一種hpv免疫膠體金診斷試紙條及其制備方法和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速、準(zhǔn)確的HPV免疫層析檢測試紙條及制備方法，目的之二是提供一種基于免疫層析技術(shù)的HPV檢測法，本發(fā)明首次將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于HPV抗原蛋白檢測，實(shí)現(xiàn)了高特異性、高靈敏的檢測性能。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的巴氏和HPV?DNA檢測相比，其發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要包括：檢測時間短（5~20分鐘）；不需要任何特殊儀器；操作簡便，只需一步反應(yīng)，操作人員無需培訓(xùn)，檢測成本低；對溫度無特殊需求，無須冷凍，儲存運(yùn)輸方便，室溫可保存24個月。
【專利說明】
一種HPV免疫膠體金診斷試紙條及其制備方法和檢測方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及免疫分析檢測領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種檢測HPV的免疫層析 檢測試紙的制備方法及應(yīng)用，一種應(yīng)用雙抗夾心法原理的膠體金免疫層析法。
【背景技術(shù)】
[0003] HPV感染與宮頸癌的關(guān)系最初在19世紀(jì)70年代提出，此后許多流行病學(xué)和分子學(xué) 研究均毫無疑問的證實(shí)了人乳頭瘤病毒與宮頸癌的病因?qū)W聯(lián)系。Bosch和Manos等通過收集 來自22個國家的宮頸癌活檢標(biāo)本作PCR檢測，發(fā)現(xiàn)99.7%的腫瘤中都可以檢測到人乳頭瘤病 毒DNA，而且各國間無顯著差異。這是迄今為止所報道人類腫瘤致病因素中的最高檢出百 分?jǐn)?shù)，同時表明人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌的相關(guān)具有普遍意義。
[0004] HPV感染是宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)和宮頸癌的明確病因。Mattheus等報道，在 99.7%的浸潤性宮頸癌中可以檢測到13種高危型HPV，來自世界各國的宮頸癌組織標(biāo)本的 研究發(fā)現(xiàn)，人乳頭瘤病毒16和18型感染率最高，在檢出的所有型別中，人乳頭瘤病毒16占 50%，人乳頭瘤病毒18占14%，人乳頭瘤病毒45占8%，人乳頭瘤病毒31占5%，其它型別的人乳 頭瘤病毒占23%。人乳頭瘤病毒的型別與宮頸癌的病理類型有關(guān)，在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌中 人乳頭瘤病毒16占主要地位(51%的鱗狀上皮細(xì)胞癌標(biāo)本），而在宮頸腺狀上皮細(xì)胞癌(56% 腺狀上皮細(xì)胞癌標(biāo)本)和宮頸腺鱗細(xì)胞癌(39%腺鱗細(xì)胞癌標(biāo)本）中人乳頭瘤病毒18占主要 地位。人乳頭瘤病毒16、18型感染很普遍，沒有明顯的地區(qū)差異，有些人乳頭瘤病毒型別有 地理位置的差異。我國人乳頭瘤病毒感染型別中52和58型檢出率較高。在臺灣進(jìn)行的一項(xiàng) 研究也表明，52和58型較常見。人乳頭瘤病毒45型在非洲西部宮頸癌組織中很常見，而人乳 頭瘤病毒39和59型僅在美洲的中部和南部宮頸癌組織中出現(xiàn)。
[0005] 宮頸癌與高危型HPV感染關(guān)系密切，其自然病程有一個從宮頸上皮不典型增生到 原位癌再到浸潤癌的一個連續(xù)發(fā)生、發(fā)展過程大約有10年的時間，所以做好癌前篩查是防 治宮頸癌的關(guān)鍵所在。高危型HPV感染可導(dǎo)致宮頸癌及宮頸癌前病變(CIN)，而持續(xù)性HPV感 染與CIN病變進(jìn)展的關(guān)系又甚為密切，故高危型HPV檢測對宮頸癌的早期篩查、防治及在預(yù) 測CIN的自然轉(zhuǎn)歸、治療后的隨診上都有重要的作用。目前采用的HPV檢測方法都有共同的 局限：費(fèi)時和操作程序復(fù)雜。
