特異性結(jié)合壞死細(xì)胞的突破性平臺技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包括結(jié)合壞死細(xì)胞的靶向分子的系統(tǒng)；該系統(tǒng)作為藥物的用途；該系統(tǒng)在診斷上的應(yīng)用；在治療涉及壞死性細(xì)胞死亡的疾病中應(yīng)用的系統(tǒng)，包含該系統(tǒng)的劑量；使用所述系統(tǒng)確定樣品內(nèi)所述組合物的定位的方法；和，使用所述系統(tǒng)用于治療涉及壞死性細(xì)胞死亡的癌癥和/或疾病的方法。特別是，本發(fā)明涉及靶向壞死細(xì)胞的組合物。
【專利說明】
特異性結(jié)合壞死細(xì)胞的突破性平臺技術(shù)
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種包含用于結(jié)合壞死細(xì)胞的祀向分子的系統(tǒng);該系統(tǒng)作為藥物的用 途;該系統(tǒng)在診斷上的應(yīng)用;在治療設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的疾病中應(yīng)用的該系統(tǒng)，包含該系 統(tǒng)的劑量;使用所述系統(tǒng)確定樣品內(nèi)所述組合物的定位的方法;和，使用所述系統(tǒng)用于治療 設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的癌癥和/或疾病的方法。特別是，本發(fā)明設(shè)及祀向壞死細(xì)胞的組合 物。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)中設(shè)及祀向壞死細(xì)胞的系統(tǒng)和方法不是最佳的和/或適用的：
[0004] a.壞死性對比調(diào)亡性細(xì)胞死亡
[0005] 壞死的祀向是特異的和獨特的，因為壞死只出現(xiàn)在細(xì)胞死亡的病理情況下，所述 病理情況歸因于不充足的血液供應(yīng)并因此氧氣缺乏、創(chuàng)傷或者歸因于直接的細(xì)胞毒性劑或 其它如放射性治療或光動力療法的癌癥治療。調(diào)亡性細(xì)胞死亡與之相反，其在組織更新過 程中連續(xù)發(fā)生。因此相比于壞死性細(xì)胞死亡，調(diào)亡性細(xì)胞死亡是不適用于祀向特征為壞死 的疾病，所述壞死是例如在腫瘤(快速生長的腫瘤自發(fā)性進展壞死核）、創(chuàng)傷、梗塞、骨關(guān)節(jié) 炎、糖尿病、動脈粥樣硬化斑塊、燒傷、某些細(xì)菌感染等的情況下發(fā)現(xiàn)的。
[0006] b.抗體對比小分子
[0007]我們的化合物是小分子、青色素基染料(cyanine based dyes)，其深深的滲入到 壞死組織中?？贵w已經(jīng)被用于祀向壞死(腫瘤壞死祀向），但是具有抗體太大而不能滲入到 壞死組織中的缺點。
[000引C.其它化學(xué)試劑對比青色素染料
[0009] 還有其它化學(xué)試劑(例如PDT-試劑），其已知用于標(biāo)記壞死細(xì)胞(例如金絲桃素，細(xì) 菌葉綠素衍生物，Gadop虹in-2A和bis-DTPA-NI)。運些試劑具有特殊的性質(zhì)，運使得它們不 太適用于上述疾病的成像和治療，運些試劑是（1.)難W化學(xué)制備，運些試劑是（2.)光敏性 的（在暴露在光的情況下，該化合物將產(chǎn)生氧自由基并改變它們的性質(zhì)），（3.)從體內(nèi)清除 需要更長的時間（長達數(shù)天)和(4.)運類化合物相對比較大，運使得它們更難W滲入到壞死 組織中。青色素染料是易于化學(xué)制造的，是光穩(wěn)定性的，是快速從體內(nèi)清除的（3至24小時） W及深深地和容易地滲入到壞死組織中。
[0010] 在【背景技術(shù)】中更多的細(xì)節(jié)可W從W前提交的申請PCT/化2013/050067和PCT/ 化2013/050064中獲得。
[0011] 下列文件可W被考慮：
[0012] Ma化uri Dasari等人，Organic Letters，2010，12(15)，3300-3303,敘述了通過結(jié) 合胞外DNA而在體內(nèi)檢測壞死組織的成像劑。
[0013] 本發(fā)明不設(shè)及DNA的結(jié)合。DNA結(jié)合分子通常被認(rèn)為是不適合用于人類，因為運種 分子是致突變/致癌高幾率的。
[0014] Bryan A Smith#A>URL：http://etd.nd.edu/ETD-db/theses/available/etd-04132012-14111 l/unrestricted/SmithBry 曰 n042012D p壯，敘述了 在體內(nèi)細(xì)胞死亡的成 像，使用巧光合成配位復(fù)合物。在一個方面，該文件敘述了與青色素染料偶聯(lián)的一些調(diào)亡性 革己向分子。
[0015]在運些復(fù)合物中的青色素被僅用作巧光報告劑(fluorescent reporter)。
[0016] Epstein A L等人，Cancer Research, 1988,48(20) ,5842-5848設(shè)及一種用于檢測 在人類癌癥中壞死病灶的方法。其依賴于使用與作為報告劑的染料偶聯(lián)的作為祀向部分的 抗體。
[0017] 就不利影響的方面而言，抗體的生產(chǎn)、儲存和使用是非常困難，昂貴和高風(fēng)險的。 [001 引 Vera D等人，核醫(yī)學(xué)和生物學(xué)（Nuclear Medicine and Biology) ,2005年，32， 687-693,設(shè)及一種用于在體內(nèi)測量受體生物化學(xué)的巧光探針。
[0019] 化giris E E等人，癌癥研究和治療技術(shù)（Technology in Cancer Research and Treatment) ,2006,5(4) ,301-309,設(shè)及一種用于術(shù)前MR成像和術(shù)中腫瘤邊緣界定的多模式 造影劑。
[0020] Lia T等人，生物有機化學(xué)和藥物化學(xué)雜志（Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters) ,2010年，20,7124-7126,設(shè)及一種用于前列腺癌的低分子量的近紅外 探針。
[0021] Vera D等人，化giris E E等人和Lia T等人都敘述了使用青色素作為偶聯(lián)各種祀 向部分的報告分子。
[0022] US 2012/088262 A1設(shè)及青色素化合物，綴合物和它們的使用方法。具體而言，所 述文件敘述了胺反應(yīng)性的青色素。
[0023] 應(yīng)當(dāng)注意的是，所有的蛋白質(zhì)包含胺。胺反應(yīng)性分子將結(jié)合在親和性上不具有很 大差異的任意蛋白質(zhì)。在生物樣品中，如血液和組織，存在著大量的胞外蛋白。因此不能實 現(xiàn)對樣品中例如死細(xì)胞的選擇性。在體內(nèi)，強共價結(jié)合到蛋白質(zhì)將僅導(dǎo)致從體內(nèi)非常緩慢 的清除，運增加了不利影響的幾率。
[0024] Fang F等人，光譜化學(xué)學(xué)報.A部：分子和生物分子光譜學(xué)（Spectrochimica Acta.F*a;rt A:molecular and biomolecular spectrosocopy) ,2006年，64(3) ,698-702,設(shè) 及使用光散射技術(shù)用近紅外青色素染料測定核酸。青色素對于DM和RNA的親和性是相同 的。
[0025] 如先前所確定的，DNA結(jié)合劑在人類中的應(yīng)用受限。
