結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥體外診斷試劑領(lǐng)域，特別設(shè)及一種新型結(jié)核病T細(xì)胞免疫標(biāo) 志物Rv3457c的重組蛋白、其制備方法及其在細(xì)胞免疫診斷中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病由病原體一-結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體所致，至今仍為人類重要的傳染病。 快速、準(zhǔn)確的診斷結(jié)核分枝桿菌（MTB)感染，對于結(jié)核病的控制具有重要意義。MTB感染的 診斷方法有很多，目前臨床最為常用的方法仍然依靠傳統(tǒng)的疲涂片細(xì)菌學(xué)檢查，但檢出率 低；MTB培養(yǎng)可做為結(jié)核病確診的"金標(biāo)準(zhǔn)"，但其培養(yǎng)時(shí)間太長，一般4-6周，難W滿足臨床 需要；Bactec技術(shù)雖縮短了培養(yǎng)時(shí)間，但費(fèi)用較高，短時(shí)間內(nèi)難W推廣普及；X線和CT檢查 僅提供影像學(xué)可能性診斷；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技術(shù)及其它基因診斷方法作為臨床診斷尚 存在操作復(fù)雜，對技術(shù)和人員專業(yè)素質(zhì)要求較高，且仍不能用于菌陰結(jié)核病的快速診斷?？?結(jié)核免疫主要是細(xì)胞免疫，包括致敏的T淋己細(xì)胞和被激活的巨隧細(xì)胞。致敏的T淋己細(xì) 胞可直接殺死帶有結(jié)核桿菌的祀細(xì)胞，同時(shí)對釋放多種作用于世隧細(xì)胞的淋己因子，使巨 隧細(xì)胞聚集在病灶周圍形成W單核細(xì)胞為主的增生性炎癥。被激活的巨隧細(xì)胞極大地增強(qiáng) 對結(jié)核桿菌的吞隧消化，抑制繁殖，阻止擴(kuò)散，甚至銷毀的能力，充分發(fā)揮細(xì)胞免疫的作用。 目前廣泛應(yīng)用的結(jié)核病細(xì)胞免疫診斷技術(shù)仍依賴于皮試檢測試劑---結(jié)核分枝桿菌純蛋 白衍生物（PPD)。然而PPD存在與環(huán)境分枝桿菌W及BCG疫苗株的交叉反應(yīng)，所W診斷價(jià)值 偏低。因而發(fā)現(xiàn)新的結(jié)核病T細(xì)胞免疫標(biāo)志物，并建立新的結(jié)核病細(xì)胞免疫診斷方法是結(jié) 核病診斷所亟需的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明的目的在于一種結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋 白、制備方法及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明提供一種結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO: 1 所示。 陽0化]本發(fā)明的結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白通過使用祀T28a質(zhì)粒，在Rv3457c該天 然蛋白序列前面加了一段化S?Tag純化標(biāo)簽獲得。所述化S?Tag純化標(biāo)簽的氨基酸序列 由SEQIDNO: 1中從氨基末端第1至第17位氨基酸殘基序列組成。SEQIDNO: 1中從氨基 末端第18至第364位氨基酸殘基序列組成天然Rv3457c蛋白氨基酸序列。
[0006] 本發(fā)明還提供一種編碼上述結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白的基因，其具有如下 所示的核巧酸序列：
[0007] ①如沈Q ID NO:2所示的核巧酸序列；
[0008] ②不同于SEQIDNO: 2但編碼的氨基酸序列與SEQIDNO: 2所編碼的氨基酸序列 相同的核巧酸序列；
[0009] ③在嚴(yán)格雜交條件下與上述①或②中的序列雜交，并且編碼具有所述結(jié)核分枝桿 菌Rv3457c重組蛋白活性的核巧酸序列。
[0010] 本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種包含所述結(jié)核分枝桿菌Rv3457c基因的重組 質(zhì)粒，即將Rv3457c基因序列插入商用表達(dá)質(zhì)粒序列中。Rv3457c基因NCBI登陸號 為：NC_000962. 3;蛋白號為：NP_217974. 1。
[0011] 本發(fā)明的"Rv3457c基因序列"也包括對NC_000962. 3中一個(gè)或多個(gè)密碼子被 編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所W與 NC_000962. 3核巧酸序列同源性低至約70 %的簡并序列也能編碼相同的氨基酸序列。該術(shù) 語還包括在中度嚴(yán)密條件下，更佳地在高度嚴(yán)密條件下與NC_000962. 3的核巧酸序列雜交 的核巧酸序列。該術(shù)語還包括與NC_000962. 3的核巧酸序列同源性至少70%，更佳地至少 90 %的核巧酸序列。
[0012] 本發(fā)明的重組質(zhì)粒，通常將Rv3457c基因插入表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處得到。
[0013] 本發(fā)明的重組質(zhì)粒在制備過程中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，然后將編碼本 發(fā)明的核巧酸序列可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成蛋白表達(dá)載體。
[0014] 本發(fā)明中可采用的載體有祀T28a等。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所用的質(zhì)粒為 pET28a〇
[0015] 本發(fā)明還提供一種結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白的制備方法，包括W下步驟：
[0016] (1)制備結(jié)核分枝桿菌菌株基因組DNA;
[0017] (2)擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌Rv3457c基因；
[0018] (3)結(jié)核分枝桿菌Rv3457c基因插入表達(dá)質(zhì)粒；
[0019] (4)將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；
[0020] (5)誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)核分枝桿菌Rv3457c蛋白；