[0006] 病例-對照研究是檢驗(yàn)病因假說的一種分析流行病學(xué)方法。不論是在拉丁美洲采 用準(zhǔn)確性較低的檢測技術(shù)(FISH)進(jìn)行的大規(guī)模流行病學(xué)研究，還是采用較高靈敏度檢測技 術(shù)(PCR，HC-II)的研究，所有的結(jié)果均顯示人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌有明顯的相關(guān)性(0R =3.6-254.2)，尤其是人乳頭瘤病毒16型和18型。Mufioz等在哥倫比亞和西班牙（宮頸癌發(fā)病 率前者比后者高8倍)進(jìn)行的人群基礎(chǔ)上的病例-對照研究中，包括436例組織學(xué)確診的病例 和隨機(jī)抽取的387例來自病例所在人群的對照，同時采用了三種人乳頭瘤病毒DNA檢測技 術(shù)(ViraPap、SH和PCR)。這一研究避免了人群和地區(qū)的選擇性偏移，同時又考慮到檢測技 術(shù)間的差異，在調(diào)整了一些混雜因素后三種檢測方法都得出相同的結(jié)論:在兩個國家中人 乳頭瘤病毒16，18,31，33和35型與宮頸癌均呈強(qiáng)相關(guān)性，提示人乳頭瘤病毒與宮頸癌具有 病因關(guān)系。隊列研究是用來驗(yàn)證疾病病因假說另一種重要的分析流行病學(xué)方法，它能夠直 接體現(xiàn)人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌發(fā)生的時序性，更有力地驗(yàn)證病因假說。Campion對100 例輕度宮頸上皮內(nèi)病變(CIN I)隨訪了兩年多，56%的人乳頭瘤病毒16,18陽性者進(jìn)展為重 度宮頸上皮內(nèi)病變(CIN III)，而人乳頭瘤病毒6陽性的對象僅20%發(fā)生進(jìn)展。Murthy等用原 位雜交方法的研究顯示，63例宮頸不典型增生發(fā)展為原位癌，對組織標(biāo)本檢測人乳頭瘤病 毒16/18,陽性率為68.3%，而44例非進(jìn)展性不典型增生其陽性率為27.3%，相對危險度為5.9 (95%CI:2.5-14.1)，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。此外，在細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)方面也獲得了人 乳頭狀瘤病毒致癌的有力證據(jù)。1995年WHO和IARC已將人乳頭瘤病毒確定為是宮頸癌的病 因。
[0007] 文獻(xiàn)報道HPV檢測方法有兩種，巴氏涂片(Pap Smear)及HPV-DNA檢測技術(shù)。巴氏涂 片指宮頸脫落細(xì)胞涂片，是指從子宮頸部取少量的細(xì)胞樣品，放在玻璃片上，然后在顯微 鏡下研究是否異常。巴氏涂片雖然造價比較低，但靈敏度低，特異度不高，而且需要評估細(xì) 胞學(xué)片子的病理學(xué)家。
[0008] HPV-DNA檢測技術(shù)是取病變組織和局部組織粘液、分泌物通過PCR技術(shù)進(jìn)行HPV-DNA檢測，該技術(shù)具有高靈敏度，但特異度低，檢測費(fèi)用昂貴，且造成高昂的過度治療費(fèi)用。 [0009] 免疫層析法（Immunochromatography)是近幾年來興起的一種快速診斷技術(shù)，其原 理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)干燥的纖維素一 端浸入樣品（尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有 抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，型成肉眼可見的檢測帶?，F(xiàn) 有的免疫層析試紙條產(chǎn)品常用的示蹤標(biāo)記粒子有納米金、納米硒、彩色膠乳等等，其中納米 金應(yīng)用最為廣泛，納米金也稱為膠體金。
[0010] 以膠體金作為示蹤標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)特稱為免疫膠體金技術(shù) (Immunecolloidal gold technique，GICT)。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、 抗環(huán)血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一 種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)而得名。