[00%] Hong Zheng等人，分析生物化學(xué)（Analytical BiochemistiT) ,2003年，318,86- 90,設(shè)及一種使用長波吸收青色素探針的染料結(jié)合測定法并且描述了染料SHMC與各種蛋白 質(zhì)的相互作用。
[0027]只有分析性應(yīng)用是相同的。
[00巧]Vo化ova K D等人，生物化學(xué)和生物物理化學(xué)雜志（Journal of Biochemical and Bio地ysical Chemisty)，2007年，70，727-733設(shè)及用于淀粉樣蛋白結(jié)構(gòu)的巧光探針，和特 別是能夠結(jié)合淀粉樣蛋白-削太聚集體的青色素。
[0029] 結(jié)合起因于染料與淀粉樣蛋白-β聚集體(而不是個別淀粉樣蛋白-β膚)特征之間 的相互作用。淀粉樣蛋白-β聚集體是在細(xì)胞外的。
[0030] US 2005/014216設(shè)及使用能夠結(jié)合胞內(nèi)蛋白的若丹明類(rhodamines)和鬼筆環(huán) 膚(phalloidin)作為用于肝毒性的探針。
[0031] 化化iao Gong等人，PLoS One,2012,7(3)，e：M003，XP055093071，設(shè)及用SNAP-Tag 的哺乳動物細(xì)胞和異種移植腫瘤的近紅外巧光成像。
[0032] 該文件僅描述了（在通過SNAP-Tag的情況下）點擊化學(xué)（click chemis化y)的應(yīng) 用。
[0033] 本發(fā)明的一個目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中組合物的一個或多個缺點，并且提供替代當(dāng) 前組合物而用于診斷和治療設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的癌癥和其它疾病，并且不損害功能和優(yōu) 點。
[0034] 發(fā)明簡介
[0035] 本發(fā)明設(shè)及根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種包括結(jié)合壞死細(xì)胞的祀向分子，和一種或 多種試劑，載體和在體內(nèi)的非反應(yīng)性分子的系統(tǒng)。
[0036] 本系統(tǒng)包括至少兩個實體，所述實體例如通過化學(xué)鍵而連接，每個實體在系統(tǒng)中 起到不同功能。應(yīng)當(dāng)注意的是，可W存在一個W上的試劑，和一個W上的載體，和一個W上 的非反應(yīng)性分子。因此例如組合療法對本發(fā)明的系統(tǒng)是可行的。
[0037] 本發(fā)明的祀向分子是非常有選擇性的和非常特異的結(jié)合壞死細(xì)胞。作為結(jié)果，本 系統(tǒng)非常低濃度c.q.數(shù)量可W被用于提供其有益效果。應(yīng)當(dāng)注意的是，相比于壞死特異性 探針，細(xì)胞調(diào)亡的特異性探針也將祀向健康組織，因為細(xì)胞調(diào)亡參與正常組織更新。
[0038] 本發(fā)明人在早期的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，祀向分子特異性非共價結(jié)合細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)， 如(僅當(dāng)細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性喪失時，即在壞死細(xì)胞的情況下，可供給祀向分子的）肌動蛋 白。就最佳的祀點而言，壞死細(xì)胞優(yōu)選是在壞死的早期階段，例如細(xì)胞已經(jīng)死亡小于幾天， 優(yōu)選小于半天，如幾個小時，如2個小時，如剛剛死亡的細(xì)胞。負(fù)責(zé)本發(fā)明中祀向分子的有效 祀向性和/或安全性的特征，是它們?yōu)榧?xì)胞膜不可滲透的，即，它們不能（顯著的）穿透健康 細(xì)胞的細(xì)胞膜;它們是非激活的；它們能夠非共價地結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)蛋白（它們的祀向分子）； 和，它們沒有能力/不顯著的結(jié)合DNA(或RNA)。
[0039] 假使該系統(tǒng)包括試劑，該試劑可W設(shè)及成像化合物，例如用于在成像技術(shù)中，治療 性化合物，W對壞死細(xì)胞或有此治療需求的身體的一部分(包括壞死細(xì)胞)提供治療作用， 如癌癥，和釋放因子，其用于釋放進一步化合物，如作為刺激物。
[0040] 假使該系統(tǒng)包括載體，該載體功能作為傳輸實體至壞死細(xì)胞，或如上述的身體一 部分的傳輸介質(zhì)。因此少量的實體可W被祀向和輸送到身體中所期待的位置。載體可W輸 送本試劑，它可W輸送試劑的相關(guān)物，不同的實體，W及它們的組合。
[0041 ]假使該系統(tǒng)包括在體內(nèi)的非反應(yīng)性分子，它旨在使該分子與配對物相互作用。相 互作用可W(進一步)設(shè)及經(jīng)由激活劑的一個或多個激活作用，由催化劑支持，基于相互作 用產(chǎn)生藥物，并基于相互作用釋放藥物。應(yīng)當(dāng)注意的是，從功能點的角度，分子和配對物可 W互換。
[0042] 本系統(tǒng)設(shè)及無毒的小分子，其具有結(jié)合壞死細(xì)胞和組織的能力。運些分子不與DNA 相互作用，即運些分子不是誘變劑。通常的，本系統(tǒng)具有廣泛的生物分布，穿透血-腦屏障， 不結(jié)合到細(xì)胞表面蛋白并且是足夠穩(wěn)定的。
[0043] 在稱為QiemoTraee?的一個實例中，在癌癥治療期間的關(guān)鍵時間被保全。 ChemoTrace?即時提供所給予的化學(xué)治療藥物效力的相關(guān)數(shù)據(jù)。本發(fā)明系統(tǒng)的一個優(yōu)點 是，在化療開始之后的24-36小時之內(nèi)提供該治療是或否為有效的信息。OiemoTrace?的 使用將防止病人經(jīng)受沒有臨床益處的過度治療，運被認(rèn)為是在癌癥治療中的一個重要改 進。ChemoTrace?的使用將導(dǎo)致成本節(jié)約。
[0044] 應(yīng)當(dāng)注意到，不幸的是對化療的（正)反應(yīng)率被限制為20-35%。此外，由于人體的 局限，治療周期的數(shù)量通常被限制為最多4次。換而言之，在開始周期之前，從開始就確定合 適的治療方法是至關(guān)重要的。通過在治療的早期階段的識別，如果治療被認(rèn)為是有效的，治 療本身可W進行下去，并且如果治療被認(rèn)為是無效的，可W被跳過。在非有效的治療的情況 下，第二種治療可W類似地啟動。運種方法可W被重復(fù)額外數(shù)量的次數(shù)。一旦治療被認(rèn)為是 有效的，化療的周期可W啟動。應(yīng)當(dāng)注意的是，該識別可W被重復(fù)用于每個和任何化療。
[0045] OiemoTrace?防止過度治療，節(jié)省了用于防止細(xì)胞毒性藥物副作用的藥物。
[0046] 使用本系統(tǒng)沒有必要培養(yǎng)收集的腫瘤細(xì)胞，例如為了進行測試，運可能需要相對 較長的時間，例如一周。該壞死細(xì)胞在它們的天然環(huán)境中被標(biāo)記，運例如減少了人為錯誤的 風(fēng)險。
[0047] ChemoTrace?可W被用于測量細(xì)胞毒性藥物在體內(nèi)對所有實體瘤的效力，運使 得它是對于臨床的理想系統(tǒng)。運個系統(tǒng)的一個優(yōu)點是在體內(nèi)設(shè)及實際特性，而在體外可能 從實際特性引入偏差。
