本發(fā)明涉及植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種象草維管組織特異性啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：?jiǎn)?dòng)子是指能與RNA聚合酶作用并能起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，被稱為調(diào)控基因表達(dá)的樞紐，它能夠控制基因的表達(dá)水平、表達(dá)部位及表達(dá)方式。為了克服組成性啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(CaMV35spromoter)、激動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Actinpromoter)和玉米泛素啟動(dòng)子(Ubiquitinpromoter)，在植物體內(nèi)持續(xù)、高效表達(dá)時(shí)，對(duì)植物造成生長(zhǎng)發(fā)育造成的不利影響。組織特異性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用越來(lái)越受到科研工作者的重視，通過(guò)組織特異性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，不僅能控制基因的精確表達(dá)，而且還能避免過(guò)量表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的負(fù)面影響。組織特異性啟動(dòng)子是在植物的綠色組織(葉片)、分生組織(莖尖、根尖、幼芽)、維管組織(韌皮部、木質(zhì)部及塊莖)、薄壁組織、花粉、種子、果實(shí)和胚乳等組織中特異表達(dá)的啟動(dòng)子。它能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在特定時(shí)間、特定部位表達(dá)積累，增加區(qū)域表達(dá)量，往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。其中維管組織特異性啟動(dòng)子主要分為韌皮部特異性啟動(dòng)子和木質(zhì)部特異性啟動(dòng)子。韌皮部在植物體內(nèi)，是負(fù)責(zé)運(yùn)輸有機(jī)物質(zhì)的主要部位，富含糖等，因此成為細(xì)菌、真菌、病毒等植物病源和刺吸式昆蟲的侵害目標(biāo)。韌皮部特異啟動(dòng)子可以為抗病蟲作物的生物技術(shù)育種提供啟動(dòng)元件。木質(zhì)部是運(yùn)輸水分、無(wú)機(jī)離子的主要部位，起到支撐植物的作用。木質(zhì)部特異啟動(dòng)子在深入了解木材形成過(guò)程中的分子機(jī)制和材性改良的基因工程育種中有重要意義。象草是熱帶亞熱帶地區(qū)的優(yōu)良飼草，適口性好，利用率高。而且還能代替煤炭石油發(fā)電，種植1公頃的象草燃料產(chǎn)生的能量可替代36桶石油。但是象草中，木質(zhì)素含量過(guò)高，影響反芻動(dòng)物，如牛的消化速率，從而不利于牲畜增重。木質(zhì)素同時(shí)也是制漿造紙工業(yè)的限制因素，因?yàn)橐獙⒛举|(zhì)素去除之后，才能獲得純的纖維素和半纖維素進(jìn)行造紙。因此，木質(zhì)素的調(diào)控是牧草或能源草培育的方向之一。通過(guò)維管組織特異性啟動(dòng)子特異啟動(dòng)外源基因控制在維管中的表達(dá)具有重要的理論和實(shí)踐意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種象草維管組織特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可應(yīng)用于植物特定組織表達(dá)，從而為植物的轉(zhuǎn)基因育種提供有效的手段和工具。本發(fā)明的另一目的在于提供所述的啟動(dòng)子的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種象草維管組織特異性啟動(dòng)子，選自如下任一序列：(a)含有如SEQIDNO.1～9任一所示的核苷酸序列，或具有與SEQIDNO.1～9任一所示序列互補(bǔ)的核苷酸序列；(b)凡是經(jīng)過(guò)人工修飾的，與SEQIDNO.1～9任一所示的核苷酸序列具有至少75％同源性的核苷酸序列。所述的啟動(dòng)子從象草中克隆獲得，或通過(guò)人工合成方法獲得。所述的維管組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子在植物維管組織特異性表達(dá)調(diào)控基因中的應(yīng)用。所述的植物優(yōu)選為煙草。所述的應(yīng)用包括用所述的象草維管組織特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物、并通過(guò)損傷和激素處理來(lái)鑒定該象草維管組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)制，為該啟動(dòng)子的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。一種表達(dá)載體，含有上述象草維管組織特異性啟動(dòng)子。所述的表達(dá)載體，是將上述象草維管組織特異性啟動(dòng)子替換雙元表達(dá)載體pCAMBIA1305.1的CaMV35S啟動(dòng)子獲得。一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，是將上述象草維管組織特異性啟動(dòng)子或上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞獲得。