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán) 型成牢固結(jié)合，由于這種結(jié)合式靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋 白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其他生物大分子結(jié)合，如3?六、？撤、0)1^。根據(jù)膠體金的一些物 理性狀，如高電子密度、顆粒大小、型狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而 使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
[0011] 與現(xiàn)有技術(shù)巴氏涂片和HPV-DNA檢測相比，免疫層析法檢測的優(yōu)點(diǎn)主要包括： (1) 使用方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場使用，所有反應(yīng)能在20分鐘內(nèi)完成； (2) 成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備； (3) 應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測條件； (4) 可以進(jìn)行多項(xiàng)檢測，弱陽性樣本比較難獲得，多項(xiàng)檢測可以減省樣品，降低成本； (5) 標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo)記樣品在4 °C儲存兩年以上，無信號衰減現(xiàn)； (6) 膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色試劑，省卻了酶標(biāo)的致癌性底物及終止液的步 驟，對人體無毒害； 在自體免疫性疾病診斷方面，已出現(xiàn)較多的免疫層析試紙，但基于HPV檢測的免疫層析 試紙在國內(nèi)外市場上仍沒有問市。
[0012]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將免疫層析法應(yīng)用到 HPV的檢測中，通過把抗HPV抗體蛋白包被在結(jié)合墊或分析膜的檢測帶上，實(shí)現(xiàn)對樣品中HPV 的高特異、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的檢測，快速篩查HPV陽性標(biāo)本，為宮頸癌的篩查和治療提供 快速的輔助診斷。
[0014] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種快速、準(zhǔn)確的HPV免疫層析檢測試紙條及制備方 法，目的之二是提供一種基于免疫層析技術(shù)的HPV檢測法。
[0015] 作為本發(fā)明的一種HPV免疫層析檢測試紙條，包括樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水墊 和底板，分析膜上設(shè)置檢測帶和質(zhì)控帶，所述底板的上部貼合有分析膜，分析膜上部的兩端 分別貼合有結(jié)合墊和吸水墊，結(jié)合墊上部的一端貼合有樣品墊。
[0016] 所述的結(jié)合墊結(jié)合納米金標(biāo)記物，結(jié)合墊為一層。
[0017] 所述HPV免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟： 步驟1:結(jié)合墊(2)的制備 (1) 納米金標(biāo)記物的制備:用納米金溶液標(biāo)記HPV單克隆抗體 (2) 結(jié)合墊(2)的制備:玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，將步驟(1)制備的納米金標(biāo)記 物，用噴涂儀噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用。
[0018]步驟2.分析膜(3)制備 A.檢測帶T線(4)制備:根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇檢測帶T線包被抗體，如結(jié)合墊上 的結(jié)合蛋白含HPV單克隆抗體，檢測帶T線包被蛋白是抗人HPV IgG抗體。
[0019] B.質(zhì)控帶C線(5)制備:根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇質(zhì)控帶C線包被抗體，如結(jié)合 墊上的標(biāo)記蛋白是抗人HPV IgG抗體，質(zhì)控帶C線的標(biāo)記蛋白為對應(yīng)的抗人IgG抗體的抗體。
