一種人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗體含量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種人免疫球蛋白制品中Tau 蛋白抗體含量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Tau蛋白是與阿爾茲海默癥相關(guān)的一種重要蛋白。人靜脈注射免疫球蛋白 (intravenousimmunoglobulin，IVIG)是臨床用于一種治療免疫缺陷的藥物，含多種抗體。 同時(shí)，有研究者發(fā)現(xiàn)靜脈注射人免疫球蛋白制品能夠治療阿爾茲海默癥，其作用機(jī)理可能 與免疫球蛋白中含有的Tau蛋白抗體有關(guān)。
[0003] IVIG若用于阿爾茲海默癥的治療，其中的Tau蛋白抗體含量的多少將是與其治療 阿爾茲海默癥效果相關(guān)的重要指標(biāo)，因此，有必要對IVIG中Tau蛋白抗體含量進(jìn)行檢測。
[0004] 由于IVIG是以數(shù)千人份混合血漿為原料制備的血漿蛋白制品，因此其具有非常 豐富的抗體多樣性，包含成千上萬種蛋白、多肽、核酸甚至小分子物質(zhì)的IgG抗體，能夠與 多種成分發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，而單一一種抗體的含量也較少。常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)中 用到的封閉液、稀釋液中，常含有各種復(fù)雜成分，會(huì)與待測樣品發(fā)生交叉反應(yīng)而影響檢測方 法的準(zhǔn)確性；同時(shí)，因免疫球蛋白中的Tau蛋白抗體含量較低而不易檢測，也會(huì)對檢測方法 的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗 體含量的檢測方法，以提高檢測方法的準(zhǔn)確性。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗體含量的檢測方法，包括以下步驟：
[0008] A.抗原包被：在酶標(biāo)板的每孔中加入Tau蛋白溶液，經(jīng)孵育操作后用洗滌液洗 滌；
[0009] B.封閉：在所述酶標(biāo)板的每孔中加入無蛋白封閉液，經(jīng)孵育操作后用洗滌液洗 滌；
[0010] C. -抗孵育：在所述酶標(biāo)板的每孔中加入待測樣品，經(jīng)孵育操作后用洗滌液洗 滌；所述待測樣品為用稀釋液稀釋的人免疫球蛋白制品，所述稀釋液為采用去免疫球蛋白 G的牛血清白蛋白和磷酸鈉-吐溫緩沖液配制的混合液，所述稀釋液中的去免疫球蛋白G的 牛血清白蛋白的質(zhì)量含量為0.5% -1.5% ;
[0011] D.二抗孵育：在所述酶標(biāo)板的每孔中加入生物素偶聯(lián)的抗一抗的抗體，經(jīng)孵育操 作后用洗滌液洗滌；
[0012] E.酶標(biāo)三抗孵育：在所述酶標(biāo)板的每孔中加入標(biāo)記酶偶聯(lián)的鏈抗生物素蛋白，經(jīng) 孵育操作后用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl緩沖液洗滌；
[0013] F.吸光度檢測及含量計(jì)算：在所述酶標(biāo)板的每孔中加入顯色底物進(jìn)行顯色反應(yīng)， 經(jīng)孵育操作后再加入終止液終止反應(yīng)，然后將所述酶標(biāo)板放入檢測裝置中進(jìn)行吸光度檢 測，得待測樣品的吸光度值〇D#aWnan，并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出待測樣品中的Tau蛋白抗體 的含量。
[0014] 上述檢測方法中，通過采用無蛋白封閉液而避免了因封閉液中的蛋白質(zhì)與待測樣 品中的多元抗體發(fā)生非特異性結(jié)合而影響檢測結(jié)果；同時(shí)，采用去免疫球蛋白G的牛血清 白蛋白和磷酸鈉-吐溫緩沖液配制的混合液作為稀釋液，避免了因稀釋液中的牛血清白蛋 白中殘留的IgG分子與檢測體系發(fā)生交叉反應(yīng)而影響檢測結(jié)果，因此，提高了檢測方法的 準(zhǔn)確度。
[0015] 同時(shí)，為了避免因待測樣品中Tau蛋白抗體的含量較少而不易測量的問題，上述 檢測方法中，通過步驟C、步驟D和步驟E，使得吸附于酶標(biāo)板上的Tau蛋白首先與步驟C中 作為一抗的待測樣品中的Tau蛋白抗體發(fā)生特異性結(jié)合形成一抗復(fù)合物，即抗原抗體復(fù)合 物。然后該一抗復(fù)合物又與步驟D中作為二抗的生物素偶聯(lián)的抗體特異性結(jié)合形成二抗復(fù) 合物；最后該二抗復(fù)合與步驟E中作為三抗的標(biāo)記酶偶聯(lián)的鏈抗生物素蛋白特異性結(jié)合形 成標(biāo)記酶偶聯(lián)的三抗復(fù)合物，通過步驟D和步驟E的生物素放大系統(tǒng)對待測樣品中的Tau 蛋白抗體的檢測信號進(jìn)行了放大而使其與顯示底物反應(yīng)后易于被檢測，提高了該檢測方法 的準(zhǔn)確性。
[0016] 再者，上述步驟A、B、C、D和E均具有洗滌操作，這樣可以及時(shí)洗去各步驟中酶標(biāo) 板上的游離成分和其他雜質(zhì)蛋白，以免其影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0017] 因此，該檢測方法能夠更準(zhǔn)確地測定人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗體含量。
[0018] 其中，優(yōu)選地，所述稀釋液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的質(zhì)量含量為1%