[004引 ChemoTrace?提供在上述方面的實時數(shù)據(jù)，而不需要進行穿刺來收集腫瘤細(xì)胞。 在運方面應(yīng)當(dāng)注意的是通過穿刺僅僅獲得腫瘤的一個樣品。所獲得的樣品不一定是腫瘤的 真實再現(xiàn)。還應(yīng)當(dāng)注意的是腫瘤是形態(tài)學(xué)上的非均質(zhì)的。甚至進一步的，腫瘤可能隨著時間 而在形態(tài)特征上進展。其后果是，穿刺的樣品至多給出了腫瘤特征的指示。本發(fā)明給出了實 時和高度可靠的特征。
[0049] ChemoTrace?提供W上幾點的可靠結(jié)論，如通過直接測量，而現(xiàn)有技術(shù)只能提供 特征的指示。
[0050] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種裝置，其測量由放射性治療引起的對腫瘤細(xì)胞和健 康組織的影響，該裝置被稱為Actinotrace?。
[0051] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種裝置，其是為了預(yù)防目的而檢測在人體內(nèi)死亡細(xì)胞 的全身掃描，該裝置被稱為NC-Scan?。
[0052] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及用于通過祀向腫瘤中的壞死細(xì)胞而治療癌癥的遞送平 臺，該平臺被成為Ilurnieore?。
[0053] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種遞送活性和再生化合物至由缺血事件所引起的壞死 區(qū)域的平臺，缺血事件如屯、肌梗死或中風(fēng)，肝、腎或其它器官缺血，創(chuàng)傷，關(guān)節(jié)炎或燒傷，該 平臺被稱為Regenext?。
[0054] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種對乳房攝影掃描儀的非核子的可替代物，其稱為 Mammolight?c
[0055] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種用于在實體瘤中祀向遞送(化)療藥物的裝置，該裝 置被稱為Chemoclick?。
[0056] 在一個方面，本發(fā)明設(shè)及一種祀向熱療法(溫?zé)岑煼ǎ?，其被稱為Hyperthermys?。
[0057] 除了癌癥之外，目前的疾病設(shè)及例如屯、臟和大腦的梗死組織，骨關(guān)節(jié)炎，神經(jīng)系統(tǒng) 疾病如阿爾茨海默氏病。
[0058] 本發(fā)明還設(shè)及該組合物作為藥物的應(yīng)用；該系統(tǒng)在診斷方法中的應(yīng)用，該系統(tǒng)在 用于設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的疾病治療中的應(yīng)用，該組合物在用于在體內(nèi)和/或體外檢測和/ 或祀向壞死細(xì)胞中的應(yīng)用；設(shè)及包括所述系統(tǒng)的劑量;設(shè)及使用所述組合物確定樣品內(nèi)組 合物的定位的方法;和，設(shè)及使用所述組合物用于治療設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的癌癥和/或疾 病的方法。
[0059] 本發(fā)明的祀向分子已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)非常有選擇性的結(jié)合死亡(壞死)細(xì)胞。
[0060] 如先前所述，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)壞死細(xì)胞和/或壞死通常是有吸引力的祀點。運樣 設(shè)及壞死細(xì)胞區(qū)域的觀測通常是存在于癌癥(腫瘤）中，例如由于不充分的血液供應(yīng)和因此 缺乏氧氣，并且在(或?qū)е?設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的疾病中。應(yīng)當(dāng)注意到壞死細(xì)胞區(qū)域典型 地不會在健康組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)。設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的疾病的實例包括腦梗塞或缺血性損傷 (即屯、肌梗死，中風(fēng)，腎，肝等），創(chuàng)傷(如腦，肌肉，骨)感染或炎癥（即感染性休克，類風(fēng)濕性 關(guān)節(jié)炎，骨壞死），退行性疾病（即阿爾茨海默病，帕金森氏癡呆癥），斑塊(動脈粥樣硬化，淀 粉樣蛋白）燒傷，福射誘導(dǎo)的壞死和糖尿病。
[0061] 至于癌癥，一旦腫瘤已經(jīng)被識別，進一步的壞死性細(xì)胞死亡可W在部分腫瘤上被 有意誘導(dǎo)(例如通過局部福照，光動力或局部熱療法和/或聚焦的超聲波），w提供所述組合 物的一個較大祀點。此外，本組合物被用于治療目的，壞死細(xì)胞的數(shù)量將隨著治療的不斷進 展而增加從而導(dǎo)致因時間作用而劑量擴增。
[0062] 對細(xì)胞死亡分類的一個有益討論可W在Kroemer等人，細(xì)胞死亡和差異（Cell Death and Differentiation) ,2005年，12,1463中發(fā)現(xiàn)。在本申請中，壞死細(xì)胞被認(rèn)為是已 經(jīng)失去細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定細(xì)胞膜是否完全，即完整性，如通過 使用巧光染料，如使用商業(yè)化的胺反應(yīng)性染料。本發(fā)明的組合物對于死亡細(xì)胞的選擇性，可 W在體外試驗中被證明，運將在下面的實施例中顯示，所述死亡細(xì)胞即已經(jīng)失去細(xì)胞膜完 整性的細(xì)胞。重要的是注意結(jié)合于死亡細(xì)胞的胺活性染料僅在體外是有用的。在體內(nèi)，它們 會與例如血液中蛋白質(zhì)或其它化合物的胺反應(yīng)，并且將不能夠用于祀向壞死細(xì)胞。
[0063] 術(shù)語選擇性表明祀向化合物對壞死細(xì)胞比健康細(xì)胞具有更高的親和力（因此祀向 分子可W祀向壞死細(xì)胞）。運些可W根據(jù)所附的每個實施例在體外分析中，或者如通過流式 細(xì)胞儀而確定；在運兩種方法中，可W使用共染色法，例如使用商業(yè)的活死細(xì)胞染色試劑 盒。簡而言之，在本發(fā)明中選擇性結(jié)合表示對于包含壞死和健康細(xì)胞的給定的細(xì)胞群體，結(jié) 合壞死細(xì)胞的祀向分子的數(shù)量要比結(jié)合健康細(xì)胞的祀向分子的數(shù)量至少高一個數(shù)量級，一 般為幾個數(shù)量級，并且優(yōu)選為6個或更多個數(shù)量級，如9個數(shù)量級。
[0064] 未活化的青色素是對如胺和硫醇非反應(yīng)性的青色素。未活化的青色素不能通過共 價鍵連接到呈現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)的分子上的胺、硫醇或其它活性官能團而顯著的（反應(yīng)不是熱力 學(xué)有利的）結(jié)合死細(xì)胞(其分子的官能團）。也就是說，在本發(fā)明上下文中的選擇性結(jié)合壞死 細(xì)胞是不通過共價鍵，而是經(jīng)由青色素核屯、結(jié)構(gòu)通過非共價鍵結(jié)合，并且不是通過活性基 團所連接的側(cè)鏈而結(jié)合。術(shù)語活化的青色素是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，并且包括例如醋 類，N-徑基班巧酷亞胺醋，馬來酷亞胺，酷基氯，SDS醋類等激活的簇酸。未活化的青色素包 括如包含簇酸功能的青色素，即簇酸沒有被激活。
