專利名稱：鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的方法。
鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)對(duì)于驗(yàn)證可能導(dǎo)致生物體內(nèi)無(wú)法估計(jì)的作用的細(xì)胞—細(xì)胞相互作用是關(guān)鍵的。特別地，了解疾病特異性靶結(jié)構(gòu)是開(kāi)發(fā)有效的同時(shí)副作用很小的藥物的決定性必要條件。
現(xiàn)有技術(shù)已知免疫細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)表達(dá)特異組合的蛋白質(zhì)，也稱為蛋白質(zhì)組合模式，簡(jiǎn)稱PCP，其負(fù)責(zé)結(jié)合腦和肌肉組織中的血管的內(nèi)皮樣細(xì)胞。其他蛋白質(zhì)組合卻不導(dǎo)致與這種內(nèi)皮樣細(xì)胞的結(jié)合。令人驚奇地，這些特異的組合是個(gè)體間一致的，總是顯示相同的結(jié)合功能。其結(jié)果是，所述特異性蛋白質(zhì)組合模式似乎是細(xì)胞表面的個(gè)體間一致的淋巴細(xì)胞結(jié)合密碼，用于結(jié)合存在細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的器官特異性內(nèi)皮樣細(xì)胞表面。細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)因此可顯示相當(dāng)特異的蛋白質(zhì)組合模式。
浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞表面也顯示特異性蛋白質(zhì)組合模式，其將導(dǎo)致目的明確的即器官選擇性浸潤(rùn)行為。為此，這種蛋白質(zhì)組合模式組成了可能的藥物的靶結(jié)構(gòu)。
然而，開(kāi)發(fā)這種高選擇性藥物的一不可避免的必要條件是這種靶結(jié)構(gòu)的分子組成的知識(shí)。
現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了鑒別靶結(jié)構(gòu)的方法，其是基于分析疾病組織或細(xì)胞的基因表達(dá)模式，與健康組織或細(xì)胞的基因表達(dá)模式相比較，蛋白質(zhì)表達(dá)模式和信使核糖核酸(mRNA)均意在提供新蛋白質(zhì)的表觀、疾病組織或細(xì)胞中失控的或異常修飾的蛋白質(zhì)的信息(例如F.Lottspeich/H.Zorbas；Bioanalytik；Spektrum Analytischer Verlag；Heidelberg，1998)。
但是，這些方法均使用細(xì)胞勻漿物，其通?；趲浊€(gè)或幾百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，因?yàn)閮H能通過(guò)這樣大量的細(xì)胞才能產(chǎn)生上述的表達(dá)模式。在細(xì)胞勻漿物中，細(xì)胞以破碎的開(kāi)放形式存在，從而可通過(guò)生物化學(xué)方法進(jìn)行抽提和分離。
這些現(xiàn)有技術(shù)方法的一個(gè)缺點(diǎn)是它們不適合鑒別蛋白質(zhì)組合模式，因?yàn)檫@種蛋白質(zhì)組合模式中的各個(gè)蛋白質(zhì)組分由于產(chǎn)生細(xì)胞勻漿物和隨后的抽提步驟而完全分離，由此喪失了其細(xì)胞和組織拓?fù)鋵W(xué)位置的相關(guān)信息。另外，破壞細(xì)胞區(qū)室使得不能獲得這些細(xì)胞區(qū)室內(nèi)的蛋白質(zhì)組合及其相關(guān)拓?fù)鋵W(xué)相互關(guān)系的信息。
另外，現(xiàn)有技術(shù)方法另一缺點(diǎn)是它們不能在一個(gè)細(xì)胞水平進(jìn)行分析，從而不能指出各個(gè)細(xì)胞的不同方式的蛋白質(zhì)組合模式。再者，僅以少量存在的蛋白質(zhì)不能由現(xiàn)有技術(shù)方法檢測(cè)。這在例如僅存在于少數(shù)致病性疾病特異性細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或特異性蛋白質(zhì)組合的情況下尤其如此。
現(xiàn)有技術(shù)方法的另一缺點(diǎn)是制備組織或細(xì)胞的步驟從它們的取出或收集直至分離蛋白質(zhì)的步驟可能受到各種可變的外部影響，不能控制和標(biāo)準(zhǔn)化。
