專利名稱：鑒定腫瘤特異性新抗原的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及腫瘤特異性新抗原的鑒定和這些新抗原生產(chǎn)癌癥疫苗的用途。
背景技術(shù)：
腫瘤疫苗一般由腫瘤抗原和免疫刺激分子(例如細胞因子或TLR配體)組成，其一起工作以誘導(dǎo)識別且裂解腫瘤細胞的抗原特異性細胞毒性T細胞(CTLs)。在這時，幾乎所有疫苗都含有共享的腫瘤抗原或全腫瘤細胞制劑(Gilboa，1999)。共享的腫瘤抗原是跨越許多個體在及WM普遂廣沒表達效免疫jr/i.蛋沒質(zhì)，并且通常作為合成肽或重組蛋白質(zhì)遞送給患者(Boon等人，2006)。相比之下，全#瘦激激彥/名/作為自體被照射細胞、細胞裂解產(chǎn)物、細胞融合物、熱休克蛋白質(zhì)制劑或總mRNA遞送給患者(Parmiani等人,2007)。因為全腫瘤細胞從自體患者中分離，所以細胞表達患者特異性腫瘤抗原以及共享的腫瘤抗原。最后，存在第三類腫瘤抗原，由于鑒定其的技術(shù)困難，其已罕見地用于疫苗中(Sensi等人2006)。這個種類由為系辦#濤勞沒突變—組成，所述腫瘤特異性突變導(dǎo)致改變的氨基酸序列。此類突變的蛋白質(zhì)具有下述潛力:(a)獨特地標(biāo)記腫瘤(相對于非腫瘤細胞)用于由免疫系統(tǒng)識別且破壞(Lennerz等人，2005) ; (b)避免中樞和有時外周T細胞耐受，并且因此由更有效的高親合力T細胞受體識別(Gotter等人，2004)。因此，存在鑒定作為腫瘤疫苗有用的新表位的方法的需要。發(fā)明概述
本發(fā)明部分涉及鑒定能夠引發(fā)腫瘤特異性T細胞應(yīng)答的肽的方法。在一個方面，本發(fā)明提供了通過鑒定具有癌癥的受試者的表達基因中的腫瘤特異性突變來鑒定新抗原的方法。在一些方面，當(dāng)突變是點突變時，該方法進一步包括鑒定具有該突變的突變型肽。優(yōu)選地，突變型肽以大于野生型肽的親和力結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)，并且具有小于500 nm的IC50 ;在其他方面，當(dāng)突變是剪接位點、移碼、連讀或基因融合突變時，該方法進一步包括鑒定由該突變編碼的突變型多肽。優(yōu)選地，突變型多肽結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)。任選地,該方法進一步包括選擇激活抗腫瘤⑶8 T細胞的肽或多肽。突變型肽或多肽優(yōu)選以大于野生型肽的親和力結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)，并且具有小于500 nm的IC50。優(yōu)選地，該肽或多肽具有小于250 nm的IC50。更優(yōu)選地，該肽或多肽具有小于100 nm的IC50。最優(yōu)選地，該肽或多肽具有小于50 nm的IC50。突變型肽長度為約8-10個氨基酸。在另一個方面，長度為約8-50個氨基酸。例如，突變型肽長度大于10個氨基酸、長度大于15個氨基酸、長度大于20個氨基酸、長度大于30個氨基酸。優(yōu)選地，突變型肽長度為約24-40個氨基酸。在進一步方面，本發(fā)明提供了通過施用根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的一種或多種肽或多肽和佐劑，在受試者中誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的方法。佐劑是例如基于TLR的佐劑或基于礦物油的佐劑。在一些方面，該肽或多肽和基于TLR的佐劑由基于礦物油的佐劑乳化。任選地，該方法進一步包括施用抗免疫抑制劑例如抗CTLA-4抗體、抗roi抗體、抗ro-Ll抗體、抗⑶25抗體或IDO的抑制劑。在另外一個方面，本發(fā)明提供了通過給受試者施用自體樹突細胞或抗原呈遞細胞(其已用根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的一種或多種肽或多肽脈沖)，在受試者中誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的方法。任選地，該方法進一步包括施用佐劑，例如基于TLR的佐劑或基于礦物油的佐劑。在一些方面，該肽或多肽和基于TLR的佐劑由基于礦物油的佐劑乳化。在一些實施方案中，該方法進一步包括施用抗免疫抑制劑?？姑庖咭种苿┌ɡ缈笴TLA-4抗體、抗PDl抗體、抗I3D-Ll抗體、抗⑶25抗體或IDO的抑制劑。在另一個方面，本發(fā)明提供了通過鑒定受試者的表達基因中的多個腫瘤特異性突變就癌癥免疫接種或治療受試者的方法，鑒定具有所鑒定的腫瘤特異性突變的突變型肽或多肽，選擇一種或多種鑒定的突變型肽或多肽，其以大于野生型肽的親和力結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)，并且能夠激活抗腫瘤CD8 T細胞，并且給受試者施用一種或多種選擇的肽、多肽或用一種或多種鑒定的肽或多肽脈沖的自體樹突細胞或抗原呈遞細胞。突變型肽長度為約8-10個氨基酸。在另一個方面，長度為約8-50個氨基酸。例如，突變型肽長度大于10個氨基酸、長度大于15個氨基酸、長度大于20個氨基酸、長度大于30個氨基酸。優(yōu)選地，突變型肽長度為約24-40個氨基酸。任選地，該方法進一步包括施用佐劑，例如基于TLR的佐劑或基于礦物油的佐劑。在一些方面，該肽或多肽和基于TLR的佐劑由基于礦物油的佐劑乳化。在一些實施方案中，該方法進一步包括施用抗免疫抑制劑?？姑庖咭种苿┌ɡ缈笴TLA-4抗體、抗roi抗體、抗ro-Ll抗體、抗⑶25抗體或IDO的抑制劑。權(quán)利要求22的方法，其中所述受試者已接受造血干細胞移植。受試者是人、犬、貓或馬。癌癥是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、胃癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、頭與頸癌、胰腺癌、腦癌、黑素瘤、淋巴瘤例如B細胞淋巴瘤或白血病，例如急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病或T細胞淋巴細胞白血病。本發(fā)明中還包括的是含有根據(jù)本發(fā)明的方法鑒定的肽或多肽和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。例如，本發(fā)明提供了含有至少兩種不同的SF3B1肽的組合物，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有
在氨基酸位置625處的亮氨酸；
在氨基酸位置626處的組氨酸；
在氨基酸位置700處的谷氨酸；
在氨基酸位置742處的天冬氨酸；或
在氨基酸位置903處的精氨酸，當(dāng)依照野生型SF3B1編號時。本發(fā)明還提供了含有至少兩種不同的MYD88肽的組合物，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有
在氨基酸位置232處的蘇氨酸；在氨基酸位置258處的亮氨酸；或 在氨基酸位置265處的脯氨酸，當(dāng)依照野生型MYD88編號時。
本發(fā)明進一步提供了含有至少兩種不同的TP53肽的組合物，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有在氨基酸位置111處的精氨酸；在氨基酸位置215處的精氨酸；在氨基酸位置238處的絲氨酸；在氨基酸位置248處的谷氨酰胺；在氨基酸位置255處的苯丙氨酸；在氨基酸位置273處的半胱氨酸或在氨基酸位置281處的天冬酰胺，當(dāng)依照野生型TP53編號時。本發(fā)明進一步提供了含有至少兩種不同的ATM肽的組合物，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有