所述的宿主細(xì)胞為根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞。所述的根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞優(yōu)選為EHA105細(xì)胞。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：1、本發(fā)明提供一種從象草中克隆獲得的維管組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可應(yīng)用于植物特定組織表達(dá)，并可以應(yīng)用于調(diào)控植物基因表達(dá)中，從而為植物的轉(zhuǎn)基因育種提供有效的手段和工具。該啟動(dòng)子主要能驅(qū)動(dòng)基因在植株的成熟時(shí)期表達(dá)。其中，具有296bp啟動(dòng)子的片段的染色部位主要是初生木質(zhì)部；隨著片段長(zhǎng)度的增加，染色部位向兩端延展；由內(nèi)向外，染色部位逐漸覆蓋至維管形成層及韌皮部，自外向內(nèi)染色效果蔓延至髓細(xì)胞中；具有1154bp啟動(dòng)子片段的GUS染色最深，且覆蓋面積最廣。2、本發(fā)明用構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草、并通過(guò)損傷和激素處理來(lái)鑒定該維管組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)控機(jī)制，為該啟動(dòng)子的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1為第一次hi-TAILPCR的第1輪TAILPCR和第2輪TAILPCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果圖；其中，M表示DNAmarkerDL2000，1st表示引物Hi-CADR1-1與AC1的第1輪TAILPCR擴(kuò)增條帶，2ed表示引物Hi-CADR1-2與AC1的第2輪TAILPCR擴(kuò)增條帶。圖2為第二次hi-TAILPCR的第1輪TAILPCR和第2輪TAILPCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果圖；其中，M表示DNAmarkerDL2000，1st表示引物Hi-CADR2-1與AC1的第1輪TAILPCR擴(kuò)增條帶，2ed表示引物Hi-CADR2-2與AC1的第2輪TAILPCR擴(kuò)增條帶。圖3為啟動(dòng)子缺失片段的克隆檢測(cè)結(jié)果圖；其中，M表示DNAmarkerDL5000；泳道1～9分別對(duì)應(yīng)181～2054bp的啟動(dòng)子片段。圖4為CADP-181啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有181bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖5為CADP-296啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有296bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖6為CADP-645啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有645bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖7為CADP-758啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有758bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖8為CADP-936啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有936bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖9為CADP-1154啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有1154bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖10為CADP-1340啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有1340bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖11為CADP-1565啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有1565bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖12為CADP-2054啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的GUS染色及PCR鑒定結(jié)果圖；其中，CK+是含有2054bp啟動(dòng)子片段的陽(yáng)性質(zhì)粒。圖13為啟動(dòng)子不同缺失片段轉(zhuǎn)化煙草的GUS酶活性測(cè)定結(jié)果圖；其中，WT表示野生型；CADP-181～CADP-2054表示缺失片段表達(dá)載體。