[0020] 步驟3.樣品墊制備 將玻璃纖維膜或聚脂膜經(jīng)處理液浸漬烘干備用，或者直接使用。
[0021] 步驟4.試紙條組裝 把步驟1~3所制做完成的材料，按圖1搭接，根據(jù)底版的規(guī)格切割成一定的長度和寬 度，安裝在底板和卡殼里。優(yōu)選地，試紙條長度為6 ? 5mm，寬度為3mm或4mm〇 [0022]所述的抗HPV的抗體是以HPV為免疫源，鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中 的一種或多種單克隆伉體或多克隆抗體。
[0023]所述的抗人IgG抗體的抗體是指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的抗體，比如該抗人 IgG抗體是鼠抗人IgG，它的抗體是羊抗鼠IgG的抗體或其他非鼠源的鼠IgG抗體。
[0024]在本發(fā)明的另一方面，提供一種HPV檢測方法，用本發(fā)明第一方面方法及步驟所制 備的HPV免疫層析試紙條，對待檢樣品進(jìn)行檢測，具體步驟： (1) 樣本處理:取血清、血漿或全血樣本； (2) 把上述處理過的樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5~20分鐘，觀察T線和C線； (3) 結(jié)果判讀:T線和C線均顯現(xiàn)，結(jié)果為陽性;T線不顯現(xiàn)，C線顯現(xiàn)，結(jié)果為陰性;T線和 C線均不顯現(xiàn)，提示試紙失效。
[0025] 本發(fā)明的檢測原理： 選用金標(biāo)標(biāo)記抗HPV抗體，噴涂在結(jié)合墊上，制呈結(jié)合墊;在檢測帶上包被能與標(biāo)記抗 體，目的物蛋白復(fù)合物發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體，當(dāng)把待檢樣本加樣到樣品墊上后，樣本中的 HPV蛋白與結(jié)合墊上的標(biāo)記抗體形成免疫復(fù)合物，由于毛細(xì)管效應(yīng)，該復(fù)合物向吸水墊方向 泳動，此復(fù)合物與包被與檢測帶T線上的抗體發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)抗HPV抗 體-HPV抗原蛋白-抗HPV抗體三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測在線，逐漸富集形成較深的紫 紅色條帶；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動向前，金標(biāo)標(biāo)記抗HPV抗體與包被在質(zhì)控線上的IgG多抗 發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶，多余的未結(jié) 合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線都出線條帶的判為陽性結(jié)果;若血 清樣品中不含有HPV，標(biāo)記抗體到達(dá)檢測線時，不與包被在檢測線上的相應(yīng)抗體發(fā)生免疫反 應(yīng)，因此在檢測線處沒有出現(xiàn)顯色帶，而金標(biāo)標(biāo)記HPV抗體繼續(xù)泳動向前與包被于質(zhì)控線處 的相應(yīng)包被IgG多抗發(fā)生特異的免疫反應(yīng)而被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成紫紅色條帶， 因此僅在質(zhì)控上出現(xiàn)條帶判為陰性結(jié)果。
[0026] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明首次將免疫層析技術(shù)應(yīng)用于HPV抗原蛋白檢測，實(shí)現(xiàn)了 高特異性、高靈敏的檢測性能。與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道的巴氏和HPV-DNA檢測相比，其發(fā)明的優(yōu)點(diǎn) 主要包括:檢測時間短(5~20分鐘）;不需要任何特殊儀器，；操作簡便，只需一步反應(yīng)，操作 人員無需培訓(xùn)，檢測成本低;對溫度無特殊需求，無須冷凍，儲存運(yùn)輸方便，室溫可保存24個 月。
【附圖說明】