因此，本發(fā)明的目的在于提供能夠鑒別細(xì)胞特異性組合模式的方法，其克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)。
本發(fā)明目的通過(guò)鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的創(chuàng)造性方法而實(shí)現(xiàn)，該方法包括如下步驟(a)將包括至少一種標(biāo)記分子的試劑溶液Y1自動(dòng)沉積在含有來(lái)自細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜的物體X1上；(b)使試劑溶液Y1反應(yīng)，并自動(dòng)檢測(cè)用試劑溶液Y1標(biāo)記的物體X1的至少一種標(biāo)記模式；(c)在檢測(cè)該標(biāo)記模式之前或之后除去所述試劑溶液Y1，并用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，…，N)重復(fù)步驟(a)和(b)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標(biāo)記分子和/或至少另一種標(biāo)記分子；(d)組合步驟(b)中檢測(cè)的標(biāo)記模式以得到物體X1的復(fù)合分子組合模式；(e)用含有來(lái)自不同的細(xì)胞或組織樣品的其他細(xì)胞和/或其他細(xì)胞膜的至少另一種物體Xn(n＝2，3，…，N)重復(fù)步驟(a)至(d)；(f)確定物體X1和物體Xn的組合模式之間的至少一種差異；(g)鑒別其標(biāo)記模式導(dǎo)致步驟(f)中確定的差異的至少一種試劑溶液Y1或Yn；(h)選擇來(lái)自不同于步驟(f)確定的物體Xn的細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜的勻漿物的由至少步驟(g)鑒別的試劑溶液Y1或Yn的標(biāo)記分子結(jié)合的分子或分子復(fù)合物；以及(i)生物化學(xué)鑒定步驟(h)中選擇的分子或分子復(fù)合物。
本發(fā)明方法使得能對(duì)比性檢查來(lái)自不同細(xì)胞或組織樣品的各個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)組合模式，由此可鑒別這樣的標(biāo)記分子，其例如結(jié)合來(lái)自第一種組織或細(xì)胞樣品的第一個(gè)物體的特定蛋白質(zhì)組合模式或這種蛋白質(zhì)組合模式的特定區(qū)域，而同時(shí)不結(jié)合來(lái)自第二種組織或細(xì)胞樣品的第二個(gè)物體。通過(guò)這些鑒別的標(biāo)記分子，可以用第一種組織和/或細(xì)胞樣品的樣品部分檢測(cè)或選擇并隨后鑒定那些由所鑒別的標(biāo)記分子結(jié)合的蛋白質(zhì)組合模式的分子區(qū)域(分子或分子復(fù)合物)。這使得能檢測(cè)一種蛋白質(zhì)組合模式的分子組成，所述蛋白質(zhì)模式中的分子排列以及該蛋白質(zhì)組合模式在一種組織或細(xì)胞內(nèi)的排列。
根據(jù)本發(fā)明的一特別優(yōu)選的實(shí)施方案，在步驟(h)之前，步驟(h)所用的勻漿物通過(guò)分子或分子復(fù)合物分離方法、特別是蛋白質(zhì)分離方法分成各個(gè)勻漿物成分，這將特別有利于從勻漿物選擇分子或分子復(fù)合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案，物體X1含有來(lái)自患者的細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜，且至少一種其他的物體Xn含有來(lái)自健康測(cè)試者的細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜。這將使得能鑒別疾病特異性靶結(jié)構(gòu)或相應(yīng)蛋白質(zhì)組合模式，并且基于這些疾病特異性蛋白質(zhì)組合模式的知識(shí)，將能開(kāi)發(fā)高度特異性的藥物，這種藥物由于非常特異性因而幾乎無(wú)副作用。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方案，所述方法包括如下平行步驟(x)制備物體X1和Xn所用的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜所來(lái)自的每種所述細(xì)胞或組織樣品的每一樣品部分的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖，并將物體X1相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖與物體Xn相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖相比較，這種比較將顯示至少一種差異。