[0065] 應(yīng)當(dāng)注意的是活化的青色素可W在組合物的形成中使用，例如對于連接成像的 和/或治療的化合物至青色素的目的；然而在該組合物中，所述青色素是未活化的，并且通 過青色素核屯、結(jié)構(gòu)仍將結(jié)合壞死細(xì)胞。
[0066] 本描述的優(yōu)點詳述在整個說明書中。
[0067] 發(fā)明詳述
[0068] 應(yīng)當(dāng)注意的是給出的實施例和實施方案不被認(rèn)為是限制性的。本發(fā)明的范圍是由 權(quán)利要求所限定的。
[0069] 在第一個方面中，本發(fā)明設(shè)及包含結(jié)合壞死細(xì)胞的祀向分子的系統(tǒng)，該祀向分子 選自青色素或任意其它巧光染料，包括若丹明類，其特異性的非共價結(jié)合于細(xì)胞內(nèi)的蛋白 質(zhì)。用于結(jié)合的蛋白質(zhì)可W設(shè)及纖維蛋白，如40kDa的蛋白質(zhì)，lOOkDa的蛋白質(zhì)，如微管蛋 白，如α-微管蛋白，β-微管蛋白，丫-微管蛋白，δ-微管蛋白和ε-微管蛋白，肌動蛋白，如G-肌 動蛋白，和F-肌動蛋白，纖維狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，如角蛋白，如中性、堿性或酸性角蛋白，如角蛋 白1-角蛋白20，金屬酶類，如締醇化酶，和裂解酶，CDC37，優(yōu)選是微管蛋白，最優(yōu)選是肌動蛋 白，它們的異構(gòu)體，它們的復(fù)合體，和它們的分解產(chǎn)物。只有當(dāng)細(xì)胞膜完整性喪失時，即在壞 死細(xì)胞的情況下，運些蛋白質(zhì)才可用于祀向分子。例如聯(lián)合使用如下所述的干冰死細(xì)胞測 定法與巧光顯微鏡，可W確定結(jié)合壞死細(xì)胞的選擇性。優(yōu)選的，相比于活細(xì)胞，對于壞死細(xì) 胞至少有2倍高的親和力，優(yōu)選至少10倍，最優(yōu)選至少1000倍，如至少1000000倍。類似的，相 比于對DNA的親和力，祀向分子對一種或多種上述蛋白質(zhì)的親和力是至少2倍高，優(yōu)選至少 10倍高，最優(yōu)選至少1000倍高，如至少1000000倍高，如該祀向分子不和/或不能與DNA結(jié)合， 即該祀向分子不顯著的結(jié)合DNA或RNA。
[0070] 在一個實例中，該祀向分子是根據(jù)圖II，Π 和III的非反應(yīng)性青色素染料，其中η是 整數(shù)，如ne [2，10]，優(yōu)選ne [4,引，鏈L具有不超過η-1個雙鍵，優(yōu)選rV2個雙鍵，
[0071] 其中亞族II和ΙΠ 可W分別包括由曲線C表示的一個和兩個芳香環(huán)體系(A、B)，
[0072] 其中A、B優(yōu)選各自獨立的選自苯和糞，
[0073] 其中其它基團Rs、R6、R?和Rs可W存在，Rs、R6、R?和Rs是優(yōu)選各自獨立選自Η和烷基， 如甲基、乙基、和丙基、優(yōu)選甲基，
[0074] 其中芳香環(huán)體系可W包括另外的官能團Ri、R2和/或取代基，Ri、R2是優(yōu)選各自獨立 選自H、橫酸基、和橫酷胺，
[0075] 其中交替單鍵和雙鍵的鏈L可W被一個或多個部分的和完全的飽和的環(huán)結(jié)構(gòu)（如 環(huán)戊締和環(huán)己締 W及它們的組合，如一個或更多個環(huán)己締環(huán)）中斷，其中所述飽和環(huán)結(jié)構(gòu)還 可W包括官能團R9,其選自H、AA和BB，其中Rio選自H、S0 抽、Cl、-N-C = 0-(CH2)q-Y3(q=l- 6)、- (C肥）r-Y4 (r = 1 -6)、& 和Y4各自獨立的是Η、C00H、SO抽和 CN，
[0076] 其中氮原子(N)還可W包括功能性N偵蠟基團R3、R4,其中R3、R4優(yōu)選各自獨立的選 自-(C出)mY，其中Y各自獨立地選自具有1-4個碳原子的簇酸、橫酸醋基、CN、C^C、和C = C，W 及它們的鹽，
[0077] 其中，所述N側(cè)基基團包含m個碳原子，如m e [ 1，10 ]，優(yōu)選m e [ 2，8 ]，更優(yōu)選m e [ 3， 7]，最優(yōu)選111 = 4、5、和6，
[007引甚至更優(yōu)選至少一個m = 4、5、和6;優(yōu)選一個m = 6,而另一個m優(yōu)選是4、5或6，
[0079] 其中所述N側(cè)基基團包含一個或多個在末端上與N相對的官能團，如具有1-4個碳 原子的簇酸，橫酸基，和它們的鹽，如鋼鹽和鐘鹽，最優(yōu)選在末端上的官能團包括一個或多 個雙C-C鍵，優(yōu)選是其簇酸鹽，和/或
[0080] 其中所述祀向分子是中性的或帶負(fù)電荷的。
[0081] 特別是在測試中上述青色素已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是非常合適的，例如在選擇性方面。
[0082] 有利的是，在如DNA和RNA的其它細(xì)胞成分存在下，具有負(fù)電荷的本發(fā)明的青色素 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)。也就是說，具有負(fù)電荷的本發(fā)明的青色素通常沒有顯 示出顯著地結(jié)合DNA或RNA。
[0083] 祀向分子優(yōu)選選自：冊4、冊5、冊6、冊7、ICG、CW 800、ZW800、L4、L7、Lll、CY3、CY3b、 CY3.5、CY5、CY5.5、CY7、Dy 676、Dy 681、Dy 731、Dy 751 和Dy 776;而且，最優(yōu)選選自朋4， HQ5，CW800和ZW800。運些化合物在圖2中顯示。一些運些化合物具有例如非常好的巧光特 性。運是相當(dāng)出乎意料的，因化合物本身可能具有良好的巧光特性，但是其在結(jié)合到另一個 分子時可能發(fā)生變化，所述另一個分子如所存在的蛋白質(zhì)。
[0084] 在一個實例中，試劑是(下列(a)、（b)和(C)中的一種或多種）：（a)成像化合物選自 下組:發(fā)光化合物、放射性示蹤劑、MRI造影劑或分光劑、RFA(射頻消融)劑、PET劑、SPECT劑、 超聲微泡或造影劑、光聲納米微粒或造影劑、CT造影劑、拉曼劑或它們的組合。換而言之，一 種適宜的成像化合物可W被用于本系統(tǒng);令人驚奇的是廣泛的運類成像化合物可W用于本 系統(tǒng)。因此大范圍成像技術(shù)已經(jīng)變得可應(yīng)用。運類成像技術(shù)已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)是非常敏感的，即， 可W檢測少量的壞死細(xì)胞，非常準(zhǔn)確，即包括壞死細(xì)胞的非常小的位置可W被識別，非?？?靠，并且非常確信，例如關(guān)于結(jié)論。該試劑還可W是治療性化合物。作為上述治療性化合物 可W被帶到壞死細(xì)胞，使用少量的治療性化合物，而且還提供其在預(yù)期位置一種相對高的 數(shù)量，所述預(yù)期位置即壞死細(xì)胞。治療性化合物(或其一種或多種)可W選自下組:化療劑、 光動力學(xué)化合物、升溫化合物(包括光熱劑）、免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)和多膚、核酸(RNA-或DNA- 基）、藥物（如抗體），和/或它們的組合。因此許多療法和它們的組合可W進行。該試劑也可 W是用于刺激組織再生的一個或多個釋放因子，如生長因子和干細(xì)胞。組織和細(xì)胞的運樣 的修復(fù)和/或再生是可能的。
[0085] 在一個實例中，載體選自下組:脂質(zhì)體、樹狀聚合物、可生物降解的顆粒、膠束、納 米微粒、聲解離性顆粒、pH解離性顆粒、光解離性顆粒、熱解離性顆粒、馨合部分W及它們的 組合。取決于本發(fā)明的系統(tǒng)，如存在其它組分的情況下，可W選擇適宜的載體。同樣的，可W 選擇載體的組合。例如馨合部分可W被用于傳輸In、F、Ga、Gd和Tc。
