本發(fā)明屬于生物醫(yī)學檢驗領域，具體涉及一種用于檢測潛在結核的特異性標志物及其應用。

背景技術：

結核是一種由人結核分枝桿菌引起的疾病。根據(jù)WHO最新數(shù)據(jù)顯示，全球約有30％的人口感染結核病菌，現(xiàn)有結核病人約2000萬，每年新增800-1000萬人，每年約有200萬人死于結核病，是其它所有傳染病總和。我國結核病情尤為嚴重，現(xiàn)有結核感染者5億，占全球的20％，每年約13萬人死于結核病，是其它所有傳染病總和的2倍。如不及時采取措施，未來十年可能有3000萬人患病，將會導致嚴重的公共衛(wèi)生和社會問題。目前結核病控制的存在的主要問題是病人發(fā)現(xiàn)率低，治愈率低。在診斷方面，現(xiàn)有的檢測方法不能很好的區(qū)分潛在結核和活動性結核，目前還沒有一種潛在結核診斷的金標準。

結核菌素皮試(tuberculin skin test,TST)是一種廣泛使用的結核檢測方法，已經(jīng)有100多年的歷史，由于其操作簡單、檢測成本低，在全世界得到廣泛使用。但是這種方法會把接種過卡介苗的非結核患者診斷為結核陽性，其結核檢測錯誤率較高。γ-干擾素釋放試驗(interferon-γrelease assays，IGRAs)能夠很好的克服這一缺點，對結核病檢測的靈敏度和特異性都很高。這種方法利用ELISA檢測全血中IFN-γ釋放量或ELISPOT檢測外周血單核細胞中釋放IFN-γ的T淋巴細胞數(shù)量進行檢測。IFN-γ釋放實驗采用RD-1區(qū)的特異性抗原ESAT-6，CFP-10和TB7.7(RD-11)，這些區(qū)域特異性的存在于人結核桿菌，而卡介苗菌株BCG和大多數(shù)環(huán)境結核桿菌沒有這些區(qū)域。

不管是結核菌素皮試還是人干擾素-γ釋放實驗都不能很好的檢出潛在結核患者，關鍵在于沒有特異性和靈敏度高的潛在結核抗原。因此，加大結核病菌的基礎研究，尋找快速，準確，實用的潛在結核檢測方法，提高潛在結核病人的檢出率，是目前結核病診斷需要迫切解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

為了彌補上述現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提出一種用于檢測潛在結核的特異性標志物及其應用。

本發(fā)明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：

一種用于檢測潛在結核的特異性標志物，其為抗原Rv2626c、抗原Rv3716c、抗原TrxC、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合。

優(yōu)選地，所述抗原Rv2626c是如序列表中sequence ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或是將序列表中的sequence ID No.1的氨基酸殘基經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.1所示具有相同功能的衍生的蛋白質。

優(yōu)選地，所述抗原Rv3716c是如序列表中sequence ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或是將序列表中的sequence ID No.2的氨基酸殘基經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.2所示具有相同功能的衍生的蛋白質。

優(yōu)選地，所述抗原TrxC是如序列表中sequence ID No.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或是將序列表中的sequence ID No.3的氨基酸殘基經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.3所示具有相同功能的衍生的蛋白質。

一種所述的特異性標志物在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中的應用。

優(yōu)選地，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中包括如下內容的說明書：人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標志物刺激后，以釋放出的IFN-γ或者IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結核診斷因子。

優(yōu)選地，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中包括如下內容的說明書：當所述特異性標志物是Rv2626c、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、或抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合時，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標志物刺激后，以釋放出的IFN-γ作為潛在結核診斷因子；當所述特異性標志物是抗原Rv3716c、抗原TrxC、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合時，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標志物刺激后，以釋放出的IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結核診斷因子。

一種用于鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核的試劑盒，包含所述的特異性標志物。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括配合所述特異性標志物一起使用的試劑。