[0027]圖1本發(fā)明的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖1。
[0028] 圖2為本發(fā)明檢測帶為1條時陽性和陰性結(jié)果示意圖。
[0029] 圖2中a是條帶示意圖;b為陽性結(jié)果;c為陰性結(jié)果;d和e表示試紙條失效。
[0030]
【具體實(shí)施方式】
[0031] 本發(fā)明所述的HPV檢測免疫層析試紙，如圖1所示，該試紙是在底板7上由一側(cè)向另 一側(cè)順次相互搭接地粘貼分析膜3、結(jié)合墊2、樣品墊1、吸水墊6。
[0032] 結(jié)合墊2上噴涂有金標(biāo)標(biāo)記蛋白，分析膜3上設(shè)置檢測帶4和質(zhì)控帶5,根據(jù)結(jié)合墊 上標(biāo)記蛋白的不同，選用相應(yīng)的檢測帶包被蛋白和質(zhì)控帶包被蛋白。優(yōu)選地，在結(jié)合墊上噴 涂的標(biāo)記蛋白為鼠抗人HPV抗體，則檢測帶上的包被蛋白為抗人HPV單克隆抗體，質(zhì)控帶上 的包被蛋白為抗鼠IgG多克隆抗體。
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0034]實(shí)施例1金標(biāo)試紙各組分制備： 1膠體金液制備：將〇 . 01%的HAuCl4溶液加熱至沸騰，迅速加入每100mL HAuCl4溶液加 入適量的還原劑溶液，顏色從藍(lán)色，然后淺藍(lán)、藍(lán)色，再加熱出現(xiàn)紅色，煮沸7~lOmin出現(xiàn)透 明的橙紅色。再用超濾或微孔濾膜(〇.45uM)過濾，以除去其中的聚合物和其它可能混入的 雜質(zhì)。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，液面出現(xiàn)油狀物和大量黑色顆 粒狀沉淀物雜質(zhì)時棄用。
[0035]其中所使用的還原劑可以為檸檬酸三鈉、鞣酸-檸檬酸三鈉、白磷，優(yōu)選使用檸檬 酸三鈉，更優(yōu)選地使用1%檸檬酸三鈉。其中所用的玻璃容器應(yīng)絕對清潔，用前需經(jīng)酸洗。其 水應(yīng)為去離子超純水。
[0036]膠體金溶液制備過程中，各溶液的配制方法如下:HAuC14的配制：用超純水溶解氯 金酸，配成1%溶液，置4°C備用，有效期三個月；lOOOmLl% HAuCl4溶液配方：10g HAuCl4、超純 水定容至lOOOmL; 1%梓檬酸三鈉（Sodium Citrate)的配制：用超純水溶解Sodium Citrate， 配成1 %溶液，0.22uM膜濾過，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0037]金標(biāo)蛋白制備:本發(fā)明待標(biāo)記金標(biāo)蛋白包括但不限于鼠抗人HPV IgG抗體、兔抗人 冊￥186抗體、羊抗人冊￥186抗體。用0.謂碳酸鈉調(diào)節(jié)膠體金?117.0~8.5，按每毫升膠體金 溶液緩慢加入5~25ug待標(biāo)記蛋白，混勻，靜置10~30min，然后加入BSA至終濃度0.5~1%，混 勾，靜置5~10min，3000rpm離心5min，去沉淀，將上層溶液轉(zhuǎn)至新管，9000rpm離心30min，去 上清，加入重懸液至原量，將溶液移至新管，9000rpm再次離心30min，加入用十分之一初始 體積的保存液將沉淀重懸，置4 °C備用。
[0038] 3分析膜制備：分析膜選擇：分析膜的材質(zhì)可選硝酸纖維素膜(NC)或醋酸纖維素 膜，商品化的硝酸纖維素膜包括3&54￡99、'\￥11&1：1]1&11811111、111；[111。0代]\1135、8&1'1:〇1'；[1130附40 等。使用哪種規(guī)格的具體NC膜或醋酸纖維素膜不是本發(fā)明的關(guān)鍵，但是在每次測定中，上述 幾種NC膜可以作為優(yōu)選。不同廠家使用的含不同表面活性劑的不同緩沖液處理的膜，與所 用檢測線抗體溶液親和力有不同程度的差距，也會很大程度造成線條不均勻，拖帶或是彌 散的現(xiàn)象，因此運(yùn)用組裝試紙來選擇優(yōu)選的NC膜。
[0039]分析膜制備：用包被緩沖液稀釋檢測待包被蛋白至0.5~1.5mg/mL濃度，用劃膜噴 金儀，距離結(jié)合墊lcm處，以0.5~1.5uL/cm噴涂于膜上，構(gòu)成檢測帶4，質(zhì)控帶5，檢測帶與質(zhì) 控帶距離約5mm，質(zhì)控帶同時距離吸水墊約1 cm。分析膜37 °C烘干，封裝備用。