在氨基酸位置1252處的苯丙氨酸；在氨基酸位置2038處的精氨酸；在氨基酸位置2522處的組氨酸；或在氨基酸位置2954處的半胱氨酸，當(dāng)依照野生型ATM編號時。組合物包含至少兩種不同的Abl肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有在氨基酸位置244處的纈氨酸；
在氨基酸位置248處的纈氨酸；
在氨基酸位置250處的谷氨酸；在氨基酸位置250處的丙氨酸；在氨基酸位置252處的組氨酸；在氨基酸位置252處的精氨酸；在氨基酸位置253處的苯丙氨酸；在氨基酸位置253處的組氨酸；在氨基酸位置255處的賴氨酸；在氨基酸位置255處的纈氨酸；在氨基酸位置276處的甘氨酸；在氨基酸位置315處的異亮氨酸；在氨基酸位置315處的天冬酰胺；在氨基酸位置317處的亮氨酸；在氨基酸位置343處的蘇氨酸；在氨基酸位置351處的蘇氨酸；在氨基酸位置355處的甘氨酸；在氨基酸位置359處的纈氨酸；在氨基酸位置359處的丙氨酸；在氨基酸位置379處的異亮氨酸；在氨基酸位置382處的亮氨酸；在氨基酸位置387處的甲硫氨酸；在氨基酸位置396處的脯氨酸；在氨基酸位置396處的精氨酸；在氨基酸位置417處的酪氨酸；或在氨基酸位置486處的絲氨酸，當(dāng)依照野生型ABL編號時。在本發(fā)明中進一步包括的是含有至少兩種不同的FBXW7肽的組合物，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有在氨基酸位置280處的亮氨酸；在氨基酸位置465處的組氨酸；在氨基酸位置505處的半胱氨酸；或在氨基酸位置597處的谷氨酸，當(dāng)依照野生型FBXW7編號時。在進一步方面，本發(fā)明提供了含有至少兩種不同的MAPKl肽的組合物，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有在氨基酸位置162處的天冬酰胺；在氨基酸位置291處的甘氨酸；或
在氨基酸位置316處的苯丙氨酸，當(dāng)依照野生型MAPKl編號時。本發(fā)明還提供了含有至少兩種不同的GNBl肽的組合物，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有在氨基酸位置180處的蘇氨酸，當(dāng)依照野生型GNBl編號時。還由本發(fā)明提供的是用長度等于或小于50個氨基酸的Bcr-abl肽的組合物治療具有伊馬替尼抗性腫瘤的受試者或HLA-A3陽性受試者的方法，所述Bcr-abl肽含有在氨基酸位置255處的賴氨酸，當(dāng)依照野生型bcr-abl編號時。由本發(fā)明進一步提供的是治療具有伊馬替尼抗性腫瘤的受試者的方法，其包括給受試者施用含有bcr-abl突變的一種或多種肽，其中所述肽等于或小于50個氨基酸，并且以小于500 nm的IC50結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有由本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解相同的含義。盡管與本文描述那些相似或等價的方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐中，但下文描述了合適的方法和材料。所有出版物、專利申請、專利和本文提及的其他參考文獻特別整體引入作為參考。在沖突的情況下，以本說明書包括定義為準(zhǔn)。此外，本文描述的材料、方法和實施例僅是舉例說明性的且不預(yù)期是限制性的。本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點通過下述詳述和權(quán)利要求將是顯而易見的且由其包含。附圖簡述


圖1顯示了使用3類抗原用于腫瘤疫苗的特異性和自身免疫毒性的平衡。全腫瘤細胞可能是對于腫瘤疫苗最少特異性的抗原制劑，因為在腫瘤細胞中表達的全套蛋白質(zhì)抗原包括也存在于機體的其他細胞中的數(shù)千種蛋白質(zhì)。過表達的腫瘤抗原是略微更特異性的，因為它們已就與機體的其他細胞相比較在腫瘤中高得多和更多選擇性表達進行選擇。然而，就這些抗原的表達測試在機體中的每一種細胞是不可能，并且存在其他細胞表達其的基本危險。最后，突變的蛋白質(zhì)生成僅存在于腫瘤細胞中且提供最大水平的特異性的新表位。圖2是用于個人化新抗原疫苗接種策略的方案，其可以應(yīng)用于任何癌癥的治療。我們還突出顯示了在兩種獨特情況下應(yīng)用這種策略的可能性。在第一種情況下，患者在造血干細胞移植(HSCT)(例如對于CLL、CML和其他白血病完成的)后的早期接種疫苗。HSCT后的早期是獨特的治療背景，因為免疫系統(tǒng)由于用HSCT重構(gòu)而是感受態(tài)的，從而克服腫瘤或治療誘導(dǎo)的宿主免疫缺陷。此外，在淋巴細胞減少的環(huán)境中穩(wěn)態(tài)細胞因子的豐度，例如在早期HSCT后的背景中，可以促成T細胞的快速擴增。在第二種情況下，患者在疾病過程早期接種疫苗，當(dāng)免疫能力在疾病的早期中可以變得更完整時，在通過暴露于化學(xué)療法(例如用于實體或造血系統(tǒng)腫瘤)的損傷前。因為免疫系統(tǒng)在這兩種特異性情況下可能是最活性的，所以我們建議這些是用于應(yīng)用腫瘤疫苗接種策略的理想情況。圖3顯示了以3步描述的用于鑒定腫瘤新表位的策略:(I)使用測序技術(shù)，檢測存在于腫瘤中但不存在于單個患者的種系DNA中的基因突變；(2)使用預(yù)測算法，預(yù)測突變的肽是否具有結(jié)合個人HLA等位基因的潛力；這些預(yù)測的肽可以任選對于結(jié)合合適的HLA蛋白質(zhì)在實驗上測試。此外，這些基因還必須在腫瘤細胞中表達。(3)離體生成T細胞且測試它們是否能夠識別表達突變蛋白質(zhì)的細胞；可替代地，質(zhì)譜法可以用于檢測從腫瘤細胞表面HLA蛋白質(zhì)中洗脫的肽。對于慢性淋巴細胞白血病，我們迄今為止的研究證實存在平均23個蛋白質(zhì)改變突變/患者，46種預(yù)測的結(jié)合突變型肽和15-25種驗證的結(jié)合突變型肽。在這些中，我們預(yù)期 7-12種肽在腫瘤細胞中表達且加工(盡管這跨越腫瘤和患者可以不同)。圖4顯示了五類突變生成潛在的腫瘤新表位。新的腫瘤特異性表位可以由于錯義、剪接位點、移碼或連讀點突變(紅色星號)而出現(xiàn)，或由兩種基因的融合(或在相同基因內(nèi))而出現(xiàn)。特別地，剪接位點、移碼、連讀突變和基因融合可以各自生成新的氨基酸段(以品紅色)，其通常是不翻譯的，但目前由于突變而表達且翻譯。錯義突變導(dǎo)致具有單個氨基酸變化的肽。圖5顯示了在CLL患者中的突變頻率/種類。我們將下一代測序應(yīng)用于7個CLL腫瘤系列的研究揭示CLL細胞具有許多突變，其提供可能的突變肽的豐富來源。我們觀察到在CLL中的非沉默基因改變的總數(shù)目范圍為17-155/個體，其中大多數(shù)是體細胞改變的點突變(錯義)。4個患者的腫瘤還具有剪接位點突變；對于3個患者,通過RNA測序鑒定新基因融合。