一種所述的試劑盒在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中的應用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術對比的有益效果包括：本發(fā)明經(jīng)過大量研究，篩選出了Rv2626c、Rv3716c、TrxC抗原或其兩兩組合作為潛在結核檢測的特異性標志物，能夠判斷受試者是否為潛在結核患者，并可以將潛在結核患者與結核病人區(qū)分開，其在潛在結核診斷試劑盒，在潛在結核鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查中具有較大的應用價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中所制備的Rv2626c蛋白表達SDS-PAGE電泳圖。泳道1為PET-32a空載體轉染大腸桿菌誘導表達后菌液上清；泳道2為PET-32a-Rv2626c轉染大腸桿菌誘導表達后菌液上清；泳道3為蛋白分子標記；

圖2為本發(fā)明實施例1中所制備的Rv3716c蛋白表達SDS-PAGE電泳圖。泳道1為PET-32a空載體轉染大腸桿菌誘導表達后菌液上清；泳道2為PET-32a-Rv3716c轉染大腸桿菌誘導表達后菌液上清；泳道3為蛋白分子標記；

圖3為本發(fā)明實施例1中所制備的TrxC蛋白表達SDS-PAGE電泳圖。泳道1為PET-32a-TrxC轉染大腸桿菌誘導表達后菌液上清；泳道2為PET-32a空載體轉染大腸桿菌誘導表達后菌液上清；泳道3為蛋白分子標記；

圖4為本發(fā)明實施例1中的IFN-γ對3個潛在結核特異性抗原的反應；

圖5為本發(fā)明實施例1中的TNF-α對3個潛在結核特異性抗原的反應。

具體實施方式

下面結合附圖通過具體實施例對本發(fā)明進行詳細的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但下述實施例并不限制本發(fā)明范圍。

本發(fā)明提供一種用于檢測潛在結核的特異性標志物，在具體的實施方式中，其為抗原Rv2626c、抗原Rv3716c、抗原TrxC、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合。

本發(fā)明所稱的“潛在結核”為感染了結核桿菌，即體內攜帶有結核桿菌，但體內的結核桿菌處于休眠期，還沒有爆發(fā)出來引起人體一些臨床上可見的結核癥狀。

以下通過一個優(yōu)選的實施例對本發(fā)明作詳細闡述，下述實施例中：所使用的實驗方法、檢測方法或分析方法等如無特別說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等如無特別說明，均可以從市購獲得，所述的“常溫”是指25-37℃；抗原Rv2626c、抗原Rv3716c或抗原TrxC在下文中也稱“潛在結核特異性抗原”。

在一些優(yōu)選的實施例中，可以優(yōu)選以下方案中的至少一個：

所述抗原Rv2626c是如序列表中sequence ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或是將序列表中的sequence ID No.1的氨基酸殘基經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.1所示具有相同功能的衍生的蛋白質。

所述抗原Rv3716c是如序列表中sequence ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或是將序列表中的sequence ID No.2的氨基酸殘基經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.2所示具有相同功能的衍生的蛋白質。

所述抗原TrxC是如序列表中sequence ID No.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質，或是將序列表中的sequence ID No.3的氨基酸殘基經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.3所示具有相同功能的衍生的蛋白質。

本發(fā)明還提供一種所述的特異性標志物在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中的應用。

在一些優(yōu)選的實施例中，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中包括如下內容的說明書：人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標志物刺激后，以釋放出的IFN-γ或者IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結核診斷因子。

在另一些優(yōu)選的實施例中，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中包括如下內容的說明書：當所述特異性標志物是Rv2626c、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、或抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合時，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標志物刺激后，以釋放出的IFN-γ作為潛在結核診斷因子；當所述特異性標志物是抗原Rv3716c、抗原TrxC、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合時，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標志物刺激后，以釋放出的IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結核診斷因子。

本發(fā)明還提供一種用于鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核的試劑盒，包含所述的特異性標志物。