[0040] 所使用的包被緩沖液可以是硼酸鹽、碳酸鹽、磷酸鹽、Tris-HCl或Tris-磷酸鹽等， 緩沖液的作用是提供一定pH和離子強(qiáng)度使蛋白牢固包被于NC膜，緩沖液pH值一般約為6~ 9.5范圍內(nèi)，優(yōu)選為6.5~7.5的中性緩沖范圍內(nèi)，且最優(yōu)選緩沖液的pH值為7.0~7.4范圍內(nèi)。 [0041 ] A分析膜1: 檢測帶T線:將鼠抗人HPV單克隆抗體與pH為7.2的10mM PB緩沖溶液混合配制成為濃度 為0.4mg/mL混合溶液，噴在硝酸纖維素膜上，涂布量為luL/cm。
[0042]質(zhì)控帶C線:將羊抗鼠IgG多克隆抗體與pH為7.5的10mM PB緩沖溶液混合配制成為 濃度為〇. 5mg/mL混合溶液，噴在硝酸纖維素膜上，涂布量為luL/cm。
[0043] B分析膜2 檢測帶T線:將兔抗人HPV單克隆抗體與pH為7.2的10mM碳酸鹽緩沖溶液混合配制成為 濃度為〇. 4mg/mL混合溶液，噴在硝酸纖維素膜上，涂布量為luL/cm。
[0044] 質(zhì)控帶C線：用pH為7.5的10mM碳酸鹽緩沖溶液配制羊抗兔IgG多克隆抗體，濃度為 0 ? 5mg/mL，噴在NC膜上，涂布量為luL/cm。
[0045] C分析膜3 檢測帶T線：用pH為7.2的10mM PB緩沖溶液配制羊抗人HPV單克隆抗體，濃度為0.4mg/ mL，噴在硝酸纖維素膜上，涂布量為1.2uL/cm。
[0046]質(zhì)控帶C線：用pH為7.5的lOmM TO緩沖溶液配制馬抗羊IgG多克隆抗體，濃度分別 為0.5mG/mL和0.6mG/mL，1:1混合，噴在硝酸纖維素膜上，涂布量為luL/cm。
[0047] 4結(jié)合墊的制備 結(jié)合墊的處理:結(jié)合墊材質(zhì)為玻璃纖維紙或聚酯膜，用配制好的結(jié)合墊處理液浸泡結(jié) 合墊，在37°C下lh烘干后，將抗體或者蛋白以4uL/cm的用量噴涂在預(yù)處理的聚酯膜上，37°C 干燥lh后得結(jié)合墊，結(jié)合墊置于2~8 °C的環(huán)境下備用;結(jié)合墊處理液的組成為:pH為7.0~9.0 的10mM TO緩沖溶液，含1%BSA，10~20%蔗糖，0.1% Tween-20。結(jié)合墊也可不做預(yù)處理，直接 使用，本次所用結(jié)合墊材質(zhì)為聚酯膜。
[0048] A結(jié)合墊1聚酯膜，單層，鼠抗人HPV單抗； B結(jié)合墊2聚酯膜，單層，兔抗人HPV單抗； C結(jié)合墊3聚酯膜，單層，羊抗人HPV單抗。
[0049] 5樣品塾的制備： 樣品墊材質(zhì)為玻璃纖維紙或聚酯膜，用配制好的樣品墊處理液浸泡樣品墊，在37°C下 lh烘干，樣品墊緩沖液的組成為:pH為7.0~9.0的10mM TO緩沖溶液，含1%BSA，10~20%蔗糖， 0.1%TWeen-20。樣品墊也可不做預(yù)處理，直接使用，此次所用樣品墊材質(zhì)為玻璃纖維素膜。
[0050] 實(shí)施例2膠體金標(biāo)記抗HPV抗體蛋白檢測試紙1~3制備 用裁切機(jī)將實(shí)施例1制備的并干燥的樣品墊、結(jié)合墊、分析膜、吸水紙分別剪切1.7cm、 0.8cm、2.5cm和1.5cm寬的窄條，按圖1方式搭接成大板，用切條機(jī)將大板切成單人份，每人 份寬度根據(jù)底板卡殼的不同而異，本發(fā)明優(yōu)選3_寬度。將單人份已切好的試紙組裝在備好 的試紙卡里，使加樣窗對應(yīng)試紙的樣品墊，結(jié)果顯示窗對應(yīng)檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，組裝時溫度控 制在25~37 °C，濕度20~30%。
[0051 ]金標(biāo)試紙條1~3的各組分如下表：
實(shí)施例3樣本處理 血清樣本:取全血1~5mL于血清米集管中，靜置30min~2h，3000~5000g離心5~10min，取 上清即得。根據(jù)試紙條的檢測精度，把樣本用加樣緩沖液稀釋〇~100倍，取50~100uL滴加到 試紙條的加樣孔中，靜置5~20min后觀察結(jié)果。
[0052] 血漿樣本：取全血1~5mL于枸櫞酸鈉或肝素鈉抗凝管中混勻，1000~3000g離心5~ lOmin，取上清即得到血漿樣本。根據(jù)試紙條的檢測精度，把樣本用加樣緩沖液稀釋0~100 倍，取50~100uL滴加到試紙條的加樣孔中，靜置5~20min后觀察結(jié)果。