圖14為轉(zhuǎn)基因煙草組培苗莖的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果圖；其中，WT表示野生型；a～i分別代表轉(zhuǎn)化自缺失片段載體CADP-181、CADP-296、CADP-645、CADP-758、CADP-936、CADP-1154、CADP-1340、CADP-1565和CADP-2054的煙草莖；Ph表示韌皮部；Ca表示形成層；SX表示次生木質(zhì)部；PX表示初生木質(zhì)部；Pi表示髓；標(biāo)尺為200μm。圖15為啟動(dòng)子對(duì)損失及激素的響應(yīng)效果圖；其中，WT表示野生型；CK表示空白對(duì)照(無(wú)處理)；虛線框中的葉片在理論上有響應(yīng)；“*”為與對(duì)照相比有明顯響應(yīng)的葉片。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例11材料1.1植物材料：象草取自華南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系引種園。2方法2.1維管組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的獲得按照植物基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取象草基因組DNA，采用hi-TAILPCR的方法，對(duì)PpCAD(華南象草肉桂醇脫氫酶)基因ATG上游2054bp啟動(dòng)子序列(命名為PpCADPRO的啟動(dòng)子區(qū)域)進(jìn)行克隆，用4條上游簡(jiǎn)并引物L(fēng)AD(1/2/3/4)，1條上游通用引物AC1和3條靠PpCAD基因5’端的下游同向特異性引物Hi-CADR1-0、Hi-CADR1-1和Hi-CADR1-2進(jìn)行三輪巢式PCR擴(kuò)增。根據(jù)第1次hi-TAILPCR得到的序列，再次設(shè)計(jì)3條靠近5’端的特異性下游引物Hi-CADR2-0、Hi-CADR2-1和Hi-CADR2-2以相同方法進(jìn)行3輪擴(kuò)增。PCR的引物序列如表1所示，PCR反應(yīng)程序如表2所示，第1次hi-TAILPCR的過(guò)程如表3所示，第2次hi-TAILPCR的過(guò)程基本同表3，區(qū)別僅在于所使用的引物為Hi-CADR2-0、Hi-CADR2-1和Hi-CADR2-2。PCR反應(yīng)結(jié)束之后，經(jīng)過(guò)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)每一輪PCR產(chǎn)物，將第1次hi-TAILPCR和第2次hi-TAILPCR中得到最長(zhǎng)的產(chǎn)物(即第1次hi-TAILPCR中用LAD4得到的產(chǎn)物(約900bp)和第2次hi-TAILPCR中用LAD2得到的產(chǎn)物(約1400bp))回收，連接至載體19-Tvector(寶生物工程大連有限公司)上T-克隆后送測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，共得到2300bp啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)上游引物F1和下游引物R1再次擴(kuò)增啟動(dòng)子序列，回收產(chǎn)物連接至載體19-Tvector(寶生物工程大連有限公司)上，得到T-PpCADPRO質(zhì)粒，并送公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序后，除去5’端部分峰值不穩(wěn)定的區(qū)域，最終得到2054bp的啟動(dòng)子片段。表1hi-TAILPCR中的引物引物名稱引物序列(5’-3’)LAD1ACGATGGACTCCAGAGVNVNNNGGAALAD2ACGATGGACTCCAGAGBNBNNNGGTTLAD3ACGATGGACTCCAGAGVVNVNNNCCACLAD4ACGATGGACTCCAGAGBDNBNNNCCAAHi-CADR1-0AAAAATGACTGCGCGAGGGAATGCHi-CADR1-1ACGATGGACTCCAGTCCGATCGAGCAGGAAGGGGAAGGACGHi-CADR1-2GGTGTAGGTGTAGGGGGAGAGGTGGHi-CADR2-0AGCTGGGATTTGATAGGCACTTTGCHi-CADR2-1ACGATGGACTCCAGTCGGGTGGGGGGGCTGTTACCATCCTGHi-CADR2-2GGTTGACAGCTGGTTGAGCAAGCCCAC1ACGATGGACTCCAGAGF1GGTCGTGTCGTATTTTCTTR1CCTTCGGTGTGAGACCGGCC注：V＝A/C/G，N＝A/C/G/T，B＝C/G/T，D＝A/G/T表2hi-TAILPCR反應(yīng)程序表3hi-TAILPCR反應(yīng)體系2.2啟動(dòng)子基因序列分析利用DNAman對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行整理，采用在線分析軟件NeuralNetworkPromoterPrediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)分析轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，經(jīng)同源性比較后，在PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)和PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)中分析順式作用元件。2.3啟動(dòng)子缺失片段載體構(gòu)建根據(jù)順式作用元件分析結(jié)果，對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行分段。