本發(fā)明涉及醫(yī)藥診斷技術領域，更具體的是涉及一種新型的基于量子點的CA 15-3免疫層析試紙條的制備方法。

背景技術：

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升并有年輕化趨勢。最新調查顯示，乳腺癌已位居全球女性惡性腫瘤死亡率首位，嚴重威脅女性生命健康安全。女性乳腺癌發(fā)病率(粗率)全國合計為42.55/10萬，城市為51.91/10萬，農(nóng)村為23.12/10萬。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷，是提高療效的關鍵。因此研究乳腺癌早期診斷方法有重大意義。

血清糖類抗原(Carbohydrate antigen，CA)15-3是目前臨床上應用最廣泛的乳腺癌診斷和病情監(jiān)測指標，乳腺癌患者通常伴隨著該物質的血清含量升高，正常人血清中CA 15-3的含量尚不到28U/mL。因此CA 15-3血清水平是乳腺癌患者檢測的一項關鍵指標。對乳腺癌的早期診斷，術后監(jiān)測有重大作用。

免疫層析技術是將免疫標記技術與層析技術結合的一種新型檢測技術，它既有免疫標記的特異性又有層析技術快速、便捷等優(yōu)勢。其中膠體金免疫層析試紙條已廣泛地應用于免疫學、組織學、病理學和細胞生物學等領域。但膠體金作為標記物，抗原濃度低的樣本檢測條帶顏色太淺無法用肉眼識別，限制了其在檢測血清腫瘤標志物的應用。量子點(QDs)是一種半導體納米晶，它具有寬激發(fā)譜、窄發(fā)射譜、熒光效率高、光穩(wěn)定性好等優(yōu)點，是一種備受關注的新型熒光探針。用量子點取代傳統(tǒng)的膠體金作為標記物可以彌補膠體金標記的不足。所以本文擬研制基于量子點的CA 15-3免疫熒光試紙條，從而實現(xiàn)對乳腺癌腫瘤標志物進行快速、方便、靈敏檢測，建立乳腺癌檢測的新方法。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于腫瘤標志物在腫瘤檢測中的重要地位、量子點納米粒子獨特的光學性質以及層析技術簡便和價格方面的優(yōu)勢。我們將結合量子點和免疫層析試紙條兩種技術，利用量子點羧基和CA 15-3單克隆抗體(Ab1)的氨基反應，制得量子點熒光探針QDs@Ab1。探針、CA15-3和包埋在試紙條的另一種CA 15-3抗體(Ab1’)通過抗體抗原之間的作用，形成一種類似夾心的結構QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’。對CA 15-3——乳腺癌腫瘤標志物進行定性定量的檢測，建立腫瘤標志物檢測的新方法，致力于簡單迅速、價格低廉、定性定量、操作簡便的乳腺癌診斷方法。

本發(fā)明的技術方案如下：

基于量子點的CA 15-3免疫層析試紙條的制備方法；其步驟如下：

(1)將水溶性量子點與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽加入到反應器，然后向反應器中加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基，離心得到活化的量子點；

(2)將活化的量子點、CA 15-3單克隆抗體按照摩爾比為1:20～100比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉混合架上，室溫下反應2～3小時；

(3)反應結束后，采用離心分離進行純化，用PBS緩沖液清洗除去游離的抗體和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，得到熒光探針QDs@Ab1，然后將產(chǎn)物分散在含有1～5％牛血清白蛋白的PBS緩沖液中，4℃靜置過夜；

(4)將另一種CA 15-3抗體以及羊抗鼠IgG用PBS緩沖液稀釋到1～2mg/mL，用點樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線；

(5)將樣品墊，結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個墊和膜之間相互重疊1～3mm，完成試紙條的組裝。

所述量子點與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽質量分數(shù)比為1：4000～10000。