[0019] 進(jìn)一步，所述生物素偶聯(lián)的抗一抗的抗體為生物素偶聯(lián)的免疫球蛋白G的Fc片段 的抗體，所述生物素偶聯(lián)的免疫球蛋白G的Fc片段的抗體為來源于其他物種的針對于人免 疫球蛋白G的Fc片段的抗體與生物素偶聯(lián)后形成的抗體。
[0020] 上述生物素偶聯(lián)的人免疫球蛋白G的Fc片段的抗體專門針對于人免疫球蛋白G 中的Fc片段而發(fā)生特異性反應(yīng)，使其更加專一地與結(jié)合了Tau蛋白抗體的人免疫球蛋白G 結(jié)合，從而可以有效地避免其與測定體系中其它雜蛋白發(fā)生反應(yīng)而影響檢測的準(zhǔn)確性，更 好地提高了該檢測方法的準(zhǔn)確性。
[0021] 進(jìn)一步，所述生物素偶聯(lián)的免疫球蛋白G的Fc片段的抗體為生物素偶聯(lián)的羊抗人 免疫球蛋白G的Fc片段的抗體、生物素偶聯(lián)的兔抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗體或者生 物素偶聯(lián)的鼠抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗體。
[0022] 進(jìn)一步，所述Tau蛋白溶液的濃度為5-20μg/ml;所述洗滌液為磷酸鹽緩沖液； 所述Tris-HCl緩沖液的濃度為0· 01-0. 02mol/L，其含有的NaCl的濃度為0· 1-0. 2mol/L， Tween-20的質(zhì)量百分含量為0· 05% -0· 2%。
[0023] 優(yōu)選地，所述Tau蛋白溶液的濃度為15μg/ml;所述所述Tris-HCl緩沖液的濃度 為0· 015mol/L，其含有的NaCl的濃度為0· 15mol/L，Tween-20的質(zhì)量百分含量為0· 1%。
[0024] 進(jìn)一步，所述標(biāo)記酶為堿性磷酸酶，所述顯色底物為對硝基苯磷酸二鈉，所述終止 液為強(qiáng)堿溶液，所述吸光度檢測是檢測酶標(biāo)板在波長405nm的吸光度值；或者所述標(biāo)記酶 為辣根過氧化物酶，所述顯色底物為雙氧水與四甲基聯(lián)苯胺或者雙氧水與鄰笨二胺，所述 終止液為強(qiáng)酸溶液，所述吸光度檢測是檢測酶標(biāo)板在波長450nm或492nm的吸光度值。
[0025] 顯色底物為雙氧水與四甲基聯(lián)苯胺時(shí)，吸光度檢測的波長為450nm;顯色底物為 雙氧水與鄰笨二胺時(shí)，吸光度檢測的波長為492nm。
[0026] 進(jìn)一步，所述洗滌液和所述Tris-HCl緩沖液的洗滌次數(shù)均分別為3-5次。
[0027] 上述洗滌次數(shù)分別為3-5次，以充分洗去各步驟中的游離成分以及其他殘留的雜 質(zhì)蛋白。
[0028]進(jìn)一步，所述孵育操作的孵育溫度為4-37°C，孵育時(shí)間為5min-16h。
[0029] 上述檢測方法中，各步驟的孵育操作的溫度可以為4-37Γ，根據(jù)孵育溫度，其孵育 時(shí)間可以在5min-16h內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。溫度高時(shí)，孵育時(shí)間短些；而溫度低時(shí)，孵育時(shí)間長 止匕 -、〇
[0030]進(jìn)一步，所述孵育操作的孵育溫度為25°C，孵育時(shí)間為8min-4h。
[0031] 溫度較高時(shí)，應(yīng)縮短孵育時(shí)間，以免因孵育時(shí)間填充而發(fā)生非特異性結(jié)合或酶促 反應(yīng)過度而影響檢測結(jié)果。
[0032] 進(jìn)一步，步驟F中的所述標(biāo)準(zhǔn)曲線法包括以下步驟：
[0033] 溶液配制：將標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液進(jìn)行梯度稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
[0034] 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：根據(jù)所述檢測方法分別測定所述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)檢測反 應(yīng)后的吸光度值，再以的值對標(biāo)準(zhǔn)品中Tau蛋白濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并獲得 曲線方程；
[0035] 結(jié)果計(jì)算：將測得的所述待測樣品的吸光度值0D#aWnan代入曲線方程計(jì)算待測樣 品中Tau蛋白抗體含量。
[0036] 其中優(yōu)選地，標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為1. 95ng/ml-500ng/ml之間。
[0037] 進(jìn)一步，所述標(biāo)準(zhǔn)品為鼠抗人Tau蛋白單克隆抗體，且所述標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制中，所用 的生物素偶聯(lián)的抗一抗的抗體為生物素偶聯(lián)的羊抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗體或者 生物素偶聯(lián)的兔抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗體。
[0038] 容易理解的，根據(jù)所選用的作為標(biāo)準(zhǔn)品的Tau蛋白單克隆抗體