在一些優(yōu)選的實施例中，所述試劑盒中還包括配合所述特異性標志物一起使用的試劑。

本發(fā)明還提供一種所述的試劑盒在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結核用途的產(chǎn)品中的應用。

以下通過更具體的實施例對本發(fā)明進行詳細闡述。

實施例1

1.分子克隆潛在結核特異性抗原

1.1提取結核分枝桿菌H37Rv菌株(北京株)總RNA

1)用接種環(huán)取結核分枝桿菌H37Rv菌株(北京株)于7H11固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)5-6周，用接種環(huán)挑取單個菌落于體積比為0.1％的7H9吐溫液體培養(yǎng)基中，2周后轉種，待OD₆₀值達到0.5-0.8時備用。

2)離心去除培養(yǎng)基上清，用PBS洗一遍，制備成1×10⁹CFU/份，加入新配置的甲醇氯仿混懸液(甲醇和氯仿的體積比為1:3)1ml，渦旋震蕩1分鐘，立刻加入Trizol5ml，渦旋震蕩15秒。

3)于冰上靜置10分鐘，12000g離心10分鐘，取上層水相，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃靜止2小時。

4)10000g離心10分鐘后棄上清，用70％乙醇洗兩次，自然干燥后加入DEPC水溶解，得到H37Rv菌株總RNA。

1.2 RT-PCR獲取目的基因片段

1.2.1引物設計

根據(jù)H37Rv菌株基因組DNA序列(NCBI Reference SEQ:NC_000962.3)設計引物，分別進行RT-PCR獲得Rv2626c，Rv3716c和TrxC的全長CDS序列，擴增引物如下：

Rv2626c上游引物P1(如sequence ID No.4所示)：ATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下游引物P2(如sequence ID No.5所示)：CTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上游引物P3(如sequence ID No.6所示)：ATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物P4(如sequence ID No.7所示)：TCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游引物P5(如sequence ID No.8所示)：ATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P6(如sequence ID No.9所示)：CTAGTTGAGGTTGGGAAC

再次設計引物分別加入酶切位點BamHI和EcoRI，酶切后連接在載體PET-32a中，構建成表達載體PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC。

帶酶切位點的引物如下：

Rv2626c上游引物P7(如sequence ID No.10所示)：

CGGATCCATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下游引物P8(如sequence ID No.11所示)：

GGAATTCCTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上游引物P9(如sequence ID No.12所示)：

CGGATCCATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物P10(如sequence ID No.13所示)：

GGAATTCTCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游引物P11(如sequence ID No.14所示)：

CGGATCCATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P12(如sequence ID No.15所示)：

GGAATTCCTAGTTGAGGTTGGGAAC

1.2.2逆轉錄反應

在0.2ml EP管中，取如上1.1中提取的H37Rv菌株總RNA 1μg，按如下比例建立逆轉錄反應體系：

于PCR儀上50℃反應30min，然后94℃下2min滅活逆轉錄酶，合成cDNA于1.2.3中的PCR反應。

1.2.3 Rv2626c，Rv3716c和TrxC的基因片段擴增

在0.2ml EP管中，取如上1.2.2中H37Rv菌株的cDNA，按如下比例建立基因片段擴增反應體系：

于PCR儀上94℃5min，然后30個PCR循環(huán)，每個循環(huán)94℃45s，60℃45s，72℃1min，最后延伸72℃5min。

1.3表達載體構建

將PCR擴增的Rv2626c，Rv3716c和TrxC的基因片段進行1％瓊脂糖電泳，在紫外燈下用手術刀片切下相應大小的DNA片段，稱重后移入EP管。根據(jù)DNA片段純化試劑盒說明書進行回收。