圖6顯示了針對患者的6個HLA (MHC I類)等位基因中的每一個來自肽結(jié)合(對于具有特異性錯義突變的肽)的自動化預(yù)測(圖3中的策略的步驟2A)的數(shù)據(jù)。品紅色=強結(jié)合劑；綠色=中等結(jié)合劑。圖7顯示了用于證實突變基因的RNA表達(圖3中的策略的步驟2B)的方法。A.對于CLL患者7，我們發(fā)現(xiàn)具有預(yù)測的HLA結(jié)合肽的超過一半的突變基因在RNA水平上表達。B.我們還已使用RNA焦磷酸測序，以檢測具有在DNA中發(fā)現(xiàn)的特異性突變的表達的RNAs0 C.我們可以使用斷裂點區(qū)(描述的是對于患者2發(fā)現(xiàn)的融合)的PCR-TOPO克隆，驗證通過DNA測序可見的新基因融合。圖8顯示了用于HLA肽結(jié)合的實驗驗證(圖3中的策略的步驟2C)的方法和數(shù)據(jù)。A.關(guān)于與特異性HLA等位基因的肽結(jié)合的實驗驗證的方案。B.在患者I和2中鑒定的候選突變肽的概括。加陰影的室指示分析在進行中。C.關(guān)于對于患者2由基因改變(錯義突變或基因融合)生成的肽預(yù)測與實驗驗證的結(jié)合親和力比較的數(shù)據(jù)。IC5(l〈120nM的預(yù)測截斷(在左側(cè)的垂直實線)導(dǎo)致所有肽顯示與I類HLA的實驗結(jié)合。圖9顯示了突變與種系(即，也稱為親本、野生型或正常)肽比較與HLA等位基因的預(yù)測差異結(jié)合?；颊?的25種預(yù)測的HLA結(jié)合突變肽中的12種具有比親本肽>2倍大的結(jié)合(截斷=紅色虛線)。這進一步增加突變肽的特異性。突變肽由于兩個原因是特異性的:首先，識別突變肽的許多T細胞受體不可能檢測野生型親本肽；其次，一些突變肽可以以比親本肽更高的親和力結(jié)合HLA。因為第一種性質(zhì)不能計算預(yù)測，所以我們集中于預(yù)測第二種性質(zhì)，且僅選擇那些肽用于包括在疫苗中，所述肽相對于野生型肽關(guān)于突變顯示與HLA的更高結(jié)合。圖10顯示了針對候選的個人CLL新表位的T細胞反應(yīng)性(圖3中的策略的步驟3)。我們觀察到在治療后從患者I中分離的T細胞可以檢測特異性突變的TLK2肽(肽#7)(使用Elispot測定)。圖11顯示了 BCR-ABL突變生成預(yù)期為結(jié)合HLA-A和HLA-B等位基因的許多肽。通過應(yīng)用 NetMHC 預(yù)測算法(Nielsen 等人 PLoS One.2007，2(8): e796)，我們預(yù)測由 BCR-ABL突變生成的肽具有結(jié)合8種常見HLA-A和-B等位基因的潛力。最常見的BCR-ABL突變以遞減頻率排序(從左到右)，且描述了多種I類MHC結(jié)合肽的預(yù)測IC50。總之，我們預(yù)測了 84種肽以良好親和力結(jié)合跨越廣泛范圍的HLA等位基因，所述良好親和力定義為小于1000的IC50。在所有預(yù)測的肽中，84種中的24種(29%)預(yù)測為具有IC50〈50的歲結(jié)合劑。42種肽(50%)是中等結(jié)合劑，定義為在50和500之間的IC50。18種肽(21%)是定義為IC50在500和1000之間的弱結(jié)合劑。圖12顯示了具有E255K突變的BCR-ABL肽結(jié)合HLA蛋白質(zhì)，且與存在于CML患者中的特異性、多功能T細胞結(jié)合。A.E255K-B (和親本肽)與HLA A3和超型成員的實驗衍生的結(jié)合得分。B.在HSCT后由HLAA3+ E255K+患者擴增的⑶8+ T細胞中，我們檢測到針對E255K-B (MUT)肽的IFNy分泌和表達E255K小基因(MG)的表達A3+的APCs。這個應(yīng)答在I類封閉抗體(w6/32)的存在下是取消的。C.1FNy分泌細胞對于突變肽也是四聚體+，并且是(D)多功能的，分泌IP10、TNFa和GM-CSF (基于Luminex測定)。圖13顯示了患者衍生的T細胞克隆可以識別腫瘤特異性表位且殺死呈現(xiàn)這些表位的細胞。A.與CML66 (肽66-72C)的CD8+ T細胞表位的反應(yīng)性受HLA B-4403限制。B.CML66 mRNA可以有效核轉(zhuǎn)染到⑶40L擴增的B細胞內(nèi)。C.CML66特異性⑶8+ T細胞對于通過RNA核轉(zhuǎn)染或通過肽脈沖表達CML66的⑶40L B細胞而不是對照靶是細胞毒性的。圖14顯示了在CLL中顯著突變的基因。A.在64個CLL樣品中9種最顯著突變的基因。N -跨越64個測序的樣品在堿基對中覆蓋的總領(lǐng)域。通過比較察看觀察到的突變叢(constellation)的概率與跨越數(shù)據(jù)集計算的本底突變率來計算P和q值。紅色條-先前未知在CLL中是突變的基因；灰色條-其中在CLL中的突變先前已報道的基因。B.在64個CLLs中(在CLLs樣品中的位置和突變顯示在基因上)發(fā)現(xiàn)的在J7￥、SF3BU TP53、MYD88、FBXW7、DDX3X、MAPKl和007中的突變類型(錯義、剪接位點、無義)和定位，與文獻或COSMIC數(shù)據(jù)庫中先前報道的突變相比較(線顯示在基因下的突變位置)。圖15顯示了 SF3B1在CLL樣品中表達(曲線圖中的第7個柱)且具有比許多對照細胞更高的表達，包括:PBMC，M:單核細胞、CC:癌細胞系(包括K562、Jurkat, M9、MCF_7、Hela, Ovcar、RPM1、OTM、MCF-CAR、KM12BM 和 MM1S)。圖16顯示了 SF3B1突變生成預(yù)期為結(jié)合患者特異性HLA等位基因的肽。例如，包括常見SF3B1 K700E突變的一種肽預(yù)測為強烈結(jié)合HLA。發(fā)明詳述
開發(fā)治愈和腫瘤特異性免疫療法的關(guān)鍵障礙之一是高度限制的腫瘤抗原的鑒定和選擇，以避免自身免疫。由于在惡性細胞內(nèi)的遺傳改變出現(xiàn)的腫瘤新抗原代表最腫瘤特異性種類的抗原。由于鑒定其的技術(shù)困難，新抗原已罕見地用于疫苗中。我們鑒定腫瘤特異性新表位的方法涉及三個步驟。(I)使用腫瘤的全基因組或全外顯子組(即，僅捕獲的外顯子)或RNA測序與來自每個患者的匹配種系樣品比較鑒定DNA突變；(2)應(yīng)用驗證的肽-MHC結(jié)合預(yù)測算法，以生成可以結(jié)合患者HLA等位基因且基于腫瘤中存在的非沉默突變的一組候選T細胞表位；和(3)任選證實針對突變肽的抗原特`異性T細胞或證實候選肽結(jié)合腫瘤表面上的HLA蛋白質(zhì)。相應(yīng)地，本發(fā)明涉及用于鑒定和/或檢測抗原的T細胞表位的方法。具體地，本發(fā)明提供了鑒定和/或檢測腫瘤特異性新抗原的方法，所述腫瘤特異性新抗原用于誘導(dǎo)受試者中的腫瘤特異性免疫應(yīng)答。特別地，本發(fā)明提供了通過鑒定受試者的基因組中的多個腫瘤特異性突變來免疫接種或治療受試者的方法。選擇具有鑒定的突變且結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)的突變型肽和多肽。任選地，這些肽和多肽以大于野生型肽的親和力結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)，和/或能夠激活抗腫瘤CD8 T細胞。將這些肽施用于受試者。可替代地，施用已用該肽脈沖的自體抗原呈遞細胞。在腫瘤的免疫控制中突變抗原或新抗原的重要性已在基本(seminal)研究中得到理解，所述基本研究顯示:(a)小鼠和人通常發(fā)動針對突變抗原的T細胞應(yīng)答(Parmiani等人，2007 ；Sensi和Anichini，2006) ; (b)小鼠可以通過用腫瘤中存在的單一突變肽免疫接種保護不受腫瘤(Mandelboim等人，1995) ; (c)自發(fā)或疫苗介導(dǎo)的長期黑素瘤幸存者發(fā)動針對突變抗原的強記憶細胞毒性T細胞(CTL)應(yīng)答(Huang等人，2004 ；Lennerz等人，2005 ；Zhou等人，2005a) ; (d)最后，當(dāng)用存在于自體腫瘤細胞中的患者特異性的突變免疫球蛋白蛋白質(zhì)免疫接種時，濾泡型淋巴瘤患者顯示分子緩解。