[0086] 可W考慮的載體是用作提高藥物的遞送和效力的機制的物質(zhì)。載體可W用于控釋 W降低藥物的代謝、在體內(nèi)延長藥物的作用、和降低藥物的毒性。本載體還用于提高藥物遞 送到祀點位置效力，如藥理作用的祀點。
[0087] 在一個實例中，在體內(nèi)的非反應(yīng)性分子，其可W被稱作點擊A，是能夠與配對物相 互作用的，所述配對物可W被稱作點擊B。該非反應(yīng)性分子優(yōu)選是一種或多種第一點擊化學(xué) 組分，第二點擊化學(xué)組分（互補于第一點擊化學(xué)組分），和自標(biāo)記蛋白質(zhì)標(biāo)簽的組分，如 Snap-化g。優(yōu)選的，點擊化學(xué)組分"點擊"而不需要如銅（I)的催化劑。
[0088] 在第二個方面，本發(fā)明設(shè)及用作藥物的本發(fā)明的系統(tǒng)。如上所述的本系統(tǒng)可W包 括治療性化合物。該系統(tǒng)可W因此充當(dāng)藥物。優(yōu)選使用本藥物用于治療貫穿于本申請中所 確定的疾病、病癥等。
[0089] 在第Ξ個方面，本發(fā)明設(shè)及本發(fā)明的系統(tǒng)在診斷方法中的用途，如MRI、SPECT、RFA (射頻消融）、PET、CT、拉曼光譜、超聲、光學(xué)和光電聲。因為本系統(tǒng)具有用于成像的優(yōu)越特 性，優(yōu)選經(jīng)由一個或多個上述方法進行診斷。
[0090] 在第四個方面，本發(fā)明設(shè)及本發(fā)明的系統(tǒng)用于治療設(shè)及壞死性細(xì)胞死亡的疾病， 包括梗塞或缺血性損傷(如屯、肌梗死、中風(fēng)和腎），創(chuàng)傷(如在腦、肌肉、骨中的），感染或炎癥 (如感染性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、和骨壞死），退行性疾病(如阿爾茨海默病、帕金森氏癡呆 癥），斑塊(如動脈粥樣硬化、和淀粉樣蛋白），和糖尿病。本系統(tǒng)可W用于治療疾病的額外實 例包括在整個說明書中。
[0091] 在第五個方面，本發(fā)明設(shè)及一種用于檢測和/或治療癌癥和/或設(shè)及壞死性細(xì)胞死 亡的疾病的劑量，其包含有效量的本發(fā)明的系統(tǒng)。
[0092] 在一個實例中，該劑量包含0.1-1000納摩爾系統(tǒng)/kg體重的量，優(yōu)選0.5-500納摩 爾系統(tǒng)/kg體重，更優(yōu)選1-250納摩爾系統(tǒng)/kg體重，甚至更優(yōu)選2-100納摩爾系統(tǒng)/kg體重， 如5-50納摩爾系統(tǒng)/kg體重;其可W設(shè)及如0.01-1毫克的劑量。該劑量優(yōu)選在1-50毫升生理 溶液中提供。優(yōu)選提供包括一些(1 -50)劑量的試劑盒。
[0093] 在第六個方面，本發(fā)明設(shè)及一種用于在樣品中確定定位的方法，所述樣品包含含 有壞死細(xì)胞的細(xì)胞群體，包括：
[0094] (a)提供根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)；
[00%] (b)使用至少第一適宜的成像技術(shù)，在樣品上進行一個或多個測量，提供一個值或 多個值，和；
[0096] (C)分析所述測量的一個值或多個值W確定定位，任選的通過與一組參考值進行 比較。至少一些上述技術(shù)是非常適合于運個方面的。該方法可W在體內(nèi)和體外進行。
[0097] 在第屯個方面，本發(fā)明設(shè)及用于治療癌癥和/或設(shè)及壞死的疾病的方法，包括：
[0098] (a)給予本發(fā)明的組合物，其中所述組合物包含一種或多種治療性化合物
[0099] (b)在癌癥和/或壞死性細(xì)胞死亡中確定該組合物的定位
[0100] (C)激活從載體中至少所述治療性化合物的釋放和/或激活該治療性化合物。治療 可W在體內(nèi)進行。
[0101] 本發(fā)明通過實施例和附圖而進一步被詳述，實施例和附圖本質(zhì)是示例性和解釋性 的，并且不限制本發(fā)明的范圍。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是清楚的，許多顯而易見的或非顯而易 見的變體可W被設(shè)想落入到保護范圍內(nèi)，該保護范圍是由本權(quán)利要求書限定的。
【附圖說明】
[0102] 圖1顯示本青色素的Ξ個主要亞族的通用結(jié)構(gòu)。青色素是屬于聚甲烘類的合成染 料家族的非系統(tǒng)名稱。參照圖1中的中央碳鏈;η是整數(shù)，如ne[2，10]，優(yōu)選ne[4,引。鏈L具 有不超過n-1個雙鍵，優(yōu)選n/2個雙鍵。亞族II和ΙΠ 可W分別包括一個和兩個由曲線C表示 的芳香環(huán)體系(A、B)dA、B是優(yōu)選各自獨立的選自苯和糞?？蒞存在基團Rs、R6、R7和Rs?；?、R6、 R?和R8是優(yōu)選各自獨立選自Η和烷基，如甲基、乙基、和丙基，優(yōu)選甲基。芳香環(huán)體系可W包括 額外的官能團Ri、R2和/或取代基。Ri、R2是優(yōu)選各自獨立選自H，橫酸基，和橫酷胺。交替單鍵 和雙鍵的鏈L可W被一個或多個部分的和完全飽和的環(huán)結(jié)構(gòu)中斷，如環(huán)戊締和環(huán)己締 W及 它們的組合，如一個或更多個環(huán)己締環(huán)。飽和環(huán)結(jié)構(gòu)還可W包括官能團化，化選自H、AA和BB。 Rio選自H、SO抽、C1、-N-C = 0-(C肥、-Y3(q = 1 -6)、-(C肥）r-Y4(r = 1 -6)。Y3和Y4各自獨立的是 H、C00H、S0抽和CN中的一個。氮原子(N)還可W包括功能性N偵陛基團化、R4dR3、R4優(yōu)選各自獨 立的選自-(C出UdY各自獨立地選自具有1-4個碳原子的簇酸、橫酸醋基、CN、C^C、和C = C， W及它們的鹽。N側(cè)基基團包含m個碳原子，如me [1，10]，優(yōu)選me [2,引，更優(yōu)選me [3,7]， 最優(yōu)選m = 4、5、和6，甚至更優(yōu)選至少一個m=4、5、和6，優(yōu)選一個m=6，而另一個m優(yōu)選是4、5 或6"N側(cè)基基團包含一個或多個在末端上與N相對的官能團，如具有1-4個碳原子的簇酸，橫 酸基，和它們的鹽，如鋼鹽和鐘鹽。最優(yōu)選在末端上的官能團包括一個或多個雙C-C鍵。
[0103] 術(shù)語青色素是指其核屯、結(jié)構(gòu)是亞族1、11或III的任意化合物。在如切3、Cy 5、切 7等青色素名稱中的整數(shù)是指在鏈L中碳原子的數(shù)目。在示例性的實施方案中，青色素屬于 運些家庭中的一個。
[0104] 圖2顯示了若丹明類的通用結(jié)構(gòu);R1至R12可W是氨或官能團，適宜官能團的實例 包括橫酸基團、簇酸基、橫酷胺、醇類、胺類、醋類、酸類、硫醇類、硫代醋類W及它們的組合。 術(shù)語若丹明類是指其核屯、結(jié)構(gòu)是在圖2中所示的任意化合物。
[0105] 圖3(a)-(j)給出了在整個申請中提及的化合物的結(jié)構(gòu)。其中所示的平衡離子可W 是例如H+、化+或r。
[0106] 圖4-5給出了本祀向分子的優(yōu)選實施例。
[0107] 圖6-11顯示實驗的結(jié)果;運些結(jié)果詳述如下。
[010引圖12顯示NP-CW800的示意圖。
[0109] 圖 13 顯示DTPA-C0-NH-PEG-N出的結(jié)構(gòu)。
[0110] 圖 14 顯示 DTPA-C0-NH-PEG-HQ4 的結(jié)構(gòu)。
[0111] 圖15顯示點擊A-HQ4-DTPA的兩種變體的結(jié)構(gòu)。
[0112] 圖16顯示點擊A-ZW800-DTPA的結(jié)構(gòu)。
[0113] 圖17顯示點擊A-ZW800-N0TA的兩種變體的結(jié)構(gòu)。
