專利名稱：一種乳制品中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳制品中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
α -乳白蛋白是一種天然乳清蛋白，是必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來源，是一種能結(jié)合鈣的乳清蛋白，其成分接近人乳，不易過敏。α-乳清蛋白含有豐富的色氨酸，大量實(shí)驗(yàn)表明食用較高色氨酸含量的蛋白有助于提高血液中復(fù)合胺的釋放，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其有抗焦慮的作用。目前測(cè)定乳制品中α-乳白蛋白含量的方法有很多，如酶聯(lián)免疫法、電泳和毛細(xì)管電泳等幾種方法。但以上各種方法在測(cè)定α -乳白蛋白時(shí)都有一定的局限性，如酶聯(lián)免疫法對(duì)試劑的選擇性高，牛乳中蛋白質(zhì)種類很多，很難有效的準(zhǔn)確檢測(cè)；電泳技術(shù)在定量方面有很大的局限性；毛細(xì)管電泳重復(fù)性差，容易堵塞。以上技術(shù)上的局限性限制了這些方法在實(shí)踐中推廣應(yīng)用。因而，探尋一種成本低廉、檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、適用于復(fù)雜體系，如乳制品中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法是研究的首要問題。高效液相色譜法(HPLC)是定量分析的有效測(cè)試方法之一，與其他方法相比具有分辨率和回收率高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。但是，目前關(guān)于高效液相色譜法分析 α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法還存在著色譜峰較多，難以進(jìn)行定量分析以及分析時(shí)間過長(zhǎng)等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服了現(xiàn)有測(cè)定乳制品中α-乳白蛋白含量方法的成本高，準(zhǔn)確性較差，分析時(shí)間長(zhǎng)，樣品中α-乳白蛋白含量低時(shí)測(cè)定不準(zhǔn)確的缺陷，提供了一種乳制品中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法目標(biāo)物出峰時(shí)間短， 峰形尖銳對(duì)稱，分離度好，準(zhǔn)確性高。本發(fā)明提供了一種乳制品中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法，其包括如下步驟按照本領(lǐng)域常規(guī)方法提取乳制品中的α-乳白蛋白，再通過高效液相色譜法測(cè)定含量；所述高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱為C18色譜柱，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為 210-230nm,洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比為80 20-82 18 ；所述流動(dòng)相A是體積分?jǐn)?shù)0.05-0. 15%的三氟乙酸的超純水溶液； 所述流動(dòng)相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液；所述流動(dòng)相B中所述乙腈和超純水的體積比為320 100-480 100，優(yōu)選400 100 ；所述超純水和三氟乙酸的體積比為 100 0.4-100 0.6。其中，所述的C18色譜柱可為現(xiàn)有的各種型號(hào)和規(guī)格的C18色譜柱，如 4. 6mmX 250mm和4. 6mmX 150mm等徑長(zhǎng)規(guī)格均可適用。本發(fā)明優(yōu)選Agilent ZORBOX ECLIPSEXDB-C18 柱(4. 6mm X 250mm)。其中，所述的檢測(cè)波長(zhǎng)較佳地為215nm。其中，所述高效液相色譜法的其他色譜條件為本領(lǐng)域常規(guī)條件，優(yōu)選條件為流動(dòng)相總流速較佳地為0. 5-1. OmL/min,更佳地為0. 8mL/min ；柱溫較佳地為30_40°C，更佳地為 35 "C。其中，所述的乳制品是指本領(lǐng)域各種常規(guī)的乳制品，一般為液體乳或乳粉。所述的液體乳可以為鮮乳、殺菌乳、酸乳或配方乳。所述的乳粉可以為全脂乳粉、脫脂乳粉或配方乳粉。其中，所述的提取乳制品中的α-乳白蛋白的方法優(yōu)選下述操作方式進(jìn)行①離心脫脂將所述的乳制品離心，去除脂肪得脫脂樣品；②凈化將ρΗ值為4. 6的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品混合均勻，離心后取上
清液；③過濾過濾所述的上清液，得上機(jī)液。步驟①中，所述離心的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的離心條件和方法。所述離心的溫度較佳地為1-4°C。所述離心的速度較佳地為3500-4500轉(zhuǎn)/分鐘。所述離心的時(shí)間較佳地為10-15min。步驟①中，根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法，所述的乳制品以液態(tài)形式進(jìn)行離心，即當(dāng)所述的乳制品為液態(tài)乳時(shí)，可直接將所述的液態(tài)乳進(jìn)行離心；當(dāng)所述的乳制品為乳粉時(shí)，需將所述的乳粉與水混合得乳液，再進(jìn)行離心，乳粉與水的混合比例較佳地為Ig乳粉5mL水-Ig 乳粉15mL水。按本領(lǐng)域常識(shí)，步驟①中所述的脫脂樣品可于_20°C保存，在M小時(shí)內(nèi)進(jìn)行步驟 ②即可。