(Baskar等人,2004)。此外,在這些患者中的CTL應(yīng)答直接針對突變而不是共享的免疫球蛋白蛋白質(zhì)區(qū)。另外，此類突變肽具有下述潛力:(a)獨特地標(biāo)記腫瘤用于由免疫系統(tǒng)識別且破壞，從而減少關(guān)于自身免疫的危險jP(b)避免中樞和外周T細胞耐受，允許抗原由更有效的高親合力T細胞受體識別。(圖1)。在任何特定基因中的同一突變很少跨越腫瘤發(fā)現(xiàn)(且甚至對于最常見的驅(qū)動突變以低頻率)。因此，本發(fā)明的方法將包括鑒定患者特異性腫瘤突變。使用高度平行的測序技術(shù)、HLA肽結(jié)合預(yù)測工具和生物化學(xué)測定，本發(fā)明的方法將允許:(1)綜合鑒定表達且結(jié)合患者的腫瘤中存在的HLA蛋白質(zhì)的突變肽；(2)監(jiān)控癌癥患者針對這些鑒定的新表位的天然免疫應(yīng)答；(3)測定在患者HLA蛋白質(zhì)的背景中識別這些肽的細胞毒性T細胞是否可以離體選擇性裂解自體腫瘤細胞。這個策略解決涉及癌癥患者的免疫系統(tǒng)如何與腫瘤新表位相互作用的幾個基本問題。這些包括:腫瘤新表位的哪個和何種部分由T細胞檢測，多少T細胞前體能夠響應(yīng)新表位，新表位特異性記憶和效應(yīng)T細胞在循環(huán)和腫瘤中有多頻繁，T細胞對于這些表位具有多少親合力，新表位特異性T細胞是有功能的嗎？這些問題的答案提供關(guān)于在人疫苗中使用腫瘤新表位的理由和策略。人的免疫系統(tǒng)可以分類成兩個功能子系統(tǒng)，即先天性和獲得性免疫系統(tǒng)。先天性免疫系統(tǒng)是針對感染的第一線防御，并且大多數(shù)潛在病原體在它們可以引起例如顯著感染之前快速中和。獲得性免疫系統(tǒng)與侵入生物的稱為抗原的分子結(jié)構(gòu)反應(yīng)。存在兩類獲得性免疫反應(yīng)，即體液免疫反應(yīng)和細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在體液免疫反應(yīng)中，由B細胞分泌到體液內(nèi)的抗體結(jié)合病原體衍生的抗原，導(dǎo)致通過多種機制的病原體消除，例如補體介導(dǎo)的裂解。在細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，激活能夠破壞其他細胞的T細胞。如果例如與疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)存在于細胞中，那么它們在細胞內(nèi)蛋白酶解斷裂為肽。特異性細胞蛋白質(zhì)隨后將其自身附著至以這種方式形成的抗原或肽，并且將其轉(zhuǎn)運至細胞的表面，在其中它們呈遞給機體的分子防御機制，特別是T細胞。細胞毒性T細胞識別這些抗原且殺死具有該抗原的細胞。轉(zhuǎn)運且在細胞表面上呈遞肽的分子稱為主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的蛋白質(zhì)。MHC蛋白質(zhì)分類成I類和II類MHC蛋白質(zhì)。兩個MHC種類的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)非常相似；然而，它們在其功能中相當(dāng)大地不同。MHC I類的蛋白質(zhì)存在于機體的幾乎所有細胞包括大多數(shù)腫瘤細胞的表面上。MHC I類的蛋白質(zhì)裝載有抗原，所述抗原通常源于內(nèi)源性蛋白質(zhì)或細胞內(nèi)存在的病原體，并且隨后呈遞給細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)。II類的MHC蛋白質(zhì)僅存在于樹突細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞和其他抗原呈遞細胞上。它們主要將由體外抗原來源即細胞外加工的肽呈遞給T輔助(Th)細胞。由I類MHC蛋白質(zhì)結(jié)合的大多數(shù)肽源于在健康宿主生物自身中產(chǎn)生的細胞質(zhì)蛋白質(zhì)，且通常不刺激免疫反應(yīng)。相應(yīng)地，識別此類自身肽呈遞的I類MHC分子的細胞毒性T淋巴細胞在胸腺中缺失，或在其從胸腺中釋放后，被缺失或滅活，即耐受。MHC分子僅在它們將肽呈遞給非耐受的細胞毒性T淋巴細胞時，才能刺激免疫反應(yīng)。細胞毒性T淋巴細胞在其表面上具有T細胞受體(TCR)和CD8分子。T細胞受體能夠識別且結(jié)合由MHC I類分子復(fù)合的肽。每個細胞毒性T淋巴細胞表達獨特的T細胞受體，其能夠結(jié)合特異性MHC/肽復(fù)合物。肽通過在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的競爭親和力結(jié)合將其自身附著至MHC I類分子，在它們呈遞在細胞表面上之前。此處，個別肽的親和力直接連接至其氨基酸序列和在氨基酸序列內(nèi)的限定位置中特異性結(jié)合基序的存在。如果此類肽的序列是已知的，那么例如使用例如肽疫苗可以操縱免疫系統(tǒng)針對患病細胞。使用計算機算法，可以預(yù)測潛在的T細胞表位，即肽序列，其由以肽呈遞的復(fù)合物形式的I類或II類MHC分子結(jié)合，且隨后以這種形式，由T淋巴細胞的T細胞受體識別。目前，特別使用兩種程序，即 SYFPEITHI (Rammensee 等人,Immunogenetics, 50 (1999),213-219)和 HLA_BIND (Parker 等人，J.1mmunol., 152 (1994)，163-175)。潛在地可以結(jié)合I類MHC分子的以這種方式測定的肽序列隨后已在體外檢查其實際結(jié)合能力。本發(fā)明的技術(shù)目的是提供用于鑒定且篩選腫瘤細胞中存在的潛在T細胞表位的改良方法，所述方法允許就其結(jié)合特異性MHC分子的能力同時和快速檢查大量肽序列。在本發(fā)明中，它基于其的技術(shù)目的通過提供用于鑒定和/或檢測突變抗原的方法實現(xiàn)，所述突變抗原存在于腫瘤中但不存在于正常組織中。該方法使用癌癥患者基因組的整個編碼部分的大量平行基因組測序，以鑒定腫瘤中的特異性突變基因。為了縮小突變型肽至具有比野生型肽更強烈地結(jié)合HLA的潛力并且因此賦予腫瘤特異性的那些，充分建立的算法將用于預(yù)測結(jié)合每個患者的6個獨特的I類HLA等位基因中的任何的肽，并且將計算對于具有腫瘤特異性突變殘基的所有9或10聚體肽與具有種系殘基的那些比較的預(yù)測IC50。一般地，具有預(yù)測的IC50〈50nM的肽一般視為中等至高親和力結(jié)合肽，且將選擇用于以經(jīng)驗為主地使用HLA結(jié)合的生物化學(xué)測定測試其親和力。最后，將測定人免疫系統(tǒng)是否可以發(fā)動針對這些突變的腫瘤抗原的有效免疫應(yīng)答且因此有效殺死腫瘤而不是正常細胞。定義