另外，本發(fā)明方法在步驟(x)之后可包括如下步驟(y)檢查導(dǎo)致步驟(x)中確定的差異的至少一種蛋白質(zhì)和/或至少一種蛋白質(zhì)修飾是否結(jié)合步驟(g)中鑒別的試劑溶液Y1或Yn的所述至少一種標(biāo)記分子。這將能夠確定通過(guò)比較蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖檢測(cè)的差異是否是與方法相關(guān)的假象(見(jiàn)上述)，或者它們是真正形成明顯差異，因?yàn)樗鼈冊(cè)诒景l(fā)明方法中也檢測(cè)到。本發(fā)明方法因此也可用作已知方法的一個(gè)重要補(bǔ)充。
根據(jù)本發(fā)明的另一特別優(yōu)選的實(shí)施方案，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子與導(dǎo)致步驟(x)確定的差異的至少一種蛋白質(zhì)和/或至少一種蛋白質(zhì)修飾結(jié)合。使用已知的方法，例如可開(kāi)發(fā)與通過(guò)比較蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖鑒別為靶結(jié)構(gòu)區(qū)域的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)修飾結(jié)合的抗體或配體。在本發(fā)明方法中使用這些抗體或配體將使得能檢查通過(guò)比較蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖確定的蛋白質(zhì)是否將產(chǎn)生蛋白質(zhì)組合模式。
另外，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子可以是熒光素綴合的，這種熒光素標(biāo)記將使標(biāo)記分子特別易于檢測(cè)。
另外，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子可以是抗體，該抗體可得自抗體文庫(kù)，該抗體文庫(kù)可以是原初型或非原初型。所謂的原初型抗體文庫(kù)是其抗體不顯示任何已知特異性的文庫(kù)，而非原初型抗體文庫(kù)的抗體將識(shí)別已知的分子如蛋白質(zhì)或糖蛋白。因此使用非原初型文庫(kù)將提供即時(shí)信息，如抗體的性質(zhì)及所述抗體與何種分子結(jié)合等。
另外，步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子可以是配體。該配體可得自配體文庫(kù)，該配體文庫(kù)可以是原初型或非原初型。術(shù)語(yǔ)“原初型”和“非原初型”的定義與上述類似。
在步驟(c)除去試劑溶液之后，可進(jìn)行一漂洗步驟，該步驟中將一種漂洗溶液沉積在物體X1上，一段時(shí)間后除去。這將防止新沉積的試劑溶液被先前施加的試劑溶液污染。
有利地，步驟(d)可通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助成象覆蓋圖進(jìn)行。
所述方法可包括隨機(jī)重復(fù)的漂白循環(huán)，特別是在步驟(b)之后。這種漂白循環(huán)將防止已被檢測(cè)的標(biāo)記在后續(xù)步驟中不再被檢測(cè)到。
本發(fā)明的詳細(xì)細(xì)節(jié)、特征和優(yōu)點(diǎn)將參照下述實(shí)施方案的描述而清楚。
在該實(shí)施方案中，組織或細(xì)胞樣品分成兩個(gè)樣品部分，第一個(gè)樣品部分作為起始材料產(chǎn)生勻漿物，用于根據(jù)已知方法生物化學(xué)鑒定蛋白質(zhì)。特別應(yīng)用如2D凝膠電泳的方法制備蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖。
第二個(gè)樣品部分用于制備組織切片或具有完整細(xì)胞的細(xì)胞制備物。當(dāng)?shù)诙€(gè)樣品部分是組織塊時(shí)，制備其組織切片。但是當(dāng)其是懸液中的細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞將以完整形式施加于一個(gè)表面，特別是玻片上。以此方式獲得的第一個(gè)物體進(jìn)行下述自動(dòng)化步驟1.取具有非原初型抗體文庫(kù)的一或多個(gè)熒光素綴合抗體的第一種試劑溶液Y1；2.將所述試劑溶液Y1加至第一個(gè)物體上；3.在特定溫度、特別是室溫將所述物體與這一溶液Y1保溫；4.去除所述試劑溶液；