所述原料摩爾比量子點：CA 15-3單克隆抗體＝1：10～100。

所述樣品墊處理方法如下，樣品墊浸入含Tween-20 0.1％～2％的Tris-HCl緩沖液中靜置5-10min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述結合墊處理方法如下，結合墊浸入含BSA、親水聚合物、表面活性劑、蔗糖的PBS緩沖液的處理液中，靜置5～10min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

所述處理液配方如下：中BSA濃度為1％～4％，親水聚合物濃度為0.5％～5％，表面活性劑濃度為0.1％～2％，蔗糖濃度為1％～10％。

所述步驟1)中在旋轉混合架上活化量子點的羧基30min，離心得到活化的量子點；

本發(fā)明制備的新型基于量子點的CA 15-3免疫層析試紙條優(yōu)勢在于：

1.采用量子點這種具有優(yōu)異的光學性質，已經(jīng)被廣泛應用于示蹤、成像以及標記等方面的納米材料作為探針熒光來源，將納米技術應用到腫瘤檢測領域。

2.采用免疫層析技術作為檢測用的基材，免疫層析技術因其簡單迅速、價格低廉、可以隨時隨地等優(yōu)點在檢測領域處于特殊重要的地位。

3.采用量子點的羧基和抗體的氨基之間的反應形成的牢固的化學鍵，而非傳統(tǒng)的靜電吸附作用，提高了試紙條抵抗非特異性吸附的能力，量子點熒光強度和CA 15-3濃度之間正相關關系可同時實現(xiàn)定性和定量檢測，且靈敏度高，最低可檢測出0.16U/mL。

附圖說明

圖1：本發(fā)明制備的基于量子點的CA 15-3試紙條陰性樣品的檢測圖片。

圖2：本發(fā)明制備的基于量子點的CA 15-3試紙條陽性樣品的檢測圖片。

圖3：實施案例1制備的基于量子點的CA 15-3試紙條樣品定量檢測擬合曲線。

圖4：實施案例2制備的基于量子點的CA 15-3試紙條樣品定量檢測擬合曲線。

圖5：實施案例3制備的基于量子點的CA 15-3試紙條樣品定量檢測擬合曲線。

具體實施方式

下面的實施案例中將對本發(fā)明作進一步的闡述，但本發(fā)明不限于此。

具體步驟說明如下：

1.量子點偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點(QDs)與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)加入到反應器，然后向反應器中加入PBS緩沖液，在旋轉混合架上活化量子點的羧基30min，離心得到活化的量子點。

(2)將活化的量子點、CA 15-3單克隆抗體Ab1按照摩爾比為1:20～100比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉混合架上，室溫下反應2～3小時；

(3)反應結束后，采用離心分離進行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有1～5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過夜。

2.抗體的固定

將另一種CA 15-3抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到1～2mg/mL，用點樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時。

3.樣品墊、結合物釋放墊的預處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含Tween-20 0.1％～2％的Tris-HCl緩沖液中靜置5-10min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結合墊浸入含BSA、親水聚合物、表面活性劑、蔗糖的PBS緩沖液的處理液中，靜置5～10min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含BSA、親水聚合物、表面活性劑、蔗糖的PBS緩沖液的處理液稀釋5～20倍，均勻涂覆在上述已處理的結合物釋放墊上，靜置5～10min后于37℃恒溫干燥箱中干燥2～4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個墊和膜之間相互重疊1～3mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動切膜機將組裝好的試紙條進行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內密封儲存。

5.樣品的測試和結果判讀

(1)定性和半定量檢測：用于激發(fā)量子點的紫外燈波長范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當待測樣本中含有CA 15-3(CA 15-3)時，復合物將同時被T線和C線捕獲，紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測結果為陽性；反之，檢測樣本中不含CA 15-3時，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測結果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說明檢測無效。(如圖1，圖2所示)

(2)定量檢測：定量檢測時，配置一系列濃度梯度的CA 15-3標準液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，10～30min后用檢測儀讀取T線和C線的熒光強度，分別將T/C的熒光強度及對應的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強度與濃度對應的公式。

所述的制備方法，其特征在于所述量子點與1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)質量分數(shù)比為1：4000～10000。