1.3.1將純化的PCR片段連接到PMD-18T載體上

反應體系如下：

1.3.2重組質粒的轉化

1)取一管DH5α感受態(tài)細胞于冰上融化后加入上述連接產(chǎn)物，輕輕混勻。

2)冰上靜置20min。

3)將EP管在42℃下熱激60s。

4)快速取出EP管在冰上放置1-2min。

5)加入800μL不含抗性的LB液體培養(yǎng)基，轉移至搖床，37℃搖震蕩培養(yǎng)1h。

6)取出EP管，在常溫下4000rpm，離心1min，吸取700μL上清，剩余200μL輕輕吹打重懸細胞。

7)將重懸細胞均勻涂布于含有氨芐抗性(100mg/ml)的LB固體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)12-16h。

1.3.3提取質粒并測序

從含有氨芐抗性(100mg/ml)的LB固體培養(yǎng)基中挑取10個菌落進行克隆PCR進行陽性鑒定，并接種于一塊新的含抗性的LB固體培養(yǎng)基中。對克隆PCR鑒定為陽性的菌落進行擴大培養(yǎng)，提取質粒并測序。質粒提取過程按質粒提取試劑盒說明書操作。

1.3.4酶切與純化

將測序正確的PMD-18T-Rv2626c，PMD-18T-Rv3716c和PMD-18T-TrxC，以及表達載體PET-32a進行BamHI和EcoRI雙酶切。酶切產(chǎn)物進行1％瓊脂糖電泳，目的片段切膠回收，并用膠純化試劑盒純化。

1.3.5連接與轉化

將純化的帶酶切位點的Rv2626c，Rv3716c和TrxC基因片段和載體PET-32a分別進行如下連接反應：

將經(jīng)上述連接反應得到的重組的PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC表達載體分別轉化大腸桿菌Rosetta-gami 2(DE3)，并在含有氨芐(50mg/ml)LB固體培養(yǎng)基中篩選陽性克隆。

1.4表達

利用大腸桿菌體外誘導表達潛在結核特異性抗原的具體過程為：

1)挑取鑒定為陽性的菌斑于3ml含有氨芐抗性(50mg/ml)的LB液體培養(yǎng)中，37℃震蕩培養(yǎng)12-16小時。

2)按1％轉種于新鮮配置的含有氨芐抗性(50mg/ml)的LB液體培養(yǎng)中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.4-0.6。

3)加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃下誘導培養(yǎng)3-16小時。

4)4℃10000g下離心5min，分別收集上清和沉淀。

1.5純化

所有在大腸桿菌表達的蛋白均帶有組氨酸標簽，可以通過Ni-NAT進行親和純化，具體過程如下：

1)加入150μL細胞裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)和蛋白酶抑制劑PMSF。

2)冰上超聲破碎細胞。

3)加入10％triton X-100，使終濃度為0.05％，充分混勻，冰上放置10分鐘。

4)4℃13000g離心15min，取上清。

5)將Ni-NAT用10倍柱體積的細胞裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)平衡。

6)將上清蛋白樣品加入到Ni-NAT柱中，流速為15ml/h。

7)用5倍柱體積的細胞裂解緩沖液沖洗Ni-NAT一次，流速為30ml/h。

8)用5倍柱體積的內毒素緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.9，0.5％ASB-14)沖洗Ni-NAT一次，流速為30ml/h。

9)用5倍柱體積的洗脫液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油，250mM咪唑)沖洗Ni-NAT一次，流速為15ml/h，收集洗脫液。

10)12.5％SDS-PAGE分析蛋白純化情況。

1.6結果

如圖1、2和3所示，與對照PET-32a空載體轉染大腸桿菌Rosetta-gami 2(DE3)相比，PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC轉染大腸桿菌Rosetta-gami 2(DE3)后在0.5M IPTG誘導下有特異性的蛋白條帶出現(xiàn)。通過與蛋白分子標記對比，Rv2626c，Rv3716c和TrxC分子大小為12KDa、10KDa和10KDa。