步驟②中，所述醋酸鹽緩沖液中醋酸的濃度為本領(lǐng)域常規(guī)濃度，較佳地為 0.08-0. 12mol/Lo步驟②中，所述的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品的體積比較佳地為 4 1-6 1。步驟②中，所述混合均勻的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的條件和方法，較佳地用漩渦振蕩器振蕩1-aiiin。步驟②中，所述離心的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的離心條件和方法。所述離心的溫度較佳地為1-4°C。所述離心的速度較佳地為6000-8000轉(zhuǎn)/分鐘。所述離心的時(shí)間較佳地為8-10min。步驟③中，所述過濾的條件和方法為本領(lǐng)域常規(guī)的條件和方法，較佳地采用 0. 45 μ m的濾膜進(jìn)行過濾。本發(fā)明中，α -乳白蛋白的含量可通過本領(lǐng)域常用的定量分析方法確定，較佳地選用外標(biāo)法計(jì)算峰面積，從而確定α-乳白蛋白的含量。在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于
本發(fā)明解決了復(fù)雜乳制品體系中α -乳白蛋白的快速提取和準(zhǔn)確定量分析的問題，該法與目前常用的酶聯(lián)免疫法相比，具有檢測(cè)費(fèi)用低，目標(biāo)物出峰時(shí)間短，峰形尖銳對(duì)稱，分離度好，準(zhǔn)確程度高，受環(huán)境變化影響小，有利于α-乳白蛋白在乳制品中含量的檢測(cè)。


圖1為α -乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC曲線圖。 圖2為實(shí)施例2中檢測(cè)α -乳白蛋白的HPLC曲線圖。圖3為HPLC法測(cè)定α -乳白蛋白質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。下述實(shí)施例中，α -乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自于Sigma-Aldrich中國(guó)有限公司，批號(hào)為 905H9-0，純度≥ 85%。實(shí)施例1-2的高效液相色譜法條件色譜柱C18色譜柱(4. 6mmX250mm, Agilent公司，美國(guó))；流動(dòng)相A 體積分?jǐn)?shù) 0. 三氟乙酸的超純水溶液，流動(dòng)相B 乙腈、超純水和三氟乙酸以400 100 0.5的體積比混合的混合液，等度洗脫流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為81 19，總流速0.8mL/min， 柱溫35°C，檢測(cè)波長(zhǎng)215nm。工作曲線的繪制(外標(biāo)法測(cè)定物質(zhì)含量)準(zhǔn)確稱取α-乳白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(其HPLC曲線見圖1)，制成α-乳白蛋白溶液，用高效液相色譜測(cè)定溶液，其在215nm處的吸收峰繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下Y = 2. 0594Χ-28. Oil (R2 =0. 9977，見圖 3)。實(shí)施例1嬰幼兒奶粉中α-乳白蛋白的含量測(cè)定①離心脫脂準(zhǔn)確稱取IOg嬰幼兒奶粉(市售)樣品，使其完全溶解于IOOmL水中，然后在4°C下以4000r/min速度離心lOmin，去除上層漂浮的脂肪得脫脂樣品；②凈化分別取5mL 0. lOmol/L、pH值為4. 6的醋酸鹽緩沖液和ImL脫脂樣品于 IOmL離心管中，用漩渦振蕩器振蕩anin混合均勻，于4°C溫度下8000r/min離心lOmin，取
上清液；③過濾上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，得上機(jī)液；④取10 μ L上機(jī)液進(jìn)高效液相色譜儀。測(cè)得嬰幼兒奶粉中α -乳白蛋白的含量為6. 8mg/g。實(shí)施例2乳飲料中α -乳白蛋白的含量測(cè)定①離心脫脂取乳飲料樣品(市售)500ml，在4°C下以4000r/min速度離心lOmin， 去除上層漂浮的脂肪得脫脂樣品；②凈化取5mL 0. lOmol/L、pH值為4. 6的醋酸鹽緩沖液和ImL脫脂樣品于IOmL 離心管中，用漩渦振蕩器振蕩anin混合均勻，于4°C溫度下SOOOr/min離心lOmin，取上清液；③過濾上清液經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾，得上機(jī)液；④取10 μ L上機(jī)液進(jìn)高效液相色譜儀。測(cè)得乳飲料中α -乳白蛋白的含量為0. 86mg/ml。效果實(shí)施例準(zhǔn)確稱取3份實(shí)施例1的嬰幼兒奶粉10g，分別完全溶解于IOOmL水后，分別添加 500mg、lg和2g的α-乳白蛋白，其它步驟同實(shí)施例1。按實(shí)施例1_2的高效液相色譜法條件進(jìn)行回收率試驗(yàn)，分別重復(fù)6次。測(cè)得實(shí)施例1的樣品加標(biāo)回收率分別為92%、92%和 100%, RSD分別為3. 1%,2. 9%和3. 6%，結(jié)果見表1。準(zhǔn)確稱取3份實(shí)施例2的乳飲料500mL，分別添加1. 0g、2. 5g和5g的α -乳白蛋白，其它步驟同實(shí)施例2。按實(shí)施例1-2的高效液相色譜法條件進(jìn)行回收率試驗(yàn)，分別重復(fù) 6次。測(cè)得實(shí)施例2的樣品加標(biāo)回收率平均值分別為85%、92%和98%，RSD分別為4. 6%、 1.9%和1.8%，結(jié)果見表1。準(zhǔn)確稱取實(shí)施例1的嬰幼兒奶粉10g，完全溶解于IOOmL水后，添加500mg的α -乳白蛋白，其它步驟同實(shí)施例1。按實(shí)施例1-2的高效液相色譜法條件進(jìn)行回收率試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定12次，回收率為93%，RSD為2.9%，結(jié)果見表2。