“T細胞表位”應(yīng)理解為意指這樣的肽序列，其可以由以肽呈遞的MHC分子或MHC復(fù)合物形式的I或II類MHC分子結(jié)合，并且隨后以這種形式分別由細胞毒性T淋巴細胞或T輔助細胞識別且結(jié)合。“受體”應(yīng)理解為意指能夠結(jié)合配體的生物學(xué)分子或分子分組。受體可以作用于傳輸細胞、細胞形成或生物中的信息。受體包含至少一個受體單位且優(yōu)選兩個受體單位，其中每個受體單位可以由蛋白質(zhì)分子特別是糖蛋白分子組成。受體具有補充配體那種的結(jié)構(gòu)且可以將配體復(fù)合為結(jié)合配偶體。信息特別通過在細胞表面上的配體復(fù)合后受體的構(gòu)象變化傳輸。根據(jù)本發(fā)明，受體應(yīng)理解為特別意指能夠與配體形成受體/配體復(fù)合物的MHC I和II類蛋白質(zhì)，特別是合適長度的肽或肽片段?！芭潴w”應(yīng)理解為意指具有補充受體那種的結(jié)構(gòu)且能夠與這種受體形成復(fù)合物的分子。根據(jù)本發(fā)明，配體應(yīng)理解為特別意指在其氨基酸序列中具有合適長度和合適結(jié)合基序的肽或肽片段，從而使得肽或肽片段能夠與MHC I類或MHC II類的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物。“受體/配體復(fù)合物”也應(yīng)理解為意指“受體/肽復(fù)合物”或“受體/肽片段復(fù)合物”，特別是呈遞I類或II類MHC分子的肽或肽片段?！爸饕M織相容性復(fù)合物(MHC)的蛋白質(zhì)或分子”、“MHC分子”、“MHC蛋白質(zhì)”或“HLA蛋白質(zhì)”應(yīng)理解為特別意指這樣的蛋白質(zhì)，其能夠結(jié)合起因于蛋白質(zhì)抗原的蛋白酶解切割且代表潛在的T細胞表位的肽，將其轉(zhuǎn)運至細胞表面且將其在那里呈遞給特異性細胞，特別是細胞毒性T淋巴細胞或T輔助細胞?；蚪M中的主要組織相容性復(fù)合物包含遺傳區(qū)，其在細胞表面上表達的基因產(chǎn)物對于結(jié)合且呈遞內(nèi)源和/或外源抗原且從而對于調(diào)節(jié)免疫過程是重要的。主要組織相容性復(fù)合物分類成編碼不同蛋白質(zhì)的兩組基因，即MHCI類分子和MHC II類分子。兩個MHC種類的分子對于不同抗原來源是專門的。MHC I類分子呈遞內(nèi)源合成的抗原，例如病毒蛋白質(zhì)和腫瘤抗原。MHC II類分子呈遞源于外部來源的蛋白質(zhì)抗原，例如細菌產(chǎn)物。兩個MHC種類的細胞生物學(xué)和表達模式適合于這些不同作用。I類MHC分子由重鏈和輕鏈組成，并且能夠結(jié)合約8 - 11個氨基酸，但通常9或10個氨基酸的肽，如果這種肽具有合適的結(jié)合基序，并且將其呈遞給細胞毒性T淋巴細胞。由I類MHC分子結(jié)合的肽源于內(nèi)源蛋白質(zhì)抗原。I類MHC分子的重鏈優(yōu)選是HLA-A、HLA-B或HLA-C單體，并且輕鏈?zhǔn)铅?-2-微球蛋白。II類MHC分子由α鏈和β組成且能夠結(jié)合約15 - 24個氨基酸的肽，如果這種肽具有合適的結(jié)合基序，且將其呈遞給T輔助細胞。由II類MHC分子結(jié)合的肽通常源于細胞外的外源蛋白質(zhì)抗原。α鏈和β鏈特別是HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP單體。“疫苗”應(yīng)理解為意指用于生成用于疾病預(yù)防和/或治療的免疫性的組合物。相應(yīng)地，疫苗是包含抗原的藥物，且預(yù)期通過疫苗接種在人或動物中用于生成特異性防御和保護物質(zhì)。“分離的”意指多核苷酸或多肽或其片段、變體或衍生物，其已基本上去除與之天然結(jié)合的其他生物學(xué)材料，或基本上不含例如衍生自重組宿主細胞的其他生物學(xué)材料，所述重組宿主細胞已遺傳改造為表達本發(fā)明的多肽。“新抗原”意指起于表達蛋白質(zhì)的腫瘤特異性突變的一類腫瘤抗原。“純化的”意指多核苷酸或多肽或其片段、變體或衍生物，其基本上不含與之天然結(jié)合的其他生物學(xué)材料，或不含例如衍生自重組宿主細胞的其他生物學(xué)材料，所述重組宿主細胞已遺傳改造為表達本發(fā)明的多肽。即，例如本發(fā)明的純化多肽是至少約70-100%純的多肽，即多肽存在于組合物中，其中多肽構(gòu)成按總組合物的重量計約70-100%。在一些實施方案中，本發(fā)明的純化多肽是按重量計約75%-99%純、按重量計約80%-99%純、按重量計約90%-99%純、或按重量計約95% - 99%純。
_7] 腫瘤特異性突變的鑒定
本發(fā)明基于特定突變(例如存在于癌細胞中的變體或等位基因)的鑒定。特別地，這些突變存在于具有癌癥的受試者的癌細胞的基因組中但不存在于來自受試者的正常組織中。腫瘤中的遺傳突變會視為對于腫瘤的免疫學(xué)靶向有用，如果它們導(dǎo)致在腫瘤中專一的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的變化。有用的突變包括:(I)導(dǎo)致蛋白質(zhì)中的不同氨基酸的非同義突變；(2)其中終止密碼子被修飾或缺失的連讀突變，導(dǎo)致在C末端具有新腫瘤特異性序列的更長蛋白質(zhì)的翻譯；(3)導(dǎo)致成熟mRNA中包括內(nèi)含子和因此獨特的腫瘤特異性蛋白質(zhì)序列的剪接位點突變；(4)引起在2個蛋白質(zhì)的連接處(即基因融合)具有腫瘤特異性序列嵌合蛋白質(zhì)的染色體重排；(5)導(dǎo)致具有新的腫瘤特異性蛋白質(zhì)序列的新開放讀碼框的移碼突變或缺失。起于腫瘤細胞中的例如剪接位點、移碼、連讀或基因融合突變的具有突變的肽或突變多肽可以通過在腫瘤與正常細胞中比較測序DNA、RNA或蛋白質(zhì)進行鑒定。還在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是包括先前鑒定的腫瘤特異性突變的肽。已知腫瘤突變可以在 http://www.sanger.ac.uk/cosmic 處找至丨J。多種方法可用于檢測個體的DNA或RNA中特定突變或等位基因的存在。在這個領(lǐng)域中的進展已提供準(zhǔn)確、容易和價廉的大規(guī)模SNP基因分型。最近以來，例如，已描述了幾個新技術(shù)，包括動態(tài)等位基因特異性雜交(DASH)、微板陣列對角線凝膠電泳(MADGE)、焦磷酸測序、寡核苷酸特異性連接、TaqMan系統(tǒng)以及多種DNA“芯片”技術(shù),例如Affymetrix SNP芯片。這些方法要求一般通過PCR擴增靶遺傳區(qū)。基于通過侵襲切割隨后為質(zhì)譜法或固定掛鎖探針和滾環(huán)擴增的小信號分子生成的另外其他新開發(fā)方法，可能最后消除關(guān)于PCR的需要。本領(lǐng)域已知的用于檢測特異性單核苷酸多態(tài)性的幾種方法在下文概括。本發(fā)明的方法應(yīng)理解為包括所有可獲得的方法?；赑CR的檢測方法可以包括多個標(biāo)記同時的多路擴增。例如，本領(lǐng)域眾所周知的是選擇PCR引物以生成PCR產(chǎn)物，其在大小中不重疊且可以同時分析?？商娲兀梢杂靡飻U增不同標(biāo)記，所述引物差異標(biāo)記且從而可以各自差異檢測。當(dāng)然，基于雜交的檢測方法允許樣品中的多個PCR產(chǎn)物的差異檢測。其他技術(shù)是本領(lǐng)域已知的，以允許多個標(biāo)記的多路分析。幾種方法已得到開發(fā)，以促進基因組DNA或細胞RNA中的單核苷酸多態(tài)性的分析。在一個實施方案中，單堿基多態(tài)性可以通過使用專門的外切核酸酶抗性核苷酸進行，如例如Mundy，C.R.(美國專利號4，656，127)中公開的。根據(jù)該方法，與多態(tài)位點3’緊鄰的等位基因序列互補的引物允許與得自特定動物或人的靶分子雜交。