通過(guò)設(shè)計(jì)含有XbaI和BglII兩個(gè)酶切位點(diǎn)將分段的啟動(dòng)子片段替換pCAMBIA1305.1(北京天恩澤基因科技有限公司，細(xì)菌篩選標(biāo)記為Kan，植物篩選標(biāo)記為抗Hpt基因)的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建了PpCADPRO啟動(dòng)子的缺失表達(dá)載體。其中，PpPro-Bg-R為帶有BglII酶切位點(diǎn)且緊接起始密碼子ATG的下游引物，PpPro-Xba-F1～PpPro-Xba-F9為帶有XbaI酶切位點(diǎn)的上游引物。以T-PpCADPRO質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR，得到的產(chǎn)物經(jīng)XbaI和BglII雙酶切后，再與經(jīng)XbaI和BglII雙酶切后的pCAMBIA1305.1通過(guò)T4DNA連接酶連接，連接液涂布于含50μg/ml的卡那霉素LB平板上，長(zhǎng)出的克隆再通過(guò)表4中的引物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，最后提取質(zhì)粒通過(guò)XbaI和BglII雙酶切鑒定，得到分別含有9個(gè)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子片段的重組載體。表4啟動(dòng)子缺失片段載體構(gòu)建中的引物引物名稱引物序列(5’-3’)PpPro-Bg-RGAAGATCTCCTTCGGTGTGAGACCGGCCPpPro-Xba-F1GCTCTAGAGCGCTCCTCCCCACTCTCCTPpPro-Xba-F2GCTCTAGAGATCCTCTGCAGTCGACTGCPpPro-Xba-F3GCTCTAGACCAGTGGTGCATGTTATCAGPpPro-Xba-F4GCTCTAGATGGCTCCGCCGCTACAGCTPpPro-Xba-F5GCTCTAGACTGGGCTTGCTCAACCAGCTPpPro-Xba-F6GCTCTAGATCCAGCAAGTACAAACCTAAPpPro-Xba-F7GCTCTAGATGAACGATTGGAGGCCATGCPpPro-Xba-F8GCTCTAGATGTGGCTATTGGAAATTTGAPpPro-Xba-F9GCTCTAGAAGCTAGTATTACGTGGGGTC2.4煙草的遺傳轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的9個(gè)重組載體分別采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，以K326煙草作為植物材料，采用葉盤法，將表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)入煙草中。2.5轉(zhuǎn)基因煙草鑒定待煙草生長(zhǎng)，并生長(zhǎng)成為成熟植株時(shí)，通過(guò)PCR鑒定和GUS組織化學(xué)染色的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行鑒定。PCR鑒定所用引物為表4中的引物。2.6轉(zhuǎn)基因煙草的GUS組織化學(xué)染色為探究不同啟動(dòng)子片段的表達(dá)特異性及表達(dá)差異，對(duì)9個(gè)PpCADPRO基因啟動(dòng)子缺失片段的煙草組培苗經(jīng)行了GUS組織化學(xué)染色。2.7轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)損失及激素的響應(yīng)在轉(zhuǎn)基因煙草移栽1個(gè)月后，挑選含有不同缺失片段但長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行生物與非生物處理的響應(yīng)實(shí)驗(yàn)。設(shè)置1/10(MS液體培養(yǎng)基稀釋10倍)MS液體培養(yǎng)基即空白處理、鑷子刺傷葉盤、100μmol/LGA(赤霉素)、100μmol/LMeJA(茉莉酸甲酯)、100μmol/LABA(脫落酸)共5個(gè)處理，采用24孔培養(yǎng)板，在不同培養(yǎng)孔中對(duì)煙草進(jìn)行培養(yǎng)24h，每個(gè)處理孔中的液體培養(yǎng)基為3mL。處理后的葉片立即進(jìn)行GUS染色處理，觀察不同缺失片段啟動(dòng)子對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)。3結(jié)果與分析3.1PpCADPRO啟動(dòng)子的克隆以象草基因組為模板，經(jīng)過(guò)兩次hi-TAILPCR，最終得到PpCAD基因ATG上游2054bp啟動(dòng)子序列(如SEQIDNO.1所示)，命名為PpCADPRO。采用在線分析軟件線NeuralNetworkPromoterPrediction預(yù)測(cè)該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為A，位于ATG上游156bp處。包含17個(gè)TATA-box和12個(gè)CAAT-box。此外，還有AC-Ielement、CAT-box、CGTCA-motif、GARE-motif、ABRE、CCAATBOX1、ARE、W-box等多個(gè)順式作用元件。