準(zhǔn)確稱取實(shí)施例2的乳飲料500mL，添加2. 5g的α -乳白蛋白，其它步驟同實(shí)施例 2。按實(shí)施例1-2的高效液相色譜法條件進(jìn)行回收率試驗(yàn)，重復(fù)測(cè)定12次，回收率為91%， RSD為1.9%，結(jié)果見表2。表1實(shí)施例1-2回收率試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種乳制品中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法，其包括如下步驟提取乳制品中的 α-乳白蛋白，再通過高效液相色譜法測(cè)定含量；所述高效液相色譜法的色譜條件為色譜柱為C18色譜柱，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210-230nm，洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成， 所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比為80 20-82 18 ；所述流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù) 0. 05-0. 15%的三氟乙酸的超純水溶液，所述流動(dòng)相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液，所述流動(dòng)相B中所述乙腈和超純水的體積比為320 100-480 100，所述超純水和三氟乙酸的體積比為100 0. 4-100 0.6。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的Cw色譜柱為AgilentZORBOX ECLIPSE XDB-C18柱；和/或，所述的檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。
3.如權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的色譜條件還包括流動(dòng)相總流速為0. 5-1. OmL/min，較佳地為0. 8mL/min ；柱溫為30_40°C，較佳地為 35 "C。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的乳制品為液體乳或乳粉。
5.如權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述提取乳制品中的α-乳白蛋白的方法按下述操作方式進(jìn)行①離心脫脂將所述的乳制品離心，去除脂肪得脫脂樣品；②凈化將PH值為4.6的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品混合均勻，離心后取上清液；③過濾過濾所述的上清液，得上機(jī)液。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟①中所述離心的溫度為1-4°C；所述離心的速度為3500-4500轉(zhuǎn)/分鐘；所述離心的時(shí)間為10-15min。
7.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟①中所述的乳制品以液態(tài)形式進(jìn)行離心，當(dāng)所述的乳制品為乳粉時(shí)，需將所述的乳粉與水混合得乳液，再進(jìn)行離心，乳粉與水的混合比例較佳地為Ig乳粉5mL水-Ig乳粉15mL水；和/或，步驟①中所述的脫脂樣品于_20°C保存，在M小時(shí)內(nèi)進(jìn)行步驟②即可。
8.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟②中所述醋酸鹽緩沖液中醋酸的濃度為0. 08-0. 12mol/L ；和/或，步驟②中所述的醋酸鹽緩沖液和所述的脫脂樣品的體積比為 4 1-6 1。
9.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟②中所述混合均勻采用漩渦振蕩器振蕩Ι-aiiin ；和/或，步驟②中所述離心的溫度為1-4°C ；所述離心的速度為6000-8000 轉(zhuǎn)/分鐘；所述離心的時(shí)間為8-lOmin。
10.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，步驟③中所述的過濾采用0.45μπι的濾膜進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳制品中α-乳白蛋白含量的檢測(cè)方法提取乳制品中的α-乳白蛋白，高效液相色譜法測(cè)定含量；高效液相色譜法C18色譜柱，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為210-230nm，洗脫液由流動(dòng)相A和流動(dòng)相B組成，該流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.05-0.15％三氟乙酸的超純水溶液，該流動(dòng)相B為乙腈、超純水和三氟乙酸的混合液，流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比為80∶20-82∶18；流動(dòng)相B中乙腈和超純水的體積比為320∶100-480∶100，超純水和三氟乙酸的體積比為100∶0.4-100∶0.6。本發(fā)明的檢測(cè)方法費(fèi)用低，目標(biāo)物出峰時(shí)間短，峰形尖銳對(duì)稱，分離度好，準(zhǔn)確程度高，受環(huán)境變化影響小，有利于α-乳白蛋白在乳制品中含量的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102565234SQ201210015949
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月17日
發(fā)明者何亞斌, 孟瑾, 樓飛, 鄭小平, 韓奕奕, 馬穎清 申請(qǐng)人:上海德諾產(chǎn)品檢測(cè)有限公司