如果在靶分子上的多態(tài)位點含有與存在的特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互補的核苷酸，那么那種衍生物將摻入雜交引物的末端上。此類摻入致使引物對外切核酸酶有抗性，并且從而允許其檢測。因為樣品的外切核酸酶抗性衍生物的身份是已知的，所以引物已變得對外切核酸酶抗性的發(fā)現(xiàn)揭示存在于靶分子的多態(tài)位點中的核苷酸與反應(yīng)中使用的核苷酸衍生物的那種互補。這種方法具有它不要求測定大量外部序列數(shù)據(jù)的優(yōu)點。在本發(fā)明的另一個實施方案中，基于溶液的方法用于測定多態(tài)位點的核苷酸的身份。Cohen, D.等人(法國專利2，650，840 ;PCT申請?zhí)朩091/02087)。如在美國專利號4，656，127的Mundy方法中，采用與多態(tài)位點3’緊鄰的等位基因序列互補的引物。該方法使用標(biāo)記的雙脫氧核苷酸衍生物測定那個位點的核苷酸的身份，如果與多態(tài)位點的核苷酸互補，那么所述核苷酸將變得摻入引物的末端上。稱為遺傳位點分析(Genetic Bit Analysis)或GBA 的可替代方法由Goelet,P.等人(PCT申請?zhí)?2/15712)描述。Goelet，P.等人的方法使用標(biāo)記的終止子和與多態(tài)位點3’的序列互補的引物的混合物。摻入的標(biāo)記的終止子因此通過待評估的靶分子的多態(tài)位點中存在的核苷酸測定且與之互補。與Cohen等人(法國專利2，650，840 ；PCT申請?zhí)朩091/02087)的方法形成對比，Goelet, P.等人的方法優(yōu)選是非均相測定，其中引物或靶分子固定至固相。近來，用于測定DNA中的多態(tài)位點的幾個引物引導(dǎo)的核苷酸摻入程序已得到描述(Komher，J.S.等人，Nucl.Acids.Res.17:7779-7784 (1989) ；Sokolov, B.P.，Nuc1.Acids Res.18:3671 (1990)；Syvanen,A.-C.,等人，Genomics 8:684-692 (1990)；Kuppu swamy, Μ.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 88:1143- 1147 (1991);Prezant,T.R.等人，Hum.Mutat.1:159-164 (1992);Ugozzoli，L.等人，GATA 9:107-112(1992) ；Nyren,P.等人，Anal.Biochem.208:171-175 (1993))。這些方法不同于 GBA ，因為它們都依賴于標(biāo)記的脫氧核苷酸的摻入，以區(qū)分在多態(tài)位點上的堿基。在此類形式中，因為信號與摻入的脫氧核苷酸數(shù)目成比例，所以在相同核苷酸運行中出現(xiàn)的多態(tài)性可以導(dǎo)致與運行長度成比例的信號(Syvanen, A.-C.，等人，Amer.J.Hum.Genet.52:46-59(1993))。許多主觀努力目前在進行中，以平行獲得直接來自數(shù)百萬個別DNA或RNA分子的序列信息。實時單分子邊合成邊測序技術(shù)取決于熒光核苷酸的檢測，因為它們摻入與待測序的模板互補的DNA的新生鏈。在一種方法中，長度30-50個堿基的寡核苷酸在5’末端共價錨定至玻璃蓋玻片。這些錨定的鏈執(zhí)行兩種功能。首先，如果模板配置與表面結(jié)合的寡核苷酸互補的捕獲尾部，那么它們充當(dāng)關(guān)于靶模板鏈的捕獲位點。它們還充當(dāng)用于模板指導(dǎo)的引物延伸的引物，其形成序列閱讀的基礎(chǔ)。捕獲引物充當(dāng)用于序列測定的固定位置位點，使用染料-接頭的合成、檢測和化學(xué)切割的多個循環(huán)，以去除染料。每個循環(huán)由加入聚合酶/標(biāo)記的核苷酸混合物、清洗、成像和染料切割組成。在可替代方法中，聚合酶用熒光供體分子修飾且固定在載玻片上，而每個核苷酸用附著至Y磷酸鹽的受體熒光部分顏色編碼。當(dāng)核苷酸變得摻入從新鏈內(nèi)時，該系統(tǒng)檢測在熒光標(biāo)記的聚合酶和熒光修飾的核苷酸之間的相互作用。還存在其他邊合成邊測序技術(shù)。優(yōu)選地，任何合適的邊合成邊測序平臺可以用于鑒定突變。如上所述，四個主要的邊合成邊測序平臺是目前可獲得的:來自Roche/454 Life Sciences的GenomeSequencers、來自 Illumina/Solexa 的 IG Analyzer、來自 Applied BioSystems 的 SOLiD 系統(tǒng)、和來自Helicos Biosciences的Heliscope系統(tǒng)。邊合成邊測序平臺也已由PacificBioSciences和VisiGen Biotechnologies描述。這些平臺各自可以用于本發(fā)明的方法中。在一些實施方案中，待測序的多個核酸分子與載體(例如固體載體)結(jié)合。為了將核酸固定在載體上，捕獲序列/通用引發(fā)位點可以加入模板的3’末端和/或5’末端上。核酸可以通過使捕獲序列與共價附著至載體的互補序列雜交與載體結(jié)合。捕獲序列(也稱為通用捕獲序列)是與附著至載體的序列互補的核酸序列，其可以雙重充當(dāng)通用引物。作為捕獲序列的可替代物，偶聯(lián)對的成員(如例如美國專利申請?zhí)?006/0252077中所述的例如抗體/抗原、受體/配體、或抗生物素蛋白-生物素對)可以連接至在表面上待捕獲的每個片段，所述表面由那個偶聯(lián)對的各自第二個成員包被。在捕獲后，序列可以例如通過單分子檢測/測序進行分析，例如如實施例和美國專利號7，283，337中所述的，包括模板依賴性邊合成邊測序。在邊合成邊測序中，在聚合酶的存在下使表面結(jié)合的分子暴露于多個標(biāo)記的三磷酸核苷酸。模板的序列通過摻入成長鏈的3’末端內(nèi)的標(biāo)記核苷酸的次序進行測定。這可以實時完成或可以以分步重復(fù)的方式完成。對于實時分析，可以摻入對于每個核苷酸的不同光學(xué)標(biāo)記，并且多個激光器可以用于刺激摻入的核苷酸。任何細胞類型或組織可以用于獲得用于在本文描述的診斷中使用的核酸樣品。在優(yōu)選實施方案中，DNA或RNA樣品得自腫瘤或通過已知技術(shù)(例如靜脈穿刺)獲得的體液例如血液或唾液。可替代地，核酸測試可以對干樣品(例如毛發(fā)或皮膚)執(zhí)行?？商娲?，蛋白質(zhì)質(zhì)譜法可以用于鑒定或驗證與腫瘤細胞上的MHC蛋白質(zhì)結(jié)合的突變肽的存在。肽可以從腫瘤細胞或由腫瘤免疫沉淀的HLA分子中酸洗脫，且隨后使用質(zhì)譜法鑒定。新杭原狀