所述的制備方法，其特征在于所述原料摩爾比量子點：CA 15-3單克隆抗體Ab1＝1：10～100。

所述的制備方法，其特征在于處理液配方中親水聚合物為PEG-4000，PVP-10000，PVP-40000的一種。

所述的制備方法，其特征在于處理液配方中表面活性劑為TritonX-100，Tween-20的一種。

所述的制備方法，其特征在于處理液配方中BSA濃度為1％～4％，親水聚合物濃度為0.5％～5％，表面活性劑濃度為0.1％～2％，蔗糖濃度為1％～10％。

實施案例1：

1.量子點偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液按照原料質量比為1:4000比例混合于磷酸緩沖液(PBS緩沖液)中，在旋轉混合架上活化量子點的羧基30min，離心得到活化的量子點。

(2)將活化的量子點、CA 15-3抗體Ab1按照摩爾比為1:20比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉混合架上，室溫下反應2小時；

(3)反應結束后，采用離心分離進行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過夜。

2.抗體的固定

將CA 15-3另一位點的抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到1mg/mL，用點樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2小時。

3.樣品墊、結合物釋放墊的預處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含0.1％Tween-20的Tris-HCl緩沖液中靜置5min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結合墊浸入含1％的BSA、0.5％的PEG-4000、0.1％的TritonX-100、1％的蔗糖的PBS緩沖液中，靜置5min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥2小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含1％的BSA、0.5％的PEG-4000、0.1％的TritonX-100、1％的蔗糖的PBS緩沖液稀釋5倍，均勻涂覆在上述已處理的結合物釋放墊上，靜置5min后于37℃恒溫干燥箱中干燥2小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個墊和膜之間相互重疊1mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動切膜機將組裝好的試紙條進行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內密封儲存。

5.樣品的測試和結果判讀

(1)定性和半定量檢測：用于激發(fā)量子點的紫外燈波長范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當待測樣本中含有CA 15-3時，復合物將同時被T線和C線捕獲，T線生成復合物QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’，C線生成復合物QDs@Ab1-Ab2。紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測結果為陽性；反之，檢測樣本中不含CA 15-3時，則只在C線位置 出現(xiàn)熒光條帶，檢測結果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說明檢測無效。條帶顏色越深說明待測樣本中含有的CA 15-3含量越高。

(2)定量檢測：配置一系列濃度梯度的CA 15-3標準液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，10min后用檢測儀讀取T線和C線的熒光強度，分別將T/C的熒光強度及對應的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強度與濃度對應的公式。擬合曲線見說明書附圖3。

實施案例2：

1.量子點偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液按照原料質量比為1:6000比例混合于磷酸緩沖液(PBS緩沖液)中，在旋轉混合架上活化量子點的羧基30min，離心得到活化的量子點。

(2)將活化的量子點、CA 15-3抗體Ab1按照摩爾比為1:60比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉混合架上，室溫下反應2.5小時；

(3)反應結束后，采用離心分離進行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過夜。

2.抗體的固定

將CA 15-3另一位點的抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到2mg/mL，用點樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥3小時。

3.樣品墊、結合物釋放墊的預處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含1％Tween-20的Tris-HCl緩沖液中靜置5min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥2小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結合墊浸入含2％的BSA、3％的PVP-10000、1％的Tween-20、7％的蔗糖的PBS緩沖液中，靜置5min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥3小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含2％的BSA、3％的PVP-10000、1％的Tween-20、7％的蔗糖的PBS緩沖液稀釋10倍，均勻涂覆在上述已處理的結合物釋放墊上，靜置5min后于37℃恒溫干燥箱中干燥3小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個墊和膜之間相互重疊2mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動切膜機將組裝好的試紙條進行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內密封儲存。