[0114] 圖18顯示點擊經(jīng)A-ZW800 (在錠基處)改性的-ΝΟΤΑ的結(jié)構(gòu)。
[0115] 圖19a顯示ZW800-連接體-ΝΟΤΑ和點擊A的結(jié)構(gòu)
[0116] 圖19b顯示冊4-連接體-ΝΟΤΑ和點擊A的結(jié)構(gòu)
[0117] 參考圖 6-11:
[0118] 測量技術(shù)
[0119] 在本次調(diào)查中，應(yīng)用了一些現(xiàn)有的和/或內(nèi)部開發(fā)的技術(shù)：
[0120]
[0121] ??童百科：]"巧光是由已經(jīng)吸收光或特定波長的其它電磁福射的物質(zhì)發(fā)射的光。 在大多數(shù)情況下，所發(fā)射的光具有更長的波長，因此比所吸收的福射具有較低能量。"
[0122] 用巧光測量，所W也是體內(nèi)巧光，很難被量化。在活的生物或細(xì)胞組織中所測量的 強度是-除了巧光化合物本身的固有亮度和其濃度-也依賴該化合物的物理性質(zhì)，即與它周 圍蛋白質(zhì)的結(jié)合比和與它們相互作用的類型和貫穿組織的該物質(zhì)的分布。
[0123] 最后，測量的靈敏度和特異性是非常強烈的依賴于實驗方案的。
[0124] 干冰死細(xì)胞分析
[0125] 在乙醇中的固態(tài)二氧化碳(-80°C)被用于凍結(jié)具有活細(xì)胞培養(yǎng)基（和可能還有其 它組分）的24孔板的孔中屯、。已經(jīng)通過使用具有針腳的冷卻塊而優(yōu)化該步驟，所述冷卻塊被 保持至24孔板的底部一定時間（大多約15秒）。其結(jié)果是冷凍和隨之發(fā)生被仍然存活的細(xì)胞 包圍的孔中屯、的細(xì)胞死亡，從而能進行死細(xì)胞和活細(xì)胞之間的比較研究。
[0126] 含有能區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞的化合物的介質(zhì)被施加到培養(yǎng)孔中。溫育后，洗涂細(xì) 胞層并且成像。
[0127] 冷凍損傷小鼠模型
[0128] -個3mm直徑的小金屬圓柱體在液氮中預(yù)冷并且施加到麻醉小鼠頭的頂骨區(qū)20或 60秒。在一定時間之后在尾靜脈注射染料-定濃度）。注射3-24小時之后，小鼠可W被成 像。
[0129] 本發(fā)明用于壞死細(xì)胞（即細(xì)胞膜失去完整性的細(xì)胞）的組合物的選擇性在體外試 驗中被證明，如將在下面的實施例中顯示。
[0。0] 基質(zhì)膠
[0131] 基質(zhì)膠是由特定的小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的一種凝膠狀蛋白混合物。在本發(fā)明中，基 質(zhì)膠被用作死細(xì)胞的內(nèi)源性基質(zhì)，其被植入到小鼠皮膚下。如果運些細(xì)胞也被標(biāo)記，可W確 認(rèn)染料和構(gòu)建體被分布在全身，所W也分布在血流之外。
[0132] MS0T
[0133] ^譜光聲斷層成像技術(shù)是一種用于在小動物中生物化學(xué)標(biāo)記物的全身成像技 術(shù)。光的吸收導(dǎo)致可W產(chǎn)生聲波的一個小的熱膨脹。運些可W被檢測并且轉(zhuǎn)換在一個Ξ維 圖像中。
[0134] 概念驗證
[0135] 圖6
[0136] 在用細(xì)胞毒性劑星抱素處理或未處理的粘附（4T1)細(xì)胞和非粘附(JU服AT)細(xì)胞上 使用冊5的流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)。探針僅染色星抱素處理的細(xì)胞，其已經(jīng)失去膜的完整性。
[0137] 圖7
[0138] 共焦顯微鏡:a:藤黃酸（一種壞死誘導(dǎo)劑）處理的細(xì)胞和b:活細(xì)胞。C-D:使用鬼筆 環(huán)膚的F-肌動蛋白的共染色與標(biāo)示結(jié)合肌動蛋白的冊5的朋5來共定位。（C:藤黃酸處理的 細(xì)胞和d:星抱素處理的細(xì)胞）。
[0139] 圖8
[0140] 為了顯示HQ5在體內(nèi)結(jié)合壞死細(xì)胞的容量，在注射HQ5之前誘導(dǎo)腦的局部冷凍損 傷。此外，有或沒有壞死細(xì)胞的基質(zhì)膠被進行皮下移植。HQ5特異性的積聚在冷凍部位和具 有壞死細(xì)胞的基質(zhì)膠中，而不是積聚在無壞死細(xì)胞的基質(zhì)膠中。
[0141] 圖9
[0142] 為了顯示朋5體內(nèi)結(jié)合壞死細(xì)胞的容量W更好的生理模式相比于冷凍損傷。含有 放射性In-111的冊4-DTPA被注射到具有壞死核屯、的患瘤小鼠中。A.在探針注射后24小時 觀察到腫瘤特異性冊4巧光，持續(xù)至少72小時。B.在探針注射后24小時檢測到一個特定的放 射性SPECT信號，持續(xù)至少72小時。C.觀察到巧光信號和放射性信號與壞死核屯、在體外共定 位。
[0143] 圖10
[0144] 為了研究使用青色素染料遞送化GA納米微粒到壞死區(qū)域的可能性，有或沒有 CW800包被的PLGA納米微粒被注射到腦部具有冷凍損傷的動物中。低濃度(稀釋2倍或更多） 的CW800包被的化GA納米微粒選擇性積聚在壞死區(qū)域中，而沒有包被的對照組化GA納米微 粒沒有選擇性積聚在壞死區(qū)域中。
[0145] 圖11
[0146] 光動力療法是公知的能夠?qū)е聣乃?。在該動物左?cè)的4T1腫瘤的光動力治療后6小 時，注射CW800包被的PLGA納米微粒。在右側(cè)的第二個腫瘤未作治療。CW800包被的PLGA納米 微粒僅積聚在所治療腫瘤的位點。
[0147] 本發(fā)明的示例性系統(tǒng) [014引實施例1-參考圖12
[0149] PLGA納米微粒的制備。使用0/W乳液和溶劑蒸發(fā)-提取法制備具有包埋近紅外巧光 標(biāo)記的PLGA納米微粒。簡而言之，在3血DCM中的90mg PLGA含有近紅外(NIR)700皿(680R從 LI-C0R)(3mg)被逐滴加入到25mL含2%(w/v)PVA的蒸饋水中，并且使用超聲波儀乳化90秒 (化anson，sonof i er 250)。脂類（DSPE-陽G(2000)胺（8mg)和mPEG 2000陽（8mg))的組合溶 解在DCM中，并且加入到小瓶中。經(jīng)由氮氣流除去DCM。隨后，該乳液被迅速加入到含有脂類 的小瓶中，并且使用超聲波儀將溶液均質(zhì)30秒。在4°C下溶劑蒸發(fā)過夜之后，經(jīng)由在eoooog 下超速離屯、30分鐘收集所述PLGA納米微粒，用蒸饋水洗涂Ξ次，并且凍干。
[0150] 共輛CW800-NHS至化GA納米微粒。CW800-NHS共輛到含DS陽-PEG(2000)-胺的化GA 納米微粒制劑上。隨后，微粒(50mg)溶解在0.5mL的碳酸緩沖液(pH 8.5)中，并且該激活的 CW800-NHS(lmg)在室溫下1小時期間內(nèi)加入到顆粒中。通過離屯、（lOOOOg，在10分鐘內(nèi)）除去 未結(jié)合的CW800-NHS并且用PBS洗涂化GA納米微粒-CW800四次。通過Odyss巧掃描確定在微 粒表面的CW800的數(shù)量(表1)。
[0151] 動態(tài)光散射和Z電位。在所有納米微粒上的動態(tài)光散射(DLS)測量是在一個ALV光 散射儀器上進行的，該光散射儀器配備有ALV5000/60X0多頭相關(guān)器和在532nm的波長下操 作的化xius化IM-532 150mW DPSS激光器。折射率與包圍圓柱形散射池的過濾的順式糞燒 浴相匹配，并且使用化ake F3-K恒溫器控制溫度在21.5±0.3°C。對于各樣品的自相關(guān)函 數(shù)，g2(T)，W90°檢測角記錄10次。對于每個測量的擴散系數(shù)，D，使用2階累積而測量，并且 假定粒子是球形的而計算出相應(yīng)的粒徑(參見表1)。在Malvern ZetaSizer 2000(英國）上 測定所有納米微粒的Z電位。