本發(fā)明進一步包括包含通過本發(fā)明的方法鑒定的腫瘤特異性突變的分離肽，包含已知腫瘤特異性突變的肽，和通過本發(fā)明的方法鑒定的突變型多肽或其片段。這些肽和多肽在本文中稱為“新抗原肽”或“新抗原多肽”。術(shù)語“肽”在本說明書中與“突變型肽”和“新抗原肽”可互換使用，以指定一般通過在相鄰氨基酸的α-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接的一系列殘基，一般為L-氨基酸。類似地，術(shù)語“多肽”在本說明書中與“突變型多肽”和“新抗原多肽”可互換使用，以指定一般通過在相鄰氨基酸的α-氨基和羧基之間的肽鍵彼此連接的一系列殘基，一般為L-氨基酸。多肽或肽可以是多個長度，以其天然(不帶電)形式或以其為鹽的形式，且不含修飾例如糖基化、側(cè)鏈氧化、或磷酸化或含有這些修飾，實施該修飾不破壞如本文描述的多肽的生物學(xué)活性的條件。在特定實施方案中，至少一個新抗原肽分子的大小可以包含但不限于約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24、約25、約26、約27、約28、約29、約30、約31、約32、約33、約34、約35、約36、約37、約38、約39、約40、約41、約42、約43、約44、約45、約46、約47、約48、約49、約50、約60、約70、約80、約90、約100、約110、約120個或更多氨基分子殘基，和其中衍生的任何范圍。在具體實施方案中，新抗原肽分子等于或小于50個氨基酸。在一些實施方案中，本發(fā)明的特定新抗原肽和多肽是:對于MHC I類，長度13個殘基或更少，且通常由約8 -約11個殘基組成，特別是9或10個殘基；對于MHC II類，15-24個殘基。更長的肽可以以幾種方法設(shè)計。在一種情況下，當(dāng)HLA結(jié)合肽是預(yù)測或已知的時，更長的肽可以由下述組成:(I)具有針對每個相應(yīng)基因產(chǎn)物的N和C末端的2-5個氨基酸的延長的個別結(jié)合肽；(2)對于各自具有延長序列的一些或所有結(jié)合肽的串聯(lián)(concatenatation)。在另一種情況下，當(dāng)測序揭示腫瘤中存在的長(>10個殘基)新表位序列(例如由于導(dǎo)致新肽序列的移碼、連讀或內(nèi)含子包含)時，更長的肽將由下述組成:(3)新腫瘤特異性氨基酸的整個段-從而回避關(guān)于與HLA蛋白質(zhì)結(jié)合的肽的計算預(yù)測或體外測試的需要。在兩種情況下，更長肽的使用允許通過患者細胞的內(nèi)源加工，且可以導(dǎo)致更有效的抗原呈遞和T細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)。新抗原肽和多肽結(jié)合HLA蛋白質(zhì)。在一些方面，新抗原肽和多肽以大于野生型肽的親和力結(jié)合HLA蛋白質(zhì)。新抗原肽或多肽具有至少小于5000 nM、至少小于500 nM、至少小于250 nM、至少小于200 nM、至少小于150 nM、至少小于100 nM、至少小于50 nM或更少的 IC50。當(dāng)施用于受試者時，新抗原肽和多肽不誘導(dǎo)自身免疫應(yīng)答和/或引起免疫耐受。本發(fā)明還提供了包含至少兩種或更多種新抗原肽的組合物。在一些實施方案中，組合物含有至少兩種不同的肽。優(yōu)選地，至少兩種不同的肽衍生自相同多肽。不同多肽意指該肽通過長度、氨基酸序列或兩者改變。肽衍生自已知含有腫瘤特異性突變或已通過本發(fā)明的方法發(fā)現(xiàn)含有腫瘤特異性突變的任何多肽。新抗原肽可以由其衍生的合適多肽可以例如在COSMIC數(shù)據(jù)庫(http://www.sanger.ac.uk/cosmic)關(guān)于人癌癥中的體細胞突變的COSMIC curates綜合信息發(fā)現(xiàn)。肽含有腫瘤特異性突變。在一些方面，腫瘤特異性突變是關(guān)于特定癌癥類型的驅(qū)動突變。在一些方面，肽衍生自SF3B1多肽、MYD88多肽，TP53多肽、ATM多肽、Abl多肽、FBXW7多肽、DDX3X多肽、GNBl多肽的MAPKl多肽。SF3B1肽意指該肽含有SF3B1多肽的部分。優(yōu)選地，SF3B1肽包括在氨基酸位置625處的亮氨酸；在氨基酸位置626處的組氨酸；在氨基酸位置700處的谷氨酸；在氨基酸位置742處的天冬氨酸；或在氨基酸位置903處的精氨酸，當(dāng)依照野生型SF3B1編號時。野生型SF3B1顯示于表A (SEQ ID NO:1)。
權(quán)利要求
1.一種鑒定新抗原的方法，其包括: a.鑒定具有癌癥的受試者的表達基因中的腫瘤特異性突變； b.其中當(dāng)步驟(a)中鑒定的所述突變是點突變時: 1.鑒定具有步驟(a)中鑒定的所述突變的突變型肽， 其中所述突變型肽以大于野生型肽的親和力結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)；并且具有小于500nm 的 IC50 ； c.其中當(dāng)步驟(a)中鑒定的所述突變是剪接位點、移碼、連讀或基因融合突變時: 1.鑒定由步驟(a)中鑒定的所述突變編碼的突變型多肽，其中所述突變型多肽結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述突變型肽長度為約8-10個氨基酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述突變型肽長度大于10個氨基酸。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述突變型肽長度大于15個氨基酸。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述突變型肽長度大于20個氨基酸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述突變型肽長度大于30個氨基酸。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述突變型肽長度為約8- 50個氨基酸。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述突變型肽長度為約24-40個氨基酸。
9.權(quán)利要求1的方法,其中腫瘤特異性突變通過核酸測序進行鑒定。
10.權(quán)利要求1的方法，其進一步包括選擇步驟(b)中鑒定的肽或步驟(c)的多肽，其激活抗腫瘤⑶8 T細胞。
11.一種在受試者中誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的方法，其包括施用根據(jù)權(quán)利要求1鑒定的一種或多種肽或多肽和佐劑。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述佐劑是基于TLR的佐劑。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述肽或多肽由基于礦物油的佐劑乳化。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述肽或多肽和基于TLR的佐劑由基于礦物油的佐劑乳化。
15.權(quán)利要求11的方法，其進一步包括施用抗免疫抑制劑。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述抗免疫抑制劑是抗CTLA-4抗體、抗PDl抗體、抗PD-Ll抗體、抗⑶25抗體或IDO的抑制劑。
17.一種在受試者中誘導(dǎo)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的方法，其包括給所述受試者施用自體樹突細胞或抗原呈遞細胞，其已用根據(jù)權(quán)利要求1鑒定的一種或多種肽或多肽脈沖。
18.權(quán)利要求17的方法，其進一步包括施用佐劑。
19.權(quán)利要求18的方法，其`中所述佐劑是基于TLR的佐劑。
20.權(quán)利要求17的方法，其進一步包括施用抗免疫抑制劑。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述抗免疫抑制劑是抗CTLA-4抗體、抗PDl抗體、抗PD-Ll抗體、抗⑶25抗體或IDO的抑制劑。