2.評估潛在結核患者和結核病人對潛在結核特異性抗原的反應

2.1實驗樣本

實驗樣本如表1所示：

表1受試者樣本特征情況表

結核病人樣本：40例結核病人外周全血實驗樣本采集自深圳市第三人民醫(yī)院結核科門診或住院的結核病人，經(jīng)結核桿菌培養(yǎng)所有受試者干擾素釋放實驗均為陽性。

根據(jù)潛在結核的定義選取的潛在結核患者樣本為：35例潛在結核患者來自于其家庭成員至少有一個是結核病陽性，且在一起共同生活超過半年以上，且排除結核桿菌培養(yǎng)為陽性的患者。

2.2γ-干擾素釋放試驗

γ-干擾素釋放試驗采用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)試劑盒(Cellestis，Qiagen GmBH)，所有實驗步驟按廠家說明書進行操作。本實驗35名潛在結核患者和40名結核病人γ-干擾素釋放試驗均為陽性，說明γ-干擾素釋放試驗不能很好區(qū)分潛在結核和活動性結核。

2.3潛在結核特異性抗原檢測

2.3.1外周全血分析

1)將肝素鈉靜脈全血用RPMI1640稀釋10倍。

2)往48孔平底細胞培養(yǎng)板中加入稀釋外周全血，每孔400μL，每個樣本4個重復。

3)每孔添加4μL青霉素(10000U/ml)和4μL鏈霉素(10mg/ml)。

4)每個樣本分別添加Rv2626c，Rv3716c和TrxC潛在結核特異性抗原，終濃度為5ug/ml；同時設置一個空白對照，該孔不添加任何潛在特異性抗原。

5)37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天。

6)離心收集血清。

2.3.2 IFN-γ和TNF-α檢測

IFN-γ和TNF-α檢測采用達科為生物工程有限公司人IFN-γELISA Kit和人TNF-αELISA Kit。操作過程按說明書進行。

2.4實驗結果與判讀

應用潛在結核特異性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC對40名結核病人和35名潛在結核患者外周全血進行特異性刺激，然后應用ELISA檢測血清樣本中的IFN-γ和TNF-α的含量，我們發(fā)現(xiàn)潛在結核患者血清中IFN-γ的含量明顯高于結核病人，與之相反，潛在結核患者血清中TNF-α的含量明顯低于結核病人，結果如圖4和圖5所示，表明經(jīng)潛在結核特異性抗原刺激，IFN-γ可以作為潛在結核患者特異性檢測因子，TNF-α可以作為結核病人特異性檢測因子。我們把受試的35名潛在結核患者設為診斷組，另外40名結核病人作為對照組，以診斷組陽性率最高和對照組陽性率最低為標準，利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC curve)篩選出最佳陽性判斷閾值(如表2所示)。受試者血清中IFN-γ和TNF-α含量高于陽性判斷閾值的判定為陽性，低于陽性判斷閾值的判斷為陰性。

IFN-γELISA檢測中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和TrxC對潛在結核患者陽性判定數(shù)均為31個，陽性率為31/35＝88.5％；Rv2626c，Rv3716c和TrxC對結核病人陽性率分別為7.5％，12.5％和10％。由此可以看出，三者相比，Rv2626c對潛在結核患者檢測的準確率最高。

TNF-αELISA檢測中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和TrxC對潛在結核患者陽性判定數(shù)均為4個，陽性率為4/35＝11.4％；Rv2626c，Rv3716c和TrxC對結核病人陽性率分別為70％，72.5％和57.5％。由此可以看出，Rv2626c和Rv3716c對結核病人的檢測準確率要好于TrxC。

表2：IFN-γ和TNF-α對潛在結核特異性抗原的反應結果

于此同時我們發(fā)現(xiàn)，Rv2626c分別聯(lián)合其它兩種特異性抗原Rv3716c和TrxC能明顯提高潛在結核患者陽性檢測率，檢測數(shù)據(jù)如表3所示。對于聯(lián)合抗原檢測來說，陽性判斷標準為只要有一種抗原檢測結果為陽性即判定為陽性。從表3中可以看出，Rv2626c+Rv3716c在潛在結核患者中的陽性率從88.5％提高到100％，在結核病人中的陽性率從7.5％提高到17.5％；Rv2626c+TrxC在潛在結核患者中的陽性率從88.5％提高到97.14％，在結核病人中的陽性率從7.5％提高到12.5％。