5.向物體上一次或多次滴加漂洗溶液，隨后除去所述漂洗溶液；6.將一種緩沖溶液加至所述第一個(gè)物體上；7.檢測(cè)熒光分布圖，如果使用多種熒光素則用選擇性熒光記錄濾波器照相，在這一步驟中，確定樣品中的一個(gè)抗體/多個(gè)抗體是否顯示結(jié)合信號(hào)及在何處顯示結(jié)合信號(hào)，類似地?cái)?shù)字記錄第一個(gè)物體的細(xì)胞或組織的每一成象點(diǎn)或位點(diǎn)的陽(yáng)性和陰性信號(hào)；8.再次施加漂洗溶液；9.通過(guò)熒光激發(fā)漂白樣品，當(dāng)不再能檢測(cè)到熒光時(shí)終止漂白步驟；10.除去所述漂洗溶液；11.取具有不同或相同抗體文庫(kù)的一或多個(gè)類似地?zé)晒馑鼐Y合抗體的第二種試劑溶液Y2；12.將所述試劑溶液Y2加至第一個(gè)物體上。
通過(guò)重復(fù)步驟1-10而持續(xù)這一方法，所用試劑溶液Y3，Y4，Y5，…，Yn可含有非原初型或原初型文庫(kù)的抗體或配體。以此方式，可用完整的原初型文庫(kù)、完整的非原初型文庫(kù)或非原初型和原初型文庫(kù)混合體檢查一個(gè)相同物體。
每個(gè)方法循環(huán)(步驟1-10)通過(guò)記錄相應(yīng)相差成象或鑒別性干擾相差成象而終止。
基于步驟7中記錄的標(biāo)記模式，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助成象覆蓋圖確定存在的信號(hào)組合和不存在的信號(hào)組合，兩者一起給出組合模式。
針對(duì)第一個(gè)物體確定的這一組合模式與其他樣品或測(cè)試者、細(xì)胞狀態(tài)或疾病的其他組合模式進(jìn)行比較，所述其他組合模式通過(guò)用相同試劑溶液根據(jù)上述相同標(biāo)準(zhǔn)化步驟分析得到。
如果這一比較得到特異于所檢查樣品的獨(dú)特信號(hào)組合，或者如果得到特異于一種狀態(tài)、細(xì)胞類型、疾病或功能的信號(hào)組合，則這些信號(hào)組合基于特異的即選擇性分子相互作用，并因此鑒定了所述狀態(tài)、疾病、功能或細(xì)胞類型。隨后可將相應(yīng)抗體或配體與所檢測(cè)的信號(hào)組合結(jié)合。
以此方式濾出的抗體和/或配體隨后可用于“捕獲”第一個(gè)樣品部分中的能特異地結(jié)合這些配體或抗體的蛋白質(zhì)、糖蛋白或其他碳水化合物，為此，可使用已知的生物化學(xué)分析方法。如此發(fā)現(xiàn)的分子可以是單個(gè)的分子或不同分子的復(fù)合物，在每種情況下，它們均組成了高度特異的靶結(jié)構(gòu)，特別用于開(kāi)發(fā)藥物。
權(quán)利要求
1.一種用于鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的方法，所述方法包括如下步驟(a)將包括至少一種標(biāo)記分子的試劑溶液Y1自動(dòng)沉積在含有來(lái)自細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜的物體X1上；(b)使試劑溶液Y1反應(yīng)，并自動(dòng)檢測(cè)用試劑溶液Y1標(biāo)記的物體X1的至少一種標(biāo)記模式；(c)在檢測(cè)該標(biāo)記模式之前或之后除去所述試劑溶液Y1，并用其他試劑溶液Yn(n＝2，3，…，N)重復(fù)步驟(a)和(b)，每種試劑溶液均含有所述的至少一種標(biāo)記分子和/或至少另一種標(biāo)記分子；(d)組合步驟(b)中檢測(cè)的標(biāo)記模式以得到物體X1的復(fù)合分子組合模式；(e)用含有來(lái)自不同的細(xì)胞或組織樣品的其他細(xì)胞和/或其他細(xì)胞膜的至少另一種物體Xn(n＝2，3，…，N)重復(fù)步驟(a)至(d)；(f)確定物體X1和物體Xn的組合模式之間的至少一種差異；(g)鑒別其標(biāo)記模式導(dǎo)致步驟(f)中確定的差異的至少一種試劑溶液Y1或Yn；(h)選擇來(lái)自不同于步驟(f)確定的物體Xn的細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜的勻漿物中的由至少步驟(g)鑒別的試劑溶液Y1或Yn的標(biāo)記分子結(jié)合的分子或分子復(fù)合物；以及(i)生物化學(xué)鑒定步驟(h)中選擇的分子或分子復(fù)合物。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟(h)之前，步驟(h)所用的勻漿物通過(guò)分子或分子復(fù)合物分離方法、特別是蛋白質(zhì)分離方法分成各個(gè)勻漿物成分。