22.—種就癌癥免疫接種或治療受試者的方法,其包括: a.鑒定所述受試者的表達基因中的多個腫瘤特異性突變，其中當(dāng)鑒定的所述突變是:` 1.點突變時，進一步鑒定具有所述點突變的突變型肽；和/或i 1.剪接位點、移碼、連讀或基因融合突變時，進一步鑒定由所述突變編碼的突變型多肽； b.選擇步驟(a)中鑒定的一種或多種突變型肽或多肽，其結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)； c.選擇步驟(b)中鑒定的一種或多種突變型肽或多肽，其能夠激活抗腫瘤CD8T細胞；和 d.給所述受試者施用所述一種或多種肽或多肽、用步驟(C)中選擇的一種或多種肽或多肽脈沖的自體樹突細胞或抗原呈遞細胞。
23.權(quán)利要求22的方法，其進一步包括給所述受試者施用佐劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述佐劑是基于TLR的佐劑。
25.權(quán)利要求22的方法，其進一步包括施用抗免疫抑制劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述抗免疫抑制劑是抗CTLA-4抗體、抗PDl抗體、抗PD-Ll抗體、抗⑶25抗體或IDO的抑制劑。
27.權(quán)利要求22的方法，其中所述突變型肽長度為約8-10個氨基酸。
28.權(quán)利要求22的方法，其中所述突變型肽長度為約8- 50個氨基酸。
29.權(quán)利要求22的方法，其中所述突變型肽長度為約24-40個氨基酸。
30.權(quán)利要求22的方法，其中所述受試者已接受造血干細胞移植。
31.權(quán)利要求22的方法，其中所述受試者是人、犬、貓或馬。
32.權(quán)利要求22的方法，其中所述癌癥是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、腎癌、胃癌、結(jié)腸癌、睪丸癌、頭與頸癌、胰腺癌、腦癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述淋巴瘤是B細胞淋巴瘤。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述白血病是急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴細胞白血病或T細胞淋巴細胞白血病。
35.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1鑒定的肽和藥學(xué)可接受的載體。
36.一種組合物，其包含至少兩種不同的: a.SF3B1肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有 i.在氨基酸位置625處的亮氨酸； i1.在氨基酸位置626處的組氨酸； ii1.在氨基酸位置700處的谷氨酸； iv.在氨基酸位置742處的天冬氨酸；或 V.在氨基酸位置903處的精氨酸，當(dāng)依照野生型SF3B1編號時； b.MYD88肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有 i.在氨基酸位置232處的蘇氨酸； i1.在氨基酸位置258處的亮氨酸；或 ii1.在氨基酸位置265處的脯氨酸，當(dāng)依照野生型MYD88編號時； c.TP53肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有 i.在氨基酸位置111處的精氨酸； i1.在氨基酸位置215處的精氨酸； ii1.在氨基酸位置238處的絲氨酸； iv.在氨基酸位置248處的谷氨酰胺；V.在氨基酸位置255處的苯丙氨酸； v1.在氨基酸位置273處的半胱氨酸或 vi1.在氨基酸位置281處的天冬酰胺，當(dāng)依照野生型TP53編號時；d.ATM肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有.1.在氨基酸位置1252處的苯丙氨酸； i1.在氨基酸位置2038處的精氨酸； ii1.在氨基酸位置2522處的組氨酸；或 iv.在氨基酸位置2954處的半胱氨酸，當(dāng)依照野生型ATM編號時；e.abl肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有· . 1.在氨基酸位置244處的纈氨酸； i1.在氨基酸位置248處的纈氨酸； ii1.在氨基酸位置250處的谷氨酸； iv.在氨基酸位置250處的丙氨酸； V.在氨基酸位置252處的組氨酸； v1.在氨基酸位置252處的精氨酸； vi1.在氨基酸位置253處的苯丙氨酸； vii1.在氨基酸位置253處的組氨酸； ix.在氨基酸位置255處的賴氨酸； X.在氨基酸位置255處的纈氨酸； x1.在氨基酸位置276處的甘氨酸； xi1.在氨基酸位置315處的異亮氨酸； xii1.在氨基酸位置315處的天冬酰胺； xiv.在氨基酸位置317處的亮氨酸； XV.在氨基酸位置343處的蘇氨酸； xv1.在氨基酸位置351處的蘇氨酸； xvi1.在氨基酸位置355處的甘氨酸； xvi i1.在氨基酸位置359處的纈氨酸； xix.在氨基酸位置359處的丙氨酸； XX.在氨基酸位置379處的異亮氨酸； xx1.在氨基酸位置382處的亮氨酸； xxi1.在氨基酸位置387處的甲硫氨酸； xxii1.在氨基酸位置396處的脯氨酸； xxiv.在氨基酸位置396處的精氨酸； XXV.在氨基酸位置417處的酪氨酸；或 xxv1.在氨基酸位置486處的絲氨酸，當(dāng)依照野生型abl編號時；f.FBXW7肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有 .1.在氨基酸位置280處的亮氨酸； i1.在氨基酸位置465處的組氨酸； ii1.在氨基酸位置505處的半胱氨酸；或iv.在氨基酸位置597處的谷氨酸，當(dāng)依照野生型FBXW7編號時； g.MAPKl肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有i.在氨基酸位置162處的天冬酰胺； i1.在氨基酸位置291處的甘氨酸；或 ii1.在氨基酸位置316處的苯丙氨酸，當(dāng)依照野生型MAPKl編號時；或 h.GNBl肽，其中每種肽長度等于或小于50個氨基酸且含有在氨基酸位置180處的蘇氨酸，當(dāng)依照野生型GNBl編號時。
37.權(quán)利要求36的組合物，其進一步包含佐劑。
38.一種治療具有伊馬替尼抗性腫瘤的受試者的方法，其包括給HLA-A3陽性受試者施用長度等于或小于50個氨基酸的Bcr-abl肽的組合物，所述Bcr-abl肽含有在氨基酸位置255處的賴氨酸，當(dāng)依 照野生型bcr-abl編號時。
39.一種治療具有伊馬替尼抗性腫瘤的受試者的方法，其包括給所述受試者施用含有bcr-abl突變的一種或多種肽，其中所述肽等于或小于50個氨基酸，且以小于500 nm的IC50結(jié)合I類HLA蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫治療肽及其在免疫療法特別是癌癥的免疫療法中的用途。具體地，本發(fā)明提供了鑒定腫瘤特異性新抗原的方法，其單獨或與其他腫瘤相關(guān)肽組合充當(dāng)疫苗組合物的藥物成分，所述疫苗組合物刺激抗腫瘤應(yīng)答。
文檔編號G01N33/53GK103180730SQ201180034398
公開日2013年6月26日 申請日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月14日
發(fā)明者N.哈科亨, C.吳 申請人:綜合醫(yī)院公司, 達納－法伯癌癥研究所公司