[0152]
[0153] 實施例2-參考圖13
[0154] DTPA-PEG-N 肥的合成
[0155] 在C1-時tCl樹脂上合成含有PEG胺連接的DTPA(4,7，10-S氧雜-1,13-十Ξ燒二 胺，在式(DTPA-PEG-NH2)中表示為陽G-N此）。因此，在含6當(dāng)量DIEA的DCM存在下，通過在室 溫下3當(dāng)量Fmoc-PEG胺反應(yīng)過夜，F(xiàn)moc-PEG胺被并入到C1-時tCl樹脂（CTC樹脂）上。通過 Fmoc定量而測定最終負(fù)荷:所得的值是約0.8毫摩爾/克。用贓晚-DMF( 1:5) (1 X 1分鐘，2 X 10分鐘）除去Fmoc基。接著，使用DIPCDU2當(dāng)量）和H0化（2當(dāng)量）使DTPA-(四-叔下基醋）- C00H(2當(dāng)量)在DMF中過夜偶聯(lián)。在偶聯(lián)過夜之后，巧Ξ酬測試呈陰性，隨后，在兩個步驟中 實施DTPA-(四-叔下基醋)-C0-NH-PEG-CTC-樹脂裂解和脫保護。用含1%立氣乙酸(TFA)的 DCM處理DTPA-(四-叔下基醋)-C0-NH-PEG-CTC-樹脂10次，每次1分鐘。使用真空除去過量的 DCM，并且使用95%TFA，2.5%S異丙基硅烷(TIS)和2.5%的水除去側(cè)鏈保護基團。除去了尸八 后，在化氣流中用冷的MT邸沉淀DTPA-C0-NH-PEG-NH2。在水中溶解DTPA-C0-NH-PEG-NH2并 且凍干^獲得最終產(chǎn)品。通過冊1"保留時間（*1〇是2.28分鐘）進行分析，所期望的0了口八- C0-NH-PEG-NH2產(chǎn)率為85.0 %，純度為90.6 %。冊LC-MS，m/z計算值：對于C2地37化Oil為 523.25，實測值：524.5.28[M+1 ]+和MALDI-T0F實測值524.2[M+1 ]+546.3[M+Na]。
[0156] 實施例3-參考圖14
[0157] DTPA-C0-NH-PEG-N肥-冊4 的合成。
[015引將溶解于50化二甲基亞諷(DMS0)的冊4-NHS(8.3xl0-4毫摩爾，1毫克）添加到溶解 于含有扣L DIEA的200μΙ DMS0中的DTPA-C0-NH-PEG-N肥(2.8 X 10-3毫摩爾，2毫克），并且在 室溫下攬拌過夜。隨后，通過RP-冊LC純化該復(fù)合的DTPA-C0-NH-PEG-HQ4。通過HPLC(tR 5.34)進行分析，所期望的00*曰斗66-朋5的產(chǎn)率為50.5%，純度為98%邊化(：-15，111八計算 值:對于 C6 抽 90N80i7S2 為 1331.59，實測值：1332.0[]?+1]+和]^101-1'0。實測值1331.9[]\1+1] + 1353.9[M+Na]〇
[0159] 根據(jù)本發(fā)明的系統(tǒng)的進一步實例顯示在附圖15-19中。
[0160] 圖 15a 和 15b-點擊 A-HQ4-DTPA 的變體
[0161] 點擊A = 2-氯基苯并嚷挫
[0162] 載體=二亞乙基Ξ胺五乙酸(DTPA)
[0163] 圖 16-點擊 A-ZW800-DTPA
[0164] 點擊A = 2-氯基苯并嚷挫
[01化]載體=二亞乙基Ξ胺五乙酸(DTPA)
[0166] 圖 17a 和 17b-點擊 A-ZW800-N0TA 的變體
[0167] 點擊A = 2-氯基苯并嚷挫
[016引載體=2,2,2-(1，4,7-^氮雜環(huán)壬燒-1，4,7-^基)-^乙酸(備了八）
[0169] 圖18-點擊A-ZW800-改性的(在錠基處)-N0TA
[0170] 點擊A = 2-氯基苯并嚷挫
[0171] 載體=2,2,2-(1，4,7-^氮雜環(huán)壬燒-1，4,7-^基)-^乙酸(備了八）
[0172] 應(yīng)當(dāng)注意的是，雖然在實施例16-18中R = S03^即該青色素是化合物ZW800)，R也可 W是另一個部分，如例如H、烷基等，如果所得到的青色素落入到一個或多個權(quán)利要求的范 圍之內(nèi)。
[0173] 圖 19a-ZW800-連接體-ΝΟΤΑ和點擊A
[0174] 點擊A = 2-氯基苯并嚷挫
[01巧]載體=2,2,2-(1，4,7-^氮雜環(huán)壬燒-1，4,7-^基)-^乙酸(備了八）
[0176] 圖19b-HQ4-連接體-ΝΟΤΑ和點擊A
[0177] 點擊A = 2-氯基苯并嚷挫
[017引載體=2,2,2-(1，4,7-^氮雜環(huán)壬燒-1，4,7-^基)-^乙酸(備了八）
[0179] 作為權(quán)利要求15-18中系統(tǒng)的替代，其中所述載體和點擊A(在體內(nèi)能夠與配對物 相互作用的非反應(yīng)性分子)設(shè)置在青色素的不同的第一和第二官能團上，使用雙功能連接 物可W連接載體和點擊A(在體內(nèi)能夠與配對物相互作用的非反應(yīng)性分子)至青色素的單一 官能團上，如在圖19中顯示的通過賴氨酸。在圖19a中，點擊A和ΝΟΤΑ通過ZW800的簇酸基而 連接。經(jīng)由一個側(cè)臂，類似的策略可W應(yīng)用于通過側(cè)臂而連接，該側(cè)臂即錠基團中的氮。
[0180] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到祀向分子和：（a)試劑，（b)載體和/或（C)在體內(nèi)能夠與 配對物相互作用的非反應(yīng)性分子的其它組合是可能的，例如點擊A-HQ4-N0TA，點擊A-HQ5- N0TA/DTPA，點擊A-CW800-N0TA/DTPA，點擊A-ZW800-N0TA/DTPA等。ΝΟΤΑ和DTPA是適用于傳 遞試劑(如金屬離子)的馨合配體的實例。
[0181] 名詞解釋
[0182] 4Τ1-細(xì)胞源自鼠類的乳腺癌細(xì)胞。
[0183] 4T1-1UC2相同的細(xì)胞，但遺傳修飾W具有巧光素酶-2,伴隨光的照射而可W轉(zhuǎn)換 巧光素（luc)的酶。所W在給予巧光素之后，可W檢測到運些細(xì)胞。
[0184] BSA胎牛血清白蛋白，來自牛血清的水溶性蛋白質(zhì)，其除了用于研究物質(zhì)結(jié)合至 蛋白質(zhì)，還用于所有類型的生物應(yīng)用中。
[01化]CR0合同研究組織
[0186] FACS巧光激活的細(xì)胞分選，一種可W測量單個細(xì)胞流動的巧光的技術(shù)。
[0187] FCS胎牛血清，來自提及的來源的血清，與作為包含細(xì)胞內(nèi)容物的BSA裂解物A流 體應(yīng)用相適應(yīng)的，所述細(xì)胞已經(jīng)被分解并且細(xì)胞的完整性和組織全部失去。
[0188] MALDI-T0F基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間是確定化學(xué)實體分子量的一種化學(xué) 分析技術(shù)。MALDI是一種"軟"電離技術(shù)，而TOF是一種特別適用于大(重)分子的檢測技術(shù)。
[0189] MRI磁共振成像，利用核磁共振原則的一種醫(yī)學(xué)成像技術(shù)。
[0190] MTS-測定法一種熱量測定法，其測量細(xì)胞的活力。所述信號越高，細(xì)胞的活力越 大。
[0191] MS0T多光譜光聲斷層成像技術(shù)，參見第3.2.段。
[0192] NIRF近紅外巧光
[0193] NMR核磁共振，一種物理現(xiàn)象，其中具有特殊性質(zhì)的（即是磁性的，具有自旋的）原 子可W吸收和重新發(fā)射具有特定波長的原子福射。
[0194] PDT光動力療法是一種使用無毒的光敏性化合物的光治療形式，所述光敏性化合 物被選擇性地暴露于光，于是它們變得對祀向的惡性細(xì)胞和其它病變細(xì)胞有毒。
[01巧]陽T正電子發(fā)射斷層掃描
[0196] PKPD藥代動力學(xué)和藥效學(xué)，研究物質(zhì)在生物體內(nèi)如何表現(xiàn)的(生物利用度、分布、 代謝），W及它如何與生物祀點相互作用(結(jié)合、停留時間）