3.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述物體X1含有來(lái)自患者的細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜，且至少一種其他的物體Xn含有來(lái)自健康測(cè)試者的細(xì)胞或組織樣品的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜。
4.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述方法包括如下平行步驟(x)制備物體X1和Xn所用的細(xì)胞和/或細(xì)胞膜所來(lái)自的每種所述細(xì)胞或組織樣品的每一樣品部分的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖，并將物體X1相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖與物體Xn相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)分布圖相比較，這種比較將顯示至少一種差異。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述方法在步驟(x)之后包括如下步驟(y)檢查導(dǎo)致步驟(x)中確定的差異的至少一種蛋白質(zhì)和/或至少一種蛋白質(zhì)修飾是否結(jié)合步驟(g)中鑒別的試劑溶液Y1或Yn的至少一種標(biāo)記分子。
6.權(quán)利要求4的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子與導(dǎo)致步驟(x)檢測(cè)的差異的至少一種蛋白質(zhì)和/或至少一種蛋白質(zhì)修飾結(jié)合。
7.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子是熒光素綴合的。
8.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子是抗體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述抗體得自抗體文庫(kù)，該抗體文庫(kù)是原初型或非原初型。
10.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(a)和/或步驟(c)所用的至少一種標(biāo)記分子是配體。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述配體得自配體文庫(kù)，該配體文庫(kù)是原初型或非原初型。
12.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中在步驟(c)除去試劑溶液之后，進(jìn)行一漂洗步驟，該步驟中將一種漂洗溶液沉積在物體X1上，一段時(shí)間后除去。
13.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中步驟(d)通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助成象覆蓋圖進(jìn)行。
14.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述方法包括隨機(jī)重復(fù)的漂白循環(huán)，特別是在步驟(b)之后。
全文摘要
本發(fā)明涉及鑒別細(xì)胞特異性靶結(jié)構(gòu)的方法,特別是涉及鑒別細(xì)胞表面上的細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組合模式的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1334463SQ01109720
公開(kāi)日2002年2月6日 申請(qǐng)日期2001年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月24日
發(fā)明者瓦爾特·舒伯特 申請(qǐng)人:瓦爾特·舒伯特