表3 IFN-γ對聯(lián)合抗原的反應結果

基于IFN-γ可以作為潛在結核患者特異性檢測因子，TNF-α可以作為結核病人特異性檢測因子，猜想，利用IFN-γ/TNF-α比值作為潛在結核診斷因子可能有助于提高檢測特異性和靈敏度。IFN-γ/TNF-α比值為同一病人血清樣本經(jīng)潛在結核特異性抗原刺激后IFN-γ釋放量除以TNF-α釋放量，并利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC curve)篩選出最佳陽性判斷閾值(如表4所示)，Rv2626c，Rv3716c和TrxC在潛在結核患者中的陽性率均為94.2％，在結核病人中的陽性率分別為7.5％，5％和5％。因此利用IFN-γ/TNF-α比值檢測中，Rv3716c和TrxC具有最佳檢測效果，對潛在結核患者檢測的靈敏度為94.2％，特異性為95％。

表4 IFN-γ/TNF-α比值對潛在結核檢測診斷效果

2.5結論

從本實驗可以看出，利用潛在結核特異性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC能夠很好的區(qū)分潛在結核患者和結核病人。運用Rv2626c+Rv3716c或Rv2626c+TrxC雙抗原進行IFN-γ單因子ELISA檢測，可以提高潛在結核診斷的靈敏度，但代價是降低了檢測的特異性。而運用Rv3716c和TrxC其中任何一個單抗原進行IFN-γ/TNF-α比值的雙因子檢測，潛在結核診斷靈敏度從88.5％提高到94.2％，特異性從92.5％提高到95％，沒有因靈敏度提高而降低特異性。

目前，還沒有一款產(chǎn)品能夠很好的區(qū)分潛在結核和活動性結核，以γ-干擾素釋放試驗(interferon-γrelease assays，IGRAs)為例，它能同時檢測出潛在結核和活動性結核，但是不能將兩者區(qū)分開。本實驗35名潛在結核患者和40名結核病人運用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)試劑盒進行檢測均呈陽性。而采用潛在結核特異性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC，并運用我們開發(fā)的IFN-γ和TNF-α雙因子檢測能很好的區(qū)分潛在結核和活動性結核。

實施例2

潛在結核ELISA診斷試劑盒的制備。

1、待測樣本準備

待測樣本分為三組，分別為健康人，潛在結核患者和結核病人。

健康人樣本數(shù)為18個，血液樣本來自深圳市第三人民醫(yī)院門診部和住院部，經(jīng)結核桿菌培養(yǎng)為陰性，且都有卡介苗接種經(jīng)歷。

潛在結核患者樣本數(shù)為21個，血液樣本來自于上述實施例1所述，且都有卡介苗接種經(jīng)歷。

結核病人樣本數(shù)為29個，血液樣本來自于上述實施例1所述，且都有卡介苗接種經(jīng)歷。

2、診斷過程涉及的試劑

診斷過程涉及的試劑包括ELISA板，IFN-γ包被抗體和檢測抗體，TNF-α包被抗體和檢測抗體，包被抗體緩沖液，檢測抗體稀釋液，洗滌緩沖液，終止緩沖液，TMB，Streptavidin-HRP，RPMI1640，青霉素，鏈霉素，Rv3716c和TrxC。結核診斷特異性抗原ESAT-6，CFP-10和TB7.7來自于QFT-GIT試劑盒。

3、潛在結核ELISA診斷試劑盒制備過程

1)用0.15M pH7.2的PBS作為包被抗體緩沖液稀釋IFN-γ包被抗體和TNF-α包被抗體，具體稀釋度依據(jù)不同抗體公司原料，生產(chǎn)批號和棋盤滴定實驗而定。