[0021] (6)分離純化誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物，得到結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白； W22] 其中，在制備結(jié)核分枝桿菌Rv3457c基因中采用的引物為Rv3457c-F和Rv3457c-R，所述引物Rv3457c-F的核巧酸序列如沈QIDNo:3所示，所述引物Rv3457c-R 的核巧酸序列如SEQIDNo:4所示。
[0023] 上述制備方法中，各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)均按常規(guī)操作選擇，可視具體實(shí)驗(yàn)條件而定。
[0024] 本發(fā)明的Rv3457c基因序列可W用PCR擴(kuò)增法獲得。可根據(jù)本發(fā)明所公開的相關(guān) 核巧酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所 制備的基因組DNA為模板，擴(kuò)增而得到相關(guān)序列。
[00巧]本發(fā)明中，重組蛋白所用的表達(dá)質(zhì)?？蒞是祀T28a等。 陽0%] 本發(fā)明中，表達(dá)Rv3457c蛋白所用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌的化2UDE3)菌株或 化21plysS值E3)菌株。
[0027] 本發(fā)明中，誘導(dǎo)表達(dá)Rv3457c蛋白可采用多種方法，如使用異丙基-P-D-硫代化 喃半乳糖巧（IPTG)。
[0028] 本發(fā)明中，分離純化重組Rv3457c蛋白也可采用多種方法，如親和層析、離子交換 層析等。
[0029] 本發(fā)明還提供一種上述結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白在制備檢測或診斷結(jié)核 病的試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種上述結(jié)核分枝桿菌RV3457C重組蛋白、其特異性抗 體或其基因引物在制備結(jié)核病檢測試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種結(jié)核病檢測試 劑盒，其組分中的檢測抗原是所述結(jié)核分枝桿菌Rv3457c重組蛋白。
[0030] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0031] (1)與天然結(jié)核分枝桿菌Rv3457c蛋白相比，該重組蛋白更易采用親和層析的方 法進(jìn)行純化，純度可達(dá)90%W上，不僅大大降低了其生產(chǎn)成本，而且也具有更高的穩(wěn)定性， 該重組蛋白在不凍干的情況下4°C可保存1周，-20°C可保存3個(gè)月，-80°C至少保存1年；
[0032] (2)本發(fā)明基于免疫組學(xué)的研究成果，首次報(bào)道了RV3457C特異性抗原可W應(yīng)用 于結(jié)核病診斷，且是一個(gè)活性較強(qiáng)的T細(xì)胞祀抗原，用于結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)診斷，具有較高 的敏感性高，而且相比皮試試驗(yàn)，更為快速和安全可靠。
【附圖說明】
[0033] 圖1是重組蛋白Rv3457c經(jīng)進(jìn)一步純化及濃縮后的SDS-PAGE圖。1是蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)，2誘導(dǎo)前菌體巧yg)，3是誘導(dǎo)后菌體巧yg)，4是純化后的目的蛋白巧yg)。
[0034]圖 2 是抗原ESAT-6,CFP-IO和Rv3457c評估試驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人 員而言是顯而易見的，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按 照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0036] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所 述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用，但不能限制本方面的內(nèi)容。
[0037] 實(shí)施例1重組質(zhì)粒祀T28a-Rv3457c的構(gòu)建 陽〇3引（1)祀基因引物設(shè)計(jì)
[0039]Rv：M57c-F(SEQIDNo:3):GGAATTCCATATGCTGATCTCACAGCGCCCCACCCTGTC;
[0040] Rv：M57c-R (沈Q ID No:4) :CCGCTCGAGAGGACTACGCCGAAACCGAACAGCTT
[0041] 酶切位點(diǎn)分別為Nde lahol。 陽0創(chuàng)似祀基因的PCR擴(kuò)增、克隆及序列測定 陽0創(chuàng) W結(jié)核分枝桿菌&柳基因組DNA為模板，Rv3457c-F和Rv3457c-R為引物，應(yīng)用 Taq酶（寶生物工程（大連）有限公司），通過PCR直接擴(kuò)增Rv3457c蛋白基因。PCR反應(yīng) 條件：94°C預(yù)變性5min ; (94°C，30s ;58°C，30s ;72°C，40s) 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min ;4°C保 存。反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，后用DM回收試劑盒（Invitrogen) 回收。用Nde I和化Ol酶切，克隆構(gòu)建入祀T28a質(zhì)粒Nde I和化Ol酶切位點(diǎn)中。測序表 明所插入的序列和GeneBank中冊7Rv結(jié)核全基因組相應(yīng)基因序列（Rv3457c基因NCBI登 陸號為：NC_000962. 3 ;蛋白號為：NP_217974. 1)完全一致。
[0044] 實(shí)施例2重組蛋白Rv3457c的誘導(dǎo)表達(dá)及純化
[0045] 將裝有IOOy1BL2UDE3)地ysS感受態(tài)細(xì)胞燈IANGEN)的e卵do計(jì)管 從-80°C冰箱立即放入冰上。3-5分鐘后等管內(nèi)液體融化后，將0. 5y1測序正確的重組 pET32a-Rv3457c質(zhì)粒放入感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置45min，42°C水浴鍋中，熱擊90s，冰上靜 置3min，加入500iiI的不含抗生素的預(yù)熱的LB培養(yǎng)基，37°C搖床，220rmp，培養(yǎng)45-60min。 取一定量在含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平皿上涂布，室溫干燥后倒置于37°C溫箱中培養(yǎng)