[0053] 全血標(biāo)本:取指尖或耳垂新鮮血約50uL，滴加到加樣孔中，馬上用50uL加樣緩沖液 滴加到加樣孔中稀釋，靜置5~20min后觀察結(jié)果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種HPV免疫層析檢測試紙條，包括樣品墊（1)、結(jié)合墊(2)、分析膜(3)、吸水墊(6)、 底板(7)、檢測帶T線(4)和質(zhì)控帶C線(5)，所述底板(7)的上部貼合有分析膜(3)，所述分析 膜(3)上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊(2)和吸水墊(6)，結(jié)合墊(2)上部的一端貼合有樣品墊 (1)，所述檢測帶T線(4)和質(zhì)控帶C線（5)設(shè)置在分析膜(3)上，其特征在于:HPV IgG單克隆 抗體結(jié)合在結(jié)合墊(2)上或包被在檢測帶T線(4)上。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV免疫層析檢測試紙條，其特征在于:所述的結(jié)合墊(2)包被 膠體金標(biāo)記物或膠乳標(biāo)記物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的HPV免疫層析檢測試紙條，其特征在于:所述的結(jié)合墊(2)為一 層，且與分析膜搭接。4. 一種HPV免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟： 步驟1:結(jié)合墊(2)的制備： (1) 納米金標(biāo)記物的制備:用納米金溶液標(biāo)記HPV單克隆抗體； (2) 結(jié)合墊(2)的制備:玻璃纖維膜或聚脂膜作為結(jié)合墊，將步驟（1)制備的納米金標(biāo) 記物，用噴涂儀噴涂在預(yù)處理的玻璃纖維膜或聚脂膜上，干燥備用； 步驟2:分析膜(3)的制備： A、 檢測帶T線(4)制備:根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇檢測帶T線包被抗體，如結(jié)合墊上 的結(jié)合蛋白含HPV單克隆抗體，檢測帶T線包被蛋白是抗人HPV IgG抗體； B、 質(zhì)控帶C線(5)制備:根據(jù)結(jié)合墊標(biāo)記蛋白類型選擇質(zhì)控帶C線包被抗體，如結(jié)合墊上 的標(biāo)記蛋白是抗人HPV IgG抗體，質(zhì)控帶C線的標(biāo)記蛋白為對應(yīng)的抗人IgG抗體的抗體； 步驟3:樣品墊（1)制備：將玻璃纖維膜或聚脂膜經(jīng)處理液浸漬烘干備用；或者直接使 用； 步驟4:把步驟1~3所制作完成材料，根據(jù)底板的規(guī)格切割成一定的長度和寬度，安裝 在底板和卡殼里。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種HPV免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于:所述 的抗人IgG抗體為鼠源、兔源、羊源、馬源、駱駝源或豚鼠源中的一種或多種單克隆抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種HPV免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于:所述 的抗人IgG抗體的抗體是指能與該抗體形成免疫復(fù)合物的抗體。7. -種HPV免疫層析檢測方法，其特征在于：用根據(jù)權(quán)利要求1~3所述的免疫層析試紙 條對待檢樣品進(jìn)行檢測，具體步驟包括： (1) 樣本處理:取血清、血漿、或全血樣本，用加樣緩沖液稀釋1~100倍； (2) 把上述處理過的樣品滴加到試紙條的樣品墊上，靜置5~30分鐘，觀察T線和C線； (3) 結(jié)果判讀:T線和C線均顯現(xiàn)結(jié)果為陽性;T線不顯現(xiàn)，C線顯現(xiàn)，結(jié)果為陽性;T線和C 線均不顯現(xiàn)或其他現(xiàn)象，提示試紙失效。
【文檔編號】G01N33/569GK106053806SQ201610583623
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月23日 公開號201610583623.5, CN 106053806 A, CN 106053806A, CN 201610583623, CN-A-106053806, CN106053806 A, CN106053806A, CN201610583623, CN201610583623.5
【發(fā)明人】王峰, 王玉立, 包媛, 張建華
【申請人】蘇州東尼生物技術(shù)有限公司