5.樣品的測試和結果判讀

(1)定性和半定量檢測：用于激發(fā)量子點的紫外燈波長范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當待測樣本中含有CA 15-3時，復合物將同時被T線和C線捕獲，T線生成復合物QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’，C線生成復合物QDs@Ab1-Ab2。紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測結果為陽性；反之，檢測樣本中不含CA 15-3時，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測結果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說明檢測無效。條帶顏色越深說明待測樣本中含有的CA 15-3含量越高。

(2)定量檢測：配置一系列濃度梯度的CA 15-3標準液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，20min后用檢測儀讀取T線和C線的熒光強度，分別將T/C的熒光強度及對應的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強度與濃度對應的公式。擬合曲線見說明書附圖4。

實施案例3：

1.量子點偶聯(lián)CA 15-3抗體(QDs@Ab1)

(1)將水溶性量子點、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)水溶液按照原料質量比為1:10000比例混合于磷酸緩沖液(PBS緩沖液)中，在旋轉混合架上活化量子點的羧基30min，離心得到活化的量子點。

(2)將活化的量子點、CA 15-3抗體Ab1按照摩爾比為1:100比例混合于PBS緩沖液中，將混合溶液置于旋轉混合架上，室溫下反應3小時；

(3)反應結束后，采用離心分離進行純化，用PBS緩沖液清洗三次以除去游離的抗體和EDC，得到熒光探針QDs@Ab1，最后將產(chǎn)物分散在含有5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液中，4℃靜置過夜。

2.抗體的固定

將CA 15-3另一位點的抗體(Ab1’)以及羊抗鼠IgG(二抗，Ab2)用PBS緩沖液稀釋到2mg/mL，用點樣儀噴于硝酸纖維素膜上以形成T線和C線，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥4小時。

3.樣品墊、結合物釋放墊的預處理以及熒光探針的固化

(1)將樣品墊浸入含2％Tween-20的Tris-HCl緩沖液中靜置10min，然后放入37℃恒溫干燥箱中干燥4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)結合墊浸入含4％的BSA、5％的PVP-40000、2％的Tween-20、10％的蔗糖的PBS緩沖液中，靜置10min，然后置于37℃恒溫干燥箱中干燥4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)將所得熒光探針QDs@Ab1用含4％的BSA、5％的PVP-40000、2％的Tween-20、10％的蔗糖的PBS緩沖液稀釋20倍，均勻涂覆在上述已處理的結合物釋放墊上，靜置10min后于37℃恒溫干燥箱中干燥4小時，封袋置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.試紙條的組裝

(1)將所得樣品墊，結合物釋放墊、硝酸纖維素膜、吸水墊按順序固定于單面塑膠板上，各個墊和膜之間相互重疊3mm，完成試紙條的組裝。

(2)用自動切膜機將組裝好的試紙條進行切割，寬度約為3mm，并將其裝入塑料板中，最后將其與干燥劑一起裝入鋁箔袋內密封儲存。

5.樣品的測試和結果判讀

(1)定性和半定量檢測：用于激發(fā)量子點的紫外燈波長范圍為320nm～420nm的普通紫外燈即可；根據(jù)夾心免疫的原理，當待測樣本中含有CA 15-3時，復合物將同時被T線和C線捕獲，T線生成復合物QDs@Ab1-CA 15-3-Ab1’，C線生成復合物QDs@Ab1-Ab2。紫外燈照射下出現(xiàn)兩條熒光條帶，檢測結果為陽性；反之，檢測樣本中不含CA 15-3時，則只在C線位置出現(xiàn)熒光條帶，檢測結果為陰性；如果T線和C線都不出熒光現(xiàn)條帶則說明檢測無效。條帶顏色越深說明待測樣本中含有的CA 15-3含量越高。

(2)定量檢測：配置一系列濃度梯度的CA 15-3標準液，如：15U/mL，50U/mL，100U/mL，250U/mL，500U/mL，取50uL滴加到免疫層析試紙條上，30min后用檢測儀讀取T線和C線的熒光強度，分別將T/C的熒光強度及對應的抗原濃度做擬合曲線，得到熒光強度與濃度對應的公式。擬合曲線見說明書附圖5。