2)往96孔ELISA板中加入含有包被抗體的工作液，每孔100μL。每五孔為一個檢測單元，前四孔加入IFN-γ包被抗體工作液，第五孔加入TNF-α包被抗體工作液。

3)4℃過夜。

4)倒掉包被抗體工作液，用洗滌緩沖液洗滌5遍。

5)自然風干。

4、潛在結核ELISA診斷試劑盒操作過程

4.1全血樣本制備

1)將肝素鈉靜脈全血用RPMI1640稀釋10倍。

2)往48孔平底細胞培養(yǎng)板中加入稀釋外周全血，每孔400μL，每個樣本4個重復。

3)每孔添加4μL青霉素(10000U/ml)和4μL鏈霉素(10mg/ml)，得到全血樣本。

4.2 IFN-γ和TNF-αELISA分析

ELISA分析參照達科為生物工程有限公司IFN-γ和TNF-α檢測試劑盒說明進行，具體加樣過程和順序如表5所示：

表5：IFN-γ和TNF-αELISA分析的加樣順序表

5、陽性判定方法

ESAT-6和CFP-10刺激陽性判定閾值為IFN-γ25pg/ml，Rv3716c刺激后陽性判定閾值為IFN-γ/TNF-α2.07，TrxC刺激后陽性判定閾值為IFN-γ/TNF-α1.93。具體陽性判定標準如表6所示。

表6：陽性判定表

6、應用制備的ELISA試劑盒進行潛在結核診斷的實驗結果

對18個健康人，21個潛在結核患者和29個結核病人應用達科為公司制備的潛在結核ELISA檢測試劑盒進行檢測，結果如表7所示。由于Rv3716C和TrxC刺激得到的實驗結果相似，故表7只列出了Rv3716C刺激后得到的檢測結果。從表7中可以看到，孔1(陰性對照)全部為陰性，孔2(陽性對照)全部為陽性，說明試劑盒制備沒有問題，達到質量控制要求。

表7：采用Rv3716C抗原的潛在結核ELISA診斷試劑盒檢測結果

本實施例僅詳細介紹了使用潛在結核特異性抗原Rv3716c或TrxC來制備潛在結核診斷試劑盒，但其保護范圍不限于使用潛在結核特異性抗原Rv3716C或TrxC，還包括使用潛在結核特異性抗原Rv2626c。此外，本實施例僅詳細介紹了使用潛在結核特異性抗原聯(lián)合活動性結核檢測抗原SAT-6，CFP-10和TB7.7，但其保護范圍不限于聯(lián)合SAT-6，CFP-10和TB7.7，還包括聯(lián)合其他活動性結核檢測特異性抗原。另外，潛在結核診斷試劑盒還可以結合ELISA/ELISPOT/流式方法，制備相應的潛在結核ELISA診斷試劑盒、潛在結核ELILSPOT診斷試劑盒和潛在結核流式診斷試劑盒，本實施例僅詳細介紹了潛在結核ELISA診斷試劑盒的制備，但其保護范圍不限于使用其它通用技術使用本抗原，還包括結核ELILSPOT診斷試劑盒和結核流式診斷試劑盒及其他通用技術使用本抗原的試劑盒。

本發(fā)明的實施例2詳細介紹了使用潛在結核特異性抗原并聯(lián)合活動性結核檢測抗原在制備潛在結核診斷試劑盒方面的應用，聯(lián)合后的效果是通過一個產(chǎn)品就能同時區(qū)分健康人、潛在結核患者和活動性結核患者。在其他實施例中，還可以提供一種只檢測潛在結核的試劑盒，與實施例2的區(qū)別僅在于只使用本發(fā)明篩選出的潛在結核特異性抗原，不聯(lián)合其他活動性結核檢測抗原，其他制備步驟和使用方法均相同，從而開發(fā)出一種只檢測潛在結核的試劑盒。

以上內容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。