第一塊板內(nèi)，37 °C孵育Ih，PBST洗板三次。
[0032]5)二抗反應(yīng):每孔加入1:5000稀釋度的生物素標(biāo)記羊抗人IgE 二抗100 μ L，37°C反應(yīng)lh。PBST洗板。
[0033]6)親和素反應(yīng):每孔加入1:60稀釋的HRP-鏈霉素標(biāo)記的親和素100 μ L,37°C反應(yīng)，洗板。7) OPD顯色和檢測(cè):每孔加入IOOyL現(xiàn)配制的OPD顯色液，37°C避光反應(yīng)15min，反應(yīng)結(jié)束后每孔50 μ L加入2Μ H2SO4終止液，在490nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值
8)結(jié)果的計(jì)算'IgE結(jié)合能力(%) = (1-B/B。)X 100%，B0:無競(jìng)爭(zhēng)蛋白時(shí)的OD值；B:各加工條件下競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的OD值。
[0034]經(jīng)120脈沖處理后β -乳球蛋白的條帶略微降低；經(jīng)160脈沖處理后β -乳球蛋白的條帶降低較明顯；當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度達(dá)到16.67kV/cm時(shí)，β -乳球蛋白的條帶條帶含量輕微降低。其抗原性和過敏原性變化如附圖1所示。在不同脈沖處理?xiàng)l件下，牛乳β_乳球蛋白的抗原性和過敏原性隨著脈沖個(gè)數(shù)的增加先增大后減小，在不同場(chǎng)強(qiáng)處理?xiàng)l件下，其抗原性和過敏原性則出現(xiàn)上升趨勢(shì)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于改變牛乳過敏原蛋白免疫特性的脈沖電場(chǎng)加工方法，其特征是按以下步驟: (1)制備蛋白溶液:用20mM, pH6.8的磷酸鹽緩沖液將β _乳球蛋白稀釋成0.2mg/ml的均勻蛋白溶液； (2)將步驟(I)的β-乳球蛋溶液進(jìn)行高壓脈沖處理，條件為高壓脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度為.13.33kV/cm，脈沖個(gè)數(shù)為80，樣品收到的總電脈沖處理時(shí)間為3200 μ S。
【文檔編號(hào)】A23J3/04GK103918871SQ201410148142
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】陳紅兵, 李欣, 白雨鑫, 高金燕, 何圣發(fā), 楊安樹, 吳志華, 佟平 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)