3.2啟動(dòng)子缺失片段載體構(gòu)建根據(jù)啟動(dòng)子分析結(jié)果，對(duì)PpCADPRO進(jìn)行分段，根據(jù)表4中的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，可獲得大小分別為181bp(如SEQIDNO.2所示)、296bp(如SEQIDNO.3所示)、645bp(如SEQIDNO.4所示)、758bp(如SEQIDNO.5所示)、936bp(如SEQIDNO.6所示)、1154bp(如SEQIDNO.7所示)、1340bp(如SEQIDNO.8所示)、1565bp(如SEQIDNO.9所示)和2054bp的9個(gè)片段(圖3)。片段兩端帶有BglII和Xba兩個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行雙酶切，將9個(gè)啟動(dòng)子片段分別替換pCAMBIA1305.1的CaMV35S啟動(dòng)子，以驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)，這九個(gè)重組載體分別命名為CAD-181、CAD-296、CAD-645、CAD-758、CAD-936、CAD-1154、CAD-1340、CAD-1565、CAD-2054。3.3煙草的遺傳轉(zhuǎn)化與鑒定通過(guò)凍融法將構(gòu)建好的9個(gè)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)EHA105，并活化陽(yáng)性菌落作為種質(zhì)液，擴(kuò)繁后侵染煙草葉盤。待轉(zhuǎn)基因苗移栽后，分別取每個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的葉片進(jìn)行GUS預(yù)染色。鑒定結(jié)果顯示(圖4～12)，CADP-936(缺失片段表達(dá)載體)的全部22株轉(zhuǎn)基因植株葉片均能被GUS染色，但CADP-2054有7株植株葉片不能被染色，約占植株總數(shù)的30％。此外，CADP-181、CADP-758和CADP-1154分別有5株、4株和3株不能被染色，約占植株總數(shù)的23％、21％和8％。CAD-296、CADP-645、CADP-1340和CADP-1565都有2株不能被染色，分別占植株總數(shù)的11％、15％、8％和9％。挑選生長(zhǎng)一致，GUS預(yù)染色結(jié)果為陽(yáng)性的煙草植株，進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明，在所挑選的GUS預(yù)染色為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株中，都能擴(kuò)增出與對(duì)照大小一致的片段)，證明9個(gè)PpCADPRO啟動(dòng)子缺失片段載體成功轉(zhuǎn)化到煙草中。選擇不同3個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期的9個(gè)PpCADPRO缺失片段轉(zhuǎn)化煙草后基部莖(第3節(jié)以下)進(jìn)行GUS酶活性的檢測(cè)，評(píng)價(jià)不同缺失片段啟動(dòng)效率。在生長(zhǎng)時(shí)期為3個(gè)月時(shí)，轉(zhuǎn)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子的煙草GUS酶活性都達(dá)到最高，當(dāng)PpCADPRO啟動(dòng)子的長(zhǎng)度為1154bp時(shí)，啟動(dòng)效率最高(圖13)。說(shuō)明PpCADPRO啟動(dòng)子在植物發(fā)育的前期啟動(dòng)效率不高，它主要能驅(qū)動(dòng)基因在植株的成熟時(shí)期表達(dá)。3.4轉(zhuǎn)基因煙草的GUS染色差異分析煙草組培苗的莖在經(jīng)過(guò)GUS染色后也表現(xiàn)出不同的著色差異，且這些差異還體現(xiàn)在橫切面的著色部位上(圖14)。對(duì)照(野生型)沒(méi)有著色，具有181bp啟動(dòng)子片段的莖著色效果也不明顯，只能在初生木質(zhì)部附近檢測(cè)到輕微的GUS活性；除了181bp以外，所有片段的木質(zhì)部都能被GUS染色，但隨著片段長(zhǎng)度的改變，著色的位置和強(qiáng)度也發(fā)生著變化。具有296bp啟動(dòng)子的片段的染色部位主要是初生木質(zhì)部；隨著片段長(zhǎng)度的增加，染色部位向兩端延展。由內(nèi)向外，染色部位逐漸覆蓋至維管形成層及韌皮部；自外向內(nèi)染色效果蔓延至髓細(xì)胞中；具有1154bp啟動(dòng)子片段的GUS染色最深，且覆蓋面積最廣。3.5啟動(dòng)子不同缺失片段對(duì)損傷及激素的響應(yīng)對(duì)葉片處理的5個(gè)外界因素分別為機(jī)械損傷、100μmol/LGA、100μmol/LMeJA和100μmol/LABA。含有長(zhǎng)度為645bp以上的啟動(dòng)子缺失片段在損傷處理后表現(xiàn)出較高的GUS活性；含有長(zhǎng)度為758bp以上的啟動(dòng)子缺失片段在GA理后表現(xiàn)出較高的GUS活性；含有長(zhǎng)度為1340bp以上的啟動(dòng)子缺失片段在MeJA處理后表現(xiàn)出較高的GUS活性；只有全長(zhǎng)啟動(dòng)子表現(xiàn)出對(duì)ABA的相應(yīng)(圖15)。說(shuō)明PpCADPRO啟動(dòng)子序列中的確含有對(duì)外界響應(yīng)的順式作用元件，響應(yīng)不同外界因素的啟動(dòng)子片段和預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。而且，啟動(dòng)子對(duì)外界的響應(yīng)可能是元件本身與其它增強(qiáng)或抑制表達(dá)元件共同作用的結(jié)果。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3