[0197] SDS-PAGE十二烷基硫酸鋼聚丙締酷胺凝膠電泳是一種分離蛋白質(zhì)混合物為單獨 蛋白質(zhì)(或具有較少組分的混合物)的技術(shù)
[0198] SPECT單光子發(fā)射計算機斷層顯像是一種使用丫（gamma)射線的成像技術(shù)。它能 夠提供真實的3D信息。此信息通常呈現(xiàn)為貫穿患者的截面切片，但可W根據(jù)需要而自由的 重建或操縱。[維基百科]
[0199] TIMEL末端脫氧核巧酸轉(zhuǎn)移酶加 TP缺口末端標(biāo)記是一種通過標(biāo)記核酸的末端而 檢測DNA片段的方法[維基百科]。它被用作壞死組織的標(biāo)記工具。
【主權(quán)項】
1. 一種包括結(jié)合壞死細(xì)胞的靶向分子的系統(tǒng)，該靶向分子是細(xì)胞膜非通透的、未活化 的、能夠非共價地結(jié)合到細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)并且不顯著結(jié)合DNA的青色素， 其中該系統(tǒng)還包括一種或多種： (a) 選自成像化合物、治療性化合物、和釋放因子的試劑； (b) 有效用于傳遞試劑的載體;和 (c) 在體內(nèi)能夠與配對物相互作用的非反應(yīng)性分子。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的系統(tǒng)，其中所述靶向分子是根據(jù)圖1中1、11和III的非反應(yīng)性青色 素染料，其中η是整數(shù)，如n e [ 2，10 ]，優(yōu)選n e [ 4，8 ]，鏈L具有不超過n-1個雙鍵，優(yōu)選n/2個 雙鍵， 其中亞族II和III可以分別包括由曲線C表示的一個和兩個芳香環(huán)體系(A、B)， 其中A、B優(yōu)選各自獨立的選自苯和萘， 其中可以存在其它基團Rs、R6、R?和Rs、Rs、R6、R?和Rs是優(yōu)選各自獨立選自Η和烷基，如甲 基、乙基、和丙基，優(yōu)選甲基， 其中芳香環(huán)體系可以包括另外的官能團Ri、R2和/或取代基，Ri、R2是優(yōu)選各自獨立選自 H、磺酸基、和磺酰胺， 其中交替單鍵和雙鍵的鏈L可以被一個或多個部分的和完全的飽和的環(huán)結(jié)構(gòu)中斷，如 環(huán)戊烯和環(huán)己烯以及它們的組合，如一個或更多個環(huán)己烯環(huán)，其中所述飽和環(huán)結(jié)構(gòu)還可以 包括官能團 R9,其選自 H、AA 和 BB，其中R1()選自!1、303!1、(：1、，-0 = 0-(〇12)(1-￥3(9=1-6)，-(CH2) r-Y4 (r = 1 -6)，Y3 和Y4各自獨立的是Η、COOH、S03H和CN， 其中氮原子(N)還可以包括功能性N側(cè)基基團R3、R4，其中R3、R4優(yōu)選各自獨立的選自-(CH 2)mY，其中Y各自獨立地選自具有1-4個碳原子的羧酸，磺酸酯基、CN、C=C、和C = C，以及 它們的鹽， 其中，所述N側(cè)基基團包含m個碳原子，如me [1，10]，優(yōu)選me [2,8]，更優(yōu)選me [3,7]， 最優(yōu)選m=4、5、和6， 甚至更優(yōu)選至少一個m=4、5、和6;優(yōu)選一個m=6,而另一個m優(yōu)選是4、5或6， 其中所述N側(cè)基基團包含一個或多個在末端上與N相對的官能團，如具有1-4個碳原子 的羧酸，磺酸基，和它們的鹽，如鈉鹽和鉀鹽，最優(yōu)選在末端上的官能團包括一個或多個雙 C-C鍵，優(yōu)選是其羧酸鹽，和/或 其中所述靶向分子是中性的或帶負(fù)電荷的。3. 根據(jù)權(quán)利要求1和/或2的系統(tǒng)，其中所述靶向分子選自：HQ4、HQ5、HQ6、HQ7、ICG、CW 800、ZW800、L4、L7、Lll、CY3、CY3b、CY3.5、CY5、CY5.5、CY7、Dy 676、Dy 681、Dy 731、Dy 751 和Dy 776;并且、優(yōu)選選自 HQ4、HQ5、CW800和ZW800。4. 根據(jù)一個或多個前述權(quán)利要求的系統(tǒng)，其中所述試劑是： (a)選自下組的成像化合物:發(fā)光化合物、放射性示蹤劑、MRI造影劑或分光劑、PET劑、 RFA(射頻消融）劑、SPECT劑、超聲微泡或造影劑、光聲納米微粒或造影劑、CT造影劑、拉曼 劑，和它們的組合;和/或(b)選自下組的治療性化合物:化療劑、光動力學(xué)化合物、升溫化合 物(包括光熱劑）、免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白質(zhì)和多肽、核酸(RNA-或DNA-基）、藥物(如抗體），和它們 的組合;和/或(c)用于刺激組織再生的釋放因子，如生長因子和干細(xì)胞。5. 根據(jù)一個或多個前述權(quán)利要求的系統(tǒng)，其中所述載體選自下組：脂質(zhì)體、樹狀聚合 物、可生物降解的顆粒、膠束、納米微粒、聲解離性顆粒、pH解離性顆粒、光解離性顆粒、熱解 離性顆粒、螯合部分以及它們的組合。6. 根據(jù)一個或多個前述權(quán)利要求的系統(tǒng)，其中在體內(nèi)能與配對物相互作用的非反應(yīng)性 分子選自：第一點擊化學(xué)組分，互補于第一點擊化學(xué)組分的第二點擊化學(xué)組分，和自標(biāo)記蛋 白質(zhì)標(biāo)簽的組分，如Snap-Tag。7. 用作藥物的一個或多個前述權(quán)利要求的系統(tǒng)。8. -個或多個權(quán)利要求1-6的系統(tǒng)在診斷方法中的應(yīng)用，所述診斷方法例如MRI、 SPECT、PET、RFA(射頻消融）、CT、拉曼光譜、超聲、光學(xué)和光電聲。9. 用于治療涉及壞死性細(xì)胞死亡的疾病的一個或多個權(quán)利要求1-6的系統(tǒng)，所述疾病 包括梗塞或缺血性損傷，如心肌梗死、中風(fēng)、和腎，創(chuàng)傷，如在腦、肌肉、骨中的，感染或炎癥， 如感染性休克、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，和骨壞死，退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森氏癡呆 癥，斑塊，如動脈粥樣硬化，和淀粉樣蛋白，和糖尿病。10. 用于檢測和/或治療癌癥和/或涉及壞死性細(xì)胞死亡的疾病的劑量，所述劑量包含 有效量的一個或多個權(quán)利要求1 -6的系統(tǒng)。11. 根據(jù)權(quán)利要求10的劑量，包含0.1-1000納摩爾系統(tǒng)/kg體重的量和/或在1-50毫升 生理溶液中提供。12. -種用于在樣品中確定定位的方法，所述樣品包含含有壞死細(xì)胞的細(xì)胞群體，包 括： (a) 提供一個或多個權(quán)利要求1-6的系統(tǒng)； (b) 使用至少第一適宜的成像技術(shù)，在樣品上進行一個或多個測量，提供一個或多個 值，和； (c) 分析所述測量的一個值或多個值以確定定位，任選的通過與一組參考值進行比較。13. -種用于治療癌癥和/或涉及壞死性細(xì)胞死亡的疾病的方法，包括： (a) 給予一個或多個權(quán)利要求1-6的系統(tǒng)，其中所述組合物包含一種或多種治療性化合 物 (b) 在癌癥和/或壞死組織中確定組合物的定位 (c) 激活從載體中至少所述治療性化合物的釋放和/或激活所述治療性化合物。
【文檔編號】A61K49/00GK106029108SQ201480020279
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年2月6日
【發(fā)明人】M·馬靈, C·W·G·M·洛維克, E·R·范比克, X·邦文
【申請人】Hq醫(yī)藥